初期のCOVID-19回復期血清および不活化ワクチン血清における抗体に対するSARS-CoV-2オミクロンバリアント（B.1.1.529）RBDの結合能力の急激な低下

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概要

新しいSARS-CoV -2バリアントB.1.1.529は、WHOによってオミクロンと名付けられ、2021年11月26日にバリアントオブコンサーン（VOC）として分類されました。このバリアントには、スパイクの30の突然変異を含む、50を超える突然変異があるため、多くのVOCがCOVIDに及ぼす潜在的な影響に関する懸念-19。 ここでは、と同じ配列を持つ組換えRBDタンパク質を使用したELISAアッセイを介してSARS-CoV -2WIV04（系統B.1）、コーティング抗原としてのデルタ変異体およびオミクロン変異体、COVID-19回復性血清およびワクチン血清におけるRBDと抗体間の結合能力SinopharmWIBPは互いに比較されます。 結果は、オミクロン変異体が祖先株および不活化ワクチンによって誘導された抗体を回避する可能性があり、そのRBDの結合能力がデルタ変異体よりもはるかに大きく低下することを示した。

キーワード：SARS-CoV -2; オミクロン; 懸念される変異株; 抗体; 受容体結合ドメイン; 不活化ワクチン

Wenhao Zhou 1,2、†、Ping He 1,2、†、Junhua Li 1、†、Huan Liu 1,2、Mengjuan Shi 1,2、Junping Yu 1,2、*およびHongping Wei 1,2、*

1 CAS Key Laboratory of Special Pathogens and Biosafety、Center for Biosafety Mega-Science、Wuhan Institute of Virology、Chinese Academy of Sciences、Wuhan430071。

2中国科学アカデミー、北京100049、中国

1.はじめに

の新しい亜種SARS-CoV -22021年11月に報告されたオミクロン（B.1.1.529）は、2021年11月24日に監視下にある変異体（VUM）として識別され、2日後にWHOによって懸念変異株（VOC）として指定されましたが、デルタ変異体は対象のバリアント（VOI：2021年4月4日）からVOC（2021年5月11日）までの1か月。 2021年12月21日の時点で、オミクロンの亜種は6つのWHO地域すべての106か国で報告されています。 2021年12月17日にWHOが示したように、オミクロンはデルタよりも速く広がる可能性があると推定されました。オミクロンは、デルタ変異体の15-残留変異と比較して、スパイクタンパク質に30-以上の残留変異があります[ 1]、これが透過性の向上の理由である可能性があります[2]。 承認されたワクチンの種類は、SARS-CoV -2[3,4]。 しかし、SARS-CoV -2また、VOCの出現により、現在のワクチンによって生成された抗体は、変異体に対する中和能力を失う可能性があります[5–7]。 したがって、さまざまな変異体に対する現在のワクチンの能力を評価することが重要です[8,9]。

ワクチンの有効性を評価するためのゴールドスタンダードは、プラーク減少中和試験（PRNT）などの生ウイルス培養に基づいて免疫化血清の中和力価を決定することです。 ただし、PRNTにはバイオセーフティーレベル-3の実験室が必要であり、実行には費用と時間がかかります。 新たに出現した変異体に対する血清の中和活性を迅速に推定するために、宿主細胞に結合するウイルスの受容体結合ドメインであるRBDタンパク質に基づくアッセイを使用して、中和活性をある程度推定することができます[10]。 。

ここでは、SARS-CoV -2 WIV04（系統B.1）と同じ配列を持つ組換えRBDタンパク質、コーティング抗原としてのデルタ変異体およびオミクロン変異体、RBD間の結合能力を使用したELISAアッセイを通じてまた、Sinopharm WIBPによって生成された不活化ワクチンを2回接種した後の、COVID-19回復性血清とワクチン接種血清の抗体を比較します。 結果は、両方のタイプの血清の抗体がオミクロンRBDへの結合能力を低下させたが、B.1 RBDと比較してデルタRBDへの結合のわずかな減少は、不活化ワクチンを逃れるオミクロン変異体のはるかに高い能力を示していることを示したデルタ型よりも以前に回復した人々に感染すること。

2。材料と方法

2.1。 サンプル

Sinopharm WIBP（Wuhan Institute of Biological Products Co.、Wuhan、China）が製造した不活化ワクチンの2回目の投与後、約3週間で11人の健康なボランティアから11個のワクチン血清サンプルを収集しました。 SARS-CoV -2系統B.1に感染した回復期の患者の17の血清サンプルが、中和試験のために2020年2月から5月の間に収集されました。 すべての血清は使用するまで-80℃で保存されました。 この研究は、中国科学アカデミーの武漢ウイルス研究所の倫理委員会によって承認されました（番号WIVH17202102）。

2.2。 プラーク減少中和試験（PRNT）

7つの不活化ワクチン誘発血清と17の回復期血清を含む合計24の血清サンプルを使用して、PRNTによる中和活性とELISAによって測定された血清中の抗体に対するRBDの結合能力との関係を評価しました。 PRNTは以前のレポート[11]と同じですが、わずかな変更があります。 簡単に説明すると、Vero E6細胞は、1 0パーセントのウシ胎児血清（FBS; Biological Industries、0 4–001–1ACS、Cromwell、CT、USA）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で培養されました。 100 U/mLのペニシリン-ストレプトマイシン。 細胞を12-ウェルプレートに播種し、単層を形成するまで5％CO2で37°Cでインキュベートしました。 約300プラーク形成単位（PFU）の力価を持つSARS-CoV -2 WIV04溶液を、各血清サンプルの4つの希釈液（20、80、320、および1280倍）と混合し、37°で1時間インキュベートしました。 C。 これに続いて、混合物を、VeroE6細胞単層を含む12-ウェルプレートに個別に移した。 37°Cで1時間5％CO2でインキュベートした後、混合物をウェルから取り出し、ウェルに2％FBSと0.9％メチルセルロースを含むDMEMを重ね、37°C​​で5％CO2で4時間インキュベートしました。日々。 次に、各ウェルに1 mLの8％ホルムアルデヒドを添加し、20分間インキュベートして固定を行いました。 最後に、プレートを0.5パーセントのクリスタルバイオレットで染色しました。 PRNT50（ウイルスプラーク数の50％以上の減少）を使用して、GraphPadPrism7ソフトウェアを使用した非線形回帰によって適合されたEC50に従って得られた中和力価を示しました。

2.3。 酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）

SARS-CoV -2 B.1株の3つの組換えRBDタンパク質（SARS-CoV -2スパイクタンパク質の残基319–537）および変異体B.1.1.529（オミクロン、残基319–537 G339D、S371L、S373P、S372F、K417N、N44 0 K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H）およびB.1.617.2（デルタ、残基319 L452RおよびT478Kの変異を持つ–537）（Acro Biosystems、北京、中国）をELISAアッセイに利用しました。 簡単に説明すると、ELISAプレート（Jet Biofifil、広州、中国）を、組換えRBDタンパク質（5ug / mL）を含む100 µL /ウェルの炭酸緩衝液（pH =96）でコーティングし、4℃でインキュベートしました。 一晩C。 その後、プレートを0.05％Tween 20（PBST）を含むPBSで3回洗浄し、PBST中の5％スキムミルクパウダー（Oxoid、Altrincham、UK）の330μL/ウェルで37度で2時間ブロックし、3回洗浄しました。 PBSTで数回。 血清を最初に1∶20および180希釈でPBSTで希釈し、コーティングされたウェルに添加しました（ウェルあたり100μL）。 プレートを37℃で1時間インキュベートし、次にPBSTで完全に洗浄した。 最後に、PBST（100μL/ウェル）で1∶10、000に希釈したヒトIgG（Biodragon Immunotechnologies、Suzhou、China）に対する西洋ワサビペルオキシダーゼ-（HRP）標識ウサギ抗体をペートに加え、インキュベートしました。 PBSTで1時間洗浄した後、プレートに100μL/ウェルの3,3,5、5-テトラメチルベンジジン（TMB）（Tiangen Biotech、北京、中国）を加え、10分間インキュベートしました。室温で。 反応を2MH、SOで停止させた後、マイクロプレートリーダー（INFINITE 200 PRO、TECAN、マンレドルフ、スイス）を使用して450nmで光学密度（OD）を測定しました。 分析は、GraphPadPrism7ソフトウェアを使用して実行されました。

3.結果

3.1。 ELISAによって測定されたRBD結合能力と血清の中和との対応する関係SARS-CoV-2B.1に対する7つのワクチン接種血清と17の回復血清のPRNT50値（ウイルスプラーク減少50％での中和力価）コーティングされた抗原としてSARS-CoV-2B.1のRBDを使用して血清希釈率1:20でELISAによって測定された、対応するOD450nmを表S1に示しました。 対応する結果を図1に示しました。

図1A、Bに示すように、ワクチン接種血清と回復期血清の両方で、PRNT50値は一般にOD450 nm値と相関しており、OD450 nm値が高いほど、PRNT50値が高い、つまり中和活性が高いことにほぼ対応していることを示しています。 ピアソン相関分析（図2C、Dに示す）を通じて、回復期グループとワクチン接種グループの両方で、PRNT50値と血清を含むRBDのOD450nmとの間に強い相関関係が明らかになりました。 したがって、ELISA法によってOD450 nmの変化を測定することは、血清の中和活性の変化を評価するための迅速な指標を提供する可能性があります。 オミクロン変異体は私たちの研究室では利用できなかったため、ELISA法を使用して、オミクロンが自然感染やワクチン接種によって誘発された抗体を逃れる可能性があるかどうかを評価しました。

3.2。 SARS-CoV -2 B.1、デルタバリアントおよびオミクロンバリアントからワクチン接種血清および回復期血清へのRBDの結合能力

ワクチン接種および回復期の血清のOD450nmと抗体陰性対照血清のS/N比を使用して、血清中の抗体に対するRBDの結合能力を発現させた。 Sは抗体陽性血清のOD450nmであるシグナルを意味し、Nは抗体陰性血清のOD450nmであるノイズを意味します。 11個のワクチン接種された血清の結果を図2A、Bに示しました。両方の希釈（1:20および1:80）で、ワクチン接種された血清中の抗体は、デルタ変異体への結合のわずかな減少（20パーセント未満）を示しました。表S2にリストされているように、B.1のそれと比較して、オミクロン変異体への結合の急激な減少（50パーセント以上）。 同様の結果（図2C、D）は、以前のB.1株の回復期の血清でも観察されました（表S3）。

4.ディスカッション

この研究では、SARS-CoV -2オミクロン変異体が不活化ワクチンおよび初期変異体の自然感染によって誘発された抗体を逃れる能力を、コーティング抗原として対応するRBDを使用するELISA法によって評価しました。 ELISA法は、PRNTなどの細胞培養に基づく従来の中和アッセイと同等ではありませんが、OD450 nm値は一般に血清のPRNT50と相関しており（図1）、これは以前のいくつかの報告でも観察されています[10]。宿主細胞上のACE-2を認識できるSARS-CoV-2スパイクタンパク質のRBDが宿主細胞への主要な受容体結合ドメインであることが証明され、ワクチンの設計に使用されたため[12,13]。 ただし、血清中の抗体の中和活性を推定するためにRBD結合機能を使用することにはいくつかの制限があります。 RBDからのその他のフラグメントは、ウイルスを中和する可能性があります[14]。 さらに、RBDの外側（NCBIの参照配列番号NC _045512。2の系統B.1と比較してOmicronのRBDには15の変異が含まれています）、Omicronバリアントには15の変異があり、いくつかの欠失または挿入部位があります。これは、ネイティブRBDのコンフォメーションに影響を与える可能性があります。

図1と表S1に示すように、PRNT50と対応するOD450 nm値の間に良好な相関関係を示さなかった2つの血清サンプル（Vac3とConv10）がありました。 オミクロン変異体はスパイクタンパク質に合計30の変異があり、変異の半分は祖先変異体B.1と比較してRBDで発生しましたが、デルタ変異体には8つの変異があり、そのうち2つはRBDに存在します[ 15]。 図2の結果は、RBDに2つの変異しかないデルタ変異体では、ワクチン接種血清と回復期血清の両方に対するRBDの結合能力が限定的に低下することを明らかにしました。これは、最近のいくつかの研究と一致しています[16,17]。 。 しかし、オミクロンは、祖先の変異体と不活化ワクチンによって誘発された抗体を効率的に回避し、RBDの結合能力を急激に低下させます。

オミクロンは急速に支配的になりつつあり、デルタ変異体に取って代わりつつあります。 現在の結果は、免疫力を長期的に高めるために、祖先または初期の変異型スパイクではなく、オミクロンスパイクを使用してブースターを開発する必要があることを示している可能性があります。 これは、不活化ワクチンに弱く反応する傾向がある高齢者や免疫不全患者に適切な免疫反応を誘導する場合に特に重要です。 結論として、初期の結果は、オミクロンが先祖の変異体と不活化ワクチンによって誘導された抗体を効率的に回避し、デルタ変異体よりもはるかに大きなRBDの結合能力を50％以上低下させる可能性があることを示しました。

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