マウスにおけるサイスチェフェニルエタノールグリコシドの抗うつ薬効果とメカニズムに関する研究
Dec 17, 2024
抽象的な：
この研究は、治療効果とメカニズムを調査することを目的としていますシスチャンフェニルエタノールグリコシド（CPHG）マウスの慢性予測不可能な軽度ストレス（CUM）によって誘発されるうつ病様行動について。マウスを、コントロールグループ、モデルグループ、高用量CPHGSグループ（700 mg/kg）、中用量CPHGSグループ（350 mg/kg）、低用量CPHGSグループ（175 mg/kg）、およびフルオキセチン群（15 mg/kg）にランダムに分割しました。 4週間の対応する薬物介入の後、神経行動検査が実施されました。酵素結合免疫吸着剤アッセイを使用して、血清中の神経伝達物質のレベル、および海馬組織の炎症性因子とメディエーターの含有量を検出しました。ヘマトキシリン - エオシンおよびニスル染色を使用して、海馬組織の病理学的変化を観察しました。免疫組織化学および免疫蛍光法を使用して、マウスの海馬組織における星状細胞とミクログリアの密度、ならびにToll様受容体4/核因子κB/NOD様受容体タンパク質3（TLR4/NF-κB/NLRP3）の発現レベルを分析しました。結果は、CPHGがマウスのうつ病様行動を改善し、甘い水の好みを高め、マウス血清中のセロトニンとドーパミンのレベルを大幅に高め、海馬の炎症性メディエーターと因子の発現を阻害することを示した。免疫組織化学分析により、CPHGは海馬の星状細胞の密度を増加させ、ミクログリアの活性化を減らし、NLRP3インフラマソーム関連タンパク質の発現を阻害することが示されました。免疫蛍光実験により、CPHGがインフラマソームの形成を減らすメカニズムは、海馬組織におけるTLR4/NF-κBシグナル伝達経路の活性化を減少させることになることを実証しました。要約すると、CPHGは重要な抗うつ薬効果を示します行動のような兼誘発性のうつ病、潜在的に神経伝達物質レベルの調節と神経炎症反応の阻害を通じて、うつ病の治療におけるその応用の実験的証拠を提供します。
キーワード：シスタンフェニルエタノールグリコシド;うつ;神経炎症反応;星状細胞; TLR4/NFκB/NLRP3経路
うつ病は、気分が低い、アンヘドニア、ゆっくりと思考、生理学的機能障害などの症状を特徴とする一般的で複雑な感情的精神障害です。重度の場合、自殺傾向が発生する可能性があります[1]。 「中国人住民の栄養と慢性疾患の状態に関する報告（2020年）」によると、私の国のうつ病の有病率は2.1％に達し、世界保健機関によって世界で最も高い障害率を持つ疾患の1つとしてリストされました[2]。うつ病の病因は非常に複雑であるため、特定のメカニズムはこれまで不明のままであり、その治療に大きな挑戦をもたらします。近年、国内および外国の学者は、うつ病が免疫炎症性活性化と密接に関連している可能性があることを発見しました。中枢神経系における炎症反応活性化の過程で、海馬炎症細胞の活性化はその特徴的な症状です。継続的に活性化された海馬炎症細胞は、複数の炎症性サイトカインの放出を誘発し、炎症性サイトカインの「カスケード効果」を形成し、それによってうつ病などの精神疾患の病因と病理学的プロセスに参加します[3]。現在、この疾患の治療は、主にフルオキセチン、ベンラファキシン、デュロキセチンなどの西洋医学に依存しています。しかし、臨床硬化症状、顕著な残留症状、高再発率、臓器機能障害を引き起こすのは容易な臨床応用[4]などの欠点があります。伝統的な漢方薬は、感情的疾患の治療におけるより多くの標的と副作用の少ない利点があり、うつ病とその合併症の治療に幅広いアプリケーションの見通しを持っています[5]。
Cistanche DeserticolaキスタンチのデザイトリコラYcmaおよび/またはシスタンチェトゥブロサ（シェンク）ワイトのリンの葉が付いた乾燥した肉質の茎であり、どちらもオロバンチェ科の植物です。それは良い食べ物と薬の製品です。現代の薬理学的研究により、Cistanche Destericicolaには神経保護効果があることが確認されています（アルツハイマー病、パーキンソン病などを阻害する可能性があります）。主にシスタン砂漠砂漠植物のフェニルエタノールグリコシドで構成される「サイスチェ総グリコシド」カプセルは、神経疾患の治療に広く使用されています[6]。フェニルエタノールグリコシド（CPHGS）は、サイスンチェ総グリコシドにおける重要な有効成分です。それらは、抗腫瘍、免疫調節、抗酸化物質などの複数の生物学的機能を持ち、適切なアプリケーションの見通しを示しています[7]。以前の研究では、CPHGSがモノアミンの影響を保護し、亜nigraのセラミド代謝経路と線条体のドーパミン（DA）の含有量を増加させることにより抑うつ症状を緩和できることが示されています[8]。また、脳内のモノアミン神経伝達物質のレベルを改善することにより、閉経周辺症候群のマウスの抑うつ様行動を調整することもできます[9]。しかし、慢性の予測不可能な軽度ストレス（CUMS）によるマウスうつ病モデルの治療におけるその使用に関する報告はありませんでした。その作用メカニズムはまだ解明されていません。以前の研究に基づいて、抗酸化ストレスにおけるCPHGSの現在の可能性と組み合わせて、神経炎症の調節、神経炎のアポトーシスの阻害と組み合わされて、この研究では、CPHGSの抗うつ剤効果と、TLR4/NF-κB/NLB/NLRP3 PathwwayのNLB/NLRP3 PathwwayのNLB/NLP3PP3パスの作用のメカニズムを研究するために、CUMS誘発マウスのうつ病モデルを使用しました。 CPHGSの抗うつ薬効果を調査し、臨床応用を拡大し、それを健康食品として開発および利用します。
1つの材料と方法
1.1材料と楽器
CPHGS抽出物（85％以上の抽出物中のフェニルエタノールグリコシド、40％以上のエキナコシド、16％以上のベルバスコシドを含む;バッチ数：20231221、Xinjiang Hotan Dichen Dichen Pharmaceutical Co.、Ltd.）;フルオキセチン塩酸カプセル（フルオキセチン、FLX）（バッチ番号：8533C、パテオンフランス製薬会社、フランス）; 5- Hydroxytryptamine（5- HT）、DA検出キット（バッチ番号：20240305、20240305、上海Future Industrial Co.、Ltd。）;誘導性一酸化窒素合成酵素（INOS）、シクロオキシゲナーゼ-2（シクロオキシゲナーゼ{-2、コックス{-2）、プロスタグランジンE2（プロスタグランジンE2、PGE2）、腫瘍壊死因子（腫瘍necRosis因子アルファイ症、Tnf菌菌菌菌腫） （Interleukin -1、il -1）、il -18（interleukin -18、il -18）、il -6（interleukin 6、il -6）、Interferon-（interferon-infn-fn-fn-fn-fn-fn-fn-fn-fn-fen-fn-fn-fn-fn-fn-fn-fn-fron-interon- {24}}）酵素結合免疫吸着剤アッセイキット（バッチ番号：ER050A332132、ER035PD09812、ER048H753146、ER10X6398452、ER051H648219、ER09X2865471、ER049H746823、ER049H746823、 Wuhan Elarite Biotechnology Co.、Ltd。）;イオン化されたカルシウム結合アダプター分子1（イオン化カルシウム結合アダプター分子1、IBA -1）モノクローナル抗体、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）モノクローナル抗体、NOD NOD NOD様受容体プロトン3（NLRP3）モノクローナル抗体（NLRP3） gr 3379124-30、gr 3285067-28、abcam、uk）; Toll様受容体4（TLR4）モノクローナル抗体、リン酸化核因子κBP65（リン核因子因子κBP65、P-NF-κBP65）モノクローナル抗体（Batch No. 10032512、00128965、Wuhan Sanying Biotechnology Co.、Ltd.、Ltd.）; 4％パラホルムアルデヒド、免疫蛍光染色キット（Batch No. 20240106、20240315、Shanghai Bio-Technology Co.、Ltd。）;ヘマトキシリンとエオシン（ヘキサ）エオシン、HE）染色キット、nissl染色キット（バッチ番号：20240401、20240402、liaoning meilun biology）;免疫組織化学ユニバーサルキット（バッチ番号：43731a、北京Zhongshan Jinqiao Biotechnology、Ltd。）。
me2 0 4e 1/10、000電子バランス（Mettler Toledo、USA）; Milli-Q Laboratory Pure Water System（メルク、ドイツ）; Spectramax ID3多機能マイクロプレートリーダー（Molecular Devices、USA）; Leicadm 2000蛍光直立顕微鏡（ライカ、ドイツ）; 63008オープンフィールド、63010の高架プラス迷路、63022強制水泳、DB001 Morris Water Maze、Smart 3.0動物行動ビデオ分析システム（Shenzhen Ruiwode Life Science Technology、Ltd。）。
60 SPF C57BL/6マウス、計量18-22 gは、Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co.、Ltd。から購入しました。
マウスはSPF環境に保管され、周囲温度は（21±2）程度に制御され、湿度は60％±10％に維持され、12時間の明暗サイクルが維持されました。マウスは食物と水に自由にアクセスでき、実験は1週間の適応摂食の後に始まりました。実験動物は、中国医学大学の実験動物センターに保管されていました。この研究におけるすべてのマウスの実験手順は、漢方薬大学の動物実験倫理委員会（SUCMDL20231015003）によって承認されています。
1.2実験方法
1.2.1グループ化、モデリング、薬物局
7-週前のSPF C57BL/6マウスの1週間の適応給餌の後、後続の実験の要件を満たす非弾性マウスは、砂糖水選好テストを通じてスクリーニングされ、コントロールグループ（CON）、モデルグループ（MOD）、高用量CPHGSグループ（CPHGS-H; 700 MG/KGSグループ）に分割されました。 （CPHGS-M; 350 mg/kg）、低用量CPHGSグループ（CPHGSL; 175 mg/kg）およびフルオキセチン群（FLX; 15 mg/kg）、各グループに10匹のマウスがあります。 CONを除いて、他のグループのマウスは4週間ストレスを受け始めました[10]。拘束（1時間）、揺れ（1時間）、テールサスペンション（1時間）、45-程度のケージチルト（24時間）、ウェットベッド（24時間）、空のケージ（24時間）、夜間照明（12時間）、41度温水水泳水泳水泳水泳、4度氷水上水泳、5分間、2分間の氷のクランピングを含む、合計10個のストレッサーが使用されました。 2つの刺激が毎日ランダムに選択され、2日間連続して同じ刺激は現れませんでした。 4週間のモデリングの後、CPHGS-H、CPHGS-M、およびCPHGS-Lマウスに、体重に応じてgavageによって対応するCPHGS用量を投与し、FLXマウスに強制剤（10 mg/kg）によってフルオキセチンを投与されました。マウスのCPHGS-MとFLXの投与量は、成人とマウス間の体表面積の同等係数に従って変換され、2倍の変動は低用量と高用量のCPHGSでした。 CONおよびMODマウスには、省略により等量の脱イオン水が投与されました。マウスを4週間1日1回gavedしました。ニューロベアヴァリオール検査は、8週目に実施されました。
1.2.2神経行動実験
1.2.2.1砂糖の水選好実験
スクロース選好検査（SPT）の前に、マウスを1つのケージに収容し、3日間砂糖に適応させる必要があります。初日には、24時間1％ショ糖水の2本のボトルが投与され、2日目には、1本の砂糖水と1本の脱イオン水を24時間投与しました。 3日目に、砂糖水と純粋な水の位置は24時間交換され、実験は24時間後に終了しました。 4日目に、マウスは断食され、24時間水を奪われました。 5日目には、砂糖水と純水の1本のボトルが計量後に与えられ、12時間後に位置が交換されました。 24時間後、2本のボトルが取り出されて再び計量され、砂糖の水消費率が計算されました（砂糖水消費率=砂糖水消費量/（砂糖水消費 +水消費）×100％）。
1.2.2.2オープンフィールドテスト
オープンフィールドテスト（OFT）は、50 cm×50 cm×50 cmのキューブオープンボックスで実施されました。ボックスの中心は、辺の長さが25 cmの正方形として定義されていました。マウスを箱の中央に置き、5分間適応させました。マウスの動きの軌跡は、最後の5分で分析されました。評価指標には、オープンフィールドのマウスの総移動距離、オープンフィールドの中心でのアクティビティ時間、およびそれらが中心に入った回数が含まれていました。 1.2.2.3テールサスペンションテストテールサスペンションテスト（TST）は、頭が地面から一定の距離に保持されるように、マウスを尾部で吊り下げることです。 6分以内のマウスの闘争が記録され、最後の4分間のマウスの不動の時間を分析しました。
1.2.2.4強制水泳テスト
強制水泳試験（FST）は、（25±2）程度の水で満たされた透明な円筒樽（直径15 cm×50 cm）にマウスを置くことで、水位は20 cmに達します。 6分以内に水中のマウスの苦労を記録し、最後の4分間のマウスの不動の時間を分析しました。
1.2.3サンプル収集
8週目の終わりに、マウスは、ペントバルビタールナトリウム（3％、10 ml/kg）の腹腔内注射により深く麻酔されました。麻酔後、麻酔状態は、ゆっくりした呼吸、筋肉の弛緩、および外科手術に対する反応がないことを観察することで確認されました。その後、マウスの血液を眼の除去により収集し、マウスを頸部脱臼により殺しました。心臓に生理食塩水で灌流され、脳がすぐに開かれ、無傷の脳が除去されました。事前に冷却された生理食塩水ですすいで、その半分を4％パラホルムアルデヒドで72時間固定しました。残りの半分の海馬組織を氷上で分離し、後で使用するために液体窒素に保存しました。マウス海馬組織サンプル10 mgを摂取し、事前に冷却された生理学的生理食塩水を1：9の質量体積比に加え、氷水浴で機械的に均質化します。均質化後、4 000 r/minで15分間遠心分離し（遠心半径4.5 cm）、検出のために上清を集めます。
1.2.4神経伝達物質指数の決定
適切な量のマウス血清と海馬組織ホモジネート上清を採取し、キット動作方法に従って5- HTおよびDA含有量の含有量を検出します。
1.2.5海馬組織生化学指数の決定
海馬組織ホモジネートの上清を取り、BCAキットを使用してタンパク質濃度を決定します。キットの指示によれば、炎症性メディエーター（INOS、COX -2およびPGE2）および炎症性因子（TNF、IL -1、IL -18、IL -6、Ifn-）、Ifn-は、Hocampalzimeの亜菌菌の存在性のあるbynatimeの決定にあります。マーカー、および各物質の含有量が計算され、データが記録され、統計的に分析されます。
1.2.6海馬組織の染色
72時間以上固定された脳全体組織サンプルを採取し、パラフィン切片を4μmの厚さで作成しました。キシレンで脱ワックスした後、サンプルを勾配エタノール（100％エタノールIおよびIIに5分間浸漬し、95％、90％、80％、70％エタノールで2分間浸漬）し、PBSで3回洗浄し、エオシンでエオシンで5分間染色し、タップ水で5分間洗浄し、ヘマトキシルを1匹のハイダイリンで洗浄します。酸エタノールは2秒間、水道水で10分間すすいだ。グラジエントエタノール（80％エタノール、2分間の80％エタノール、95％エタノール、2分間、エタノールIおよび100％エタノールIIをそれぞれ5分間）で脱水し、キシレンで透明化し、中性ガムで密閉し、風乾した。マウスの各グループにおける海馬組織細胞の形態学的変化は、顕微鏡下で観察されました。
1.2.7海馬組織のnissl染色
「1.2.5」の下で調製したパラフィン切片を脱線して水和した後、nissl染色溶液で10分間染色し、毎回蒸留水で2回洗浄し、勾配エタノール（80％エタノール、95％エタノール、2分間、エタノールIおよび100％エタノールII）、sea sea sea sea sea sea sea sea sea sea sea sea sea sea sea sea sea sea sea sea sea sea sea sea sea sea sea sea sea for grused空気乾燥。マウスの各グループにおける海馬組織細胞の形態学的変化は、顕微鏡下で観察されました。
1.2.8海馬組織の免疫組織化学
パラフィン包埋された海馬組織標本は、普遍的な免疫組織化学キットの指示に従って免疫組織化学（IHC）染色によって処理されました。脱ワックス、水分補給、抗原修復、ペルオキシダーゼブロッキング、およびブロッキング後、IBA -1（1：400）、GFAP（1：400）、LRP31：300）、およびCaspsae1（1：400）の一次抗体を追加し、4度で昼間延期しました。 DABの色の発達、核染色、脱水、密閉の後、IBA1、GFAP、NLRP3、およびカスペ-1の陽性発現が光学顕微鏡下で観察され、画像は画像Jで分析されました。
1.2.9海馬組織の免疫蛍光検出
パラフィン埋め込まれた海馬組織標本は、免疫蛍光キットの指示に従って免疫蛍光染色によって処理されました。 「1.2.5」の下で調製したパラフィン切片を脱線、水分補給、抗原修復、ブロックし、次にTLR4（1：400）およびP-NF-κBP65（1：200）の一次抗体を切片に加え、4度で一晩インキュベートしました。翌日、一次抗体を除去し、PBSで3回洗浄し、二次抗体（1：500）を加え、暗所で1時間インキュベートしました。 3回洗浄した後、セクションをDAPIを含む固定剤で密封しました。海馬組織領域の蛍光シグナルは蛍光顕微鏡で観察され、画像は画像Jで分析されました。
1.3データ処理
実験データは、統計ソフトウェアSPSS 26。0およびGraphPad Prism9。0を使用して統計的に分析されました。データは平均±標準偏差（x±S）として表され、分析は一元配置分散分析を使用して実行されました。 2つのグループ間の比較は、Dunnettのテストを使用して実行されました。 p<0.05 indicated that the difference was statistically significant.
