正常メラストーマからのポリフェノールの抗炎症および抗チロシナーゼ活性の構造的特徴づけと評価パート2
Mar 27, 2022
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化合物3は、HRESIMSデータによって決定されるように、化合物2と同じ分子式を持っていました。 3と2のNMRデータを比較すると（表2）、2のガロイル-C-4のメトキシル基が3のガロイル-C-3'にシフトしていることがわかりました。これはHMBCの相関関係によって確認されました。 （図2）3のメトキシルプロトン（8y 3.88）と芳香族プロトン（bH7.24）のガロイル-C -3'（6c 149.1）、およびメトキシル基の化学シフト、ガロイル-C { {24}}、galloyl-C -4、およびgalloyl-C -3'は、それぞれbc60.8、151.5、141.3、および146.5から2tobc56.7、146.6、140.7、および149.1in3にシフトしました。 CDスペクトルの237nmでのコットン効果と262nmでの負の効果は、3のHHDPグループの（S）配置を示しました[24]。 糖部分の配置は、グルコシル部分のアノマープロトンの結合定数（=8。5 Hz）から推定されました。 1 M HClによる3の酸加水分解により、D-グルコースが生成されました。これは、TLCおよびGC分析によって確認されました。 したがって、化合物3は1-O-ガロイル-6-O-（3-メトキシガロイル）-2、3- O-（S）-ヘキサヒドロキシジフェノイル{{ 66}}D-グルコース。
4の分子式は、そのHRESIMSスペクトル（m / z 783.1032、[MH]-）からC35H28O21として推定されました。 その分子量は3の分子量より16質量単位少なく、これは4のバニロイル-C -5'にヒドロキシルが存在せず、芳香族プロトン（6H6.87）が存在するためと考えられます（表2）。 。 これは、1,2、4-三置換芳香族部分（μ7.60（dd、J=8。3,1.8Hz）、6.87（d、J =8）の存在から確認されました。 .3 Hz）、および7.57（d、J=1。8Hz））およびδc145.8in3でのガロイル-C-5'のバニロイル-C-5への化学シフト変化'at bc 115.9 in4。HMBCスペクトル（図2）のバニロイル-C -3'とのメトキシルプロトン（6H 3.90）および芳香族プロトン（H 6.87）の相関により、芳香族プロトン（H 6.87）がさらに確認されました。バニロイル-C-5'。 HHDPのアトロプ異性は、それぞれ239nmと263nmでの正と負のコットン効果の出現によってS配置であることが示されました[24]。 4のアノマープロトンの結合定数は、-アノマー配置を連想させる8.5Hzでした。 酸加水分解により、4は3と同じ糖単位を持っていることが明らかになりました。したがって、化合物4は1-O-ガロイル-6-O-バニロイル-2、3-O-として同定されました。 （S）-ヘキサヒドロキシジフェノイル- -D-グルコース。
2.2。 抗炎症活性アッセイ
Four new compounds 1-4 were tested for potential anti-inflammatory activity by measuring the inhibition of nitric oxide (NO) production. Unfortunately, none of them displayed significantly anti-inflammatory activity. The IC5o values for the inhibition of NO production by compounds 1-4 are all>50uM。 既知のフラボノールであるケンペロール（7）[26 [、ケルセチン（10）[27lおよびミリセチン-3- O - - L-ラムノピラノシド（12）28には抗炎症作用がありますが、ケンペロール-3-ラムノシド（8）[26]およびケルセチン-3- O - - L-ラムノシド（11）[29]には抗炎症作用がありません。 実験結果と文献データから、タイトル植物のフラボノイドはエラジタンニンよりも優れた抗炎症活性を持っており、この植物の抗炎症効果に対応する有効成分である可能性があります。
2.3。 チロシナーゼ阻害活性アッセイ
すべての化合物は、潜在的なチロシナーゼ阻害活性について調査されました。 表3に示すように、新しい化合物2-4は中程度のチロシナーゼ阻害活性を示しました。 新しい化合物1は弱いチロシナーゼ阻害活性を示した。 ケルセチン（10）[30]は有意なチロシナーゼ阻害活性を持ち、その抗チロシナーゼ活性はケルセチン-3- OwL-ラムノシド（11）[26]およびケンペロール（7）[26]よりも優れています。文献データで。 これは、フラボノールのB環の3'-および4/-ヒドロキシ基とC環の3-ヒドロキシ基がそれらの活性に重要であることを示しています。 ケンペロール（7）[26]の抗チロシナーゼ活性はケンペロール-3-ラムノシド（8）[26]よりも優れており、化合物8および12 [31]には有意な抗チロシナーゼ活性がなく、上記をさらに裏付けています。構造活性相関。
3.実験3.1。材料
M.normaleのルーツは、2018年9月に広西チワン族自治区桂林市雁山町から収集され、Yusong Huang教授（広西植物学研究所）によって認証されました。 バウチャー標本（20180912）は、中国の広西植物学研究所の機能性植物化学物質研究および利用の広西キー研究所に寄託されました。
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3.2。 一般的な実験手順
旋光度は、ADP44 0と旋光計（λ589nm、光路長1。0 cm）を使用して測定しました。 NMRスペクトルは、Bruker Advance 5 0 0分光計（Bruker Biospin AG、スイス、フェランデン）で取得し、残留溶媒ピークを参照として使用しました。 結合定数と化学シフトは、それぞれHzとδ（ppm）スケールで示されました。 ESIMSおよびHIRESIMSデータは、それぞれBRUKER HCT質量分析計およびLCMS-IT-TOF分光計（島津製作所、京都、日本）で記録されました。 GCは、0.32mmid×25mL-Chirasil-Valカラムを備えたAgilent7890ON（Agilent Technologies、Inc. Chandler、AZ、USA）システムで実行されました。 分析用HPLCは、島津LC -2030 C HPLC（島津製作所、京都、日本）システムで、4.6id×250 mm Agilent Eclipse XDB-C18（5 um）カラムを使用して実行しました。 セミ分取HPLCは、島津LC -20 AT HPLCシステムで、20.0id×250 mm Dr. Maisch reprosil 100 C18（5 um）カラムを4 mL/minの流速で使用して実施しました。 カラムクロマトグラフィー（CC）は、Sephadex LH -20（25-100μm; GE Healthcare Bio-Science AB、Uppsala、Sweden）、シリカゲルカラム（200-300メッシュ、Qingdao Marine Chemical Co. Ltd.、Qingdao、China）、MCIゲルCHP 20P（75-150 um; Mitsubishi Chemical Co.、Tokyo、Japan）、およびChromatorex ODS（50 um、Merck、ダルムシュタット、ドイツ）カラム。
3.3。 抽出と分離
M. normaleの風乾した粉末状の根（1 0 kg）を、8 {{2 0}}パーセントのアセトン水溶液（3×7日）で室温で抽出し、各抽出物をろ過しました。 濾液を減圧下で乾燥させて、粗抽出物（0。6kg）を得た。 抽出物をH2O（1 L）に懸濁し、石油エーテル（3 x 2L）、EtOAc（3 x 2 L）で連続的に分配しました。EtOAc抽出物（8 {{4 0}} g）を10個の画分に分けました（ Fr。1-10）CH2Cl-MeOH（100：0,95：5,90：10,80：20、70の勾配で溶出するシリカゲルCC（8id×2 0 cm）による：30,50：50,0：100、v / v）。 Fr.4（32 g）をMCIゲルカラム（6i.d.×20 cm）にロードし、MeOH-H、O（0∶ 100-100∶0、v /ø）の勾配で溶出しました。 18個のサブフラクション（Fr 4-1-4-18）を生成します。サブフラクションFr 4-14（3.0g）の分離は、CH2Cl {{48 }} MeOH（97：3-80：20、o / v）およびSephadex LH-20をCH2Cl2-MeOH（1：1、v / o）で溶出し、7（11.3 mg ）、8（10.6 mg）、9（9.3 mg）、10（20.6 mg）、11（7.6 mg）、および12（6.2 mg）。 Fr 6（4.2 g）をODS C18カラムにアプライし、MeOH-H2O（20：80-80：20）で溶出して、9つのサブフラクション（Fr 6-1-6-9）を得た。 セファデックスLH-20CC（MeOH-H2O、10：90-100：0で溶出）を使用してサブフラクションFr 6-4（1.2 g）をさらに分離すると、化合物1（9.6 mg）、5（それぞれ7.2mg）、6（7.3mg）。 化合物2（tR 130.5 min、5.2mg）、3（tR 146.8min、9.6 mg）、および4（tR 177.2min、15.3mg）は、Fr7（2.5g）から、MeOH-H2O（ 20：80-40：60、/ u、0-250分）。
3.4。分光データ
ウイスキータンニンC（1）：茶色の無定形粉末; [] -12 .6度（c=0 .16、MeOH）; UV（MeOH）λmaxnm（log e）∶2 0 3（2.02）、276（1.19）; CD（MeOH）λmax（△e）263（-7。8）、240（10.9）、225（2.9）.1Hand 13C NMRデータ、表1を参照; HRESIMSm / z：[MH] {{24} } .1240（C4sH33O 27-の計算値、1005.1215）。 1- O-（4-メトキシガロイル）-6- O-ガロイル-2、3- O-（S）-ヘキサヒドロキシジフェノイル- - D-グルコース（ 2）：茶色の無定形粉末無定形粉末; 【】5-5。5度（c =0。17、MeOH）; UV（MeOH）入最大nm（log e）∶203（2.52）、275（2.01）; CD（MeOH）λmax（△8）264（-8。0）、238（30.6）、218（1.3）.'Hおよび13C-NMRデータ。表2を参照。 HRESIMS m / z：799.0983 [MH]-（C3sH2O 22-の計算値、799.099）。
{{0}}O-ガロイル-6-O-（3-メトキシガロイル）-2、3- O-（S）-ヘキサヒドロキシジフェノール-6- D-グルコース（3）; 茶色の無定形粉末;【】7-33。5度（c =0。12、MeOH）; UV（MeOH）インマックスnm（log e）∶203（2.40）、273（1.68）; CD（MeOH）λmax（△e）262（-3。1）、237（11.1）、210（-2。7）。'Hand13CNMRデータ、表2を参照; HRESIMSm / z：799.1006 [MH]-（C35H2O 22-、799.0999の計算値）。 1- O-ガロイル-6-O-バニロイル-2、3- O-（S）-ヘキサヒドロキシジフェノイル- - D-グルコース（4）：茶色の無定形粉末。 【】7-20。6度（c =0。15、MeOH）; UV（MeOH）λmaxnm（log e）∶203（2.42）、278（1。86）; CD（MeOH）λmax（△e）263（-12。1）、239（42.5）、219（0.9）.'Hおよび13CNMRデータ、表2を参照; HRESIMS m / z：783.1032 [MH]- （C35H27O 21-、783.1050の計算値）。
3.5。 2-4の酸加水分解
化合物2（2 mg）を1 M HCl（5 mL）で8 0度で4時間処理した後、酢酸エチル（3 x 5 mL）で抽出しました。 水相をN2の流れの下で乾燥させて中性残留物を生成し、溶媒系としてEtOAc-ピリジン-EtOH-H、O（7：1：1：2）を含むTLC（SiO2）を使用して分析しました。 中性残基のR値は本物のD-グルコースのR値と同じであり、2の糖成分がグルコースであることを示しています。 中性残留物および5mgのL-システインメチルエステル塩酸塩を3mLの無水ピリジンに連続して溶解し、80度で1時間温めた。 減圧下での蒸発により溶媒を除去した後、反応混合物を続いて０．６ｍＬのＮ－トリメチルシリルイミダゾールと８０度で１時間反応させた。 反応混合物をｎ－ヘキサンおよびＨ、Ｏで分配し、次にｎ－ヘキサン層をＧＣ装置によって分析した。 インジェクターと検出器の温度は、それぞれ250度と280度に設定されました。 最初のカラム温度は160度で1分間保持され、次に5度/分で280℃に上昇し、10分間保持されました。 本物のD-グルコースと本物のL-グルコースを同じ方法でシリル化して分析し、それらの保持時間はそれぞれ19.09分と19.25分でした。 GC分析の結果は、2の糖成分がD-グルコース（t 19.1分）であることを示しました。 3と4の糖成分は同じ手順を使用して決定されました。
3.6。 抗炎症作用
3.6.1.LPSで刺激されたRAW264.7細胞によるNO産生
RAW 264.7細胞は、10％FBSを添加したDMEMで、37度で5％CO2の加湿雰囲気下で24時間培養しました。 24-ウェルプレート（5×104細胞/ウェル）の細胞を200 ng /mLLPSと試験化合物で処理しました。 22時間後、培地を収集し、Griess Reagent System（Promega、Madison、WI、USA）を使用して亜硝酸塩のレベルを測定しました。
3.6.2。 細胞生存率
RAW264.7細胞株の試験サンプルの細胞毒性を測定するためにMTTアッセイを実施しました。 対数増殖期にあった細胞を96-ウェルプレートに5×10プラス-6×10*細胞/ウェルの密度で播種し、37度で5％COで24時間インキュベートしました。 h。 次に、細胞を様々な濃度の試験サンプルを含む100μLの培地で24時間処理した。 培地を廃棄し、MTT（1 mg / mL）を含む100uLのFBSフリー培地を各ウェルに添加しました。 インキュベーターで4時間インキュベートした後、上清を捨て、100μLのDMSOを各ウェルに加えてホルマザンを溶解しました。 マイクロプレートリーダーを使用して、570nmで吸光度を測定した。
3.7。 抗Ty/ロシナーゼ活性
分離株の抗チロシナーゼ活性は、青木らによって記載された手順に従って調査された。 わずかな変更を加えた[21]。 L-ドーパとコウジ酸をそれぞれ基質と陽性対照として使用しました。 L-DOPAの5。0mM溶液、マッシュルームチロシナーゼ100 U / mL、およびさまざまな濃度のサンプルをリン酸緩衝液（pH6.8）で調製しました。サンプル溶液20μLおよび10μLのキノコチロシナーゼ溶液を混合し、37度で10分間プレインキュベートした後、40μLのL-DOPA溶液を加え、37度で5分間インキュベートしました。 抗チロシナーゼ活性実験の反応系を表4に示します。Spark10Mマルチモードマイクロプレートリーダー（Tecan Trading AG、スイス、チューリッヒ）を使用して、475nmで吸光度を測定しました。 すべてのアッセイを3回繰り返し、毎回3回繰り返しました。 チロシナーゼ活性の阻害率は、次の式を使用して計算されました。
ここで、Tはサンプルとチロシナーゼの吸光度を表します。 チロシナーゼを含まないサンプルの吸光度を表すため。 Cはチロシナーゼを含むがサンプルを含まない吸光度を表します。 Coは、チロシナーゼとサンプルを含まない吸光度を表します。
4.結論
この研究は、私たちの以前の研究[20]に基づいて、M.normaleの根からのポリフェノールのより多くの抗炎症および酵素阻害活性を調査することを目的としています。 予想通り、タイル工場から初めて12種類のポリフェノールが得られ、化合物1-4は新しいエラギタンニンでした。 エラギタンニンの単離と構造同定の成功は、抗炎症薬と酵素阻害剤のスクリーニングのための材料を提供し、M.normaleの開発と利用にも貢献します。 エラギタンニン1-4には、有意なチロシナーゼ阻害活性と抗炎症活性がないため、潜在的な抗炎症薬または酵素阻害剤である可能性は低くなります。 幸いなことに、それらは抗肥満などの新しい効果を持っています[6,7]。 フラボノイドは、M。normaleの根にあるエラギタンニンよりも優れた抗炎症および阻害酵素活性を持っており、抗炎症および抗酵素阻害剤である可能性が高くなります。 構造活性相関の研究は、新しい抗炎症薬と酵素阻害剤を見つけるのに役立ちます。
この記事は、Molecules 2021、26、3913から抽出されています。https：//doi.org/10.3390/molecules26133913 https://www.mdpi.com/journal/molecules
