SIRT 5-関連する脱スクシニル化修飾は、ミトコンドリアの質の監視の調節を通じて損傷した心不全および高グルコース促進心筋細胞に対するケルセチン誘発性の保護に寄与するパート1
Mar 18, 2022
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心筋線維化は、糖尿病に関連する主要な病理学的変化を表します心筋症および心不全、およびそれは、心臓の拡張期および収縮期の機能障害を伴う心筋コンプライアンスの低下につながる。 さまざまな薬用植物の有効成分であるケルセチンは、心血管疾患に対して治療効果を発揮します。 ここでは、ミトコンドリアの質の監視のための関連する治療薬を探索しながら、SIRT5-およびIDH2-関連の脱スクシンブレーションが心不全の心筋線維化の根本的なメカニズムに関与しているかどうかを調査します。 横大動脈狭窄（TAC）によって確立された心筋線維化および心不全のマウスモデルに、ケルセチン（50 mg / kg）を4週間毎日投与しました。 HL -1細胞をケルセチンで前処理し、in vitroで高グルコース（30 mM）で処理しました。 心機能、ウエスタンブロッティング、定量的PCR、酵素免疫測定法、および免疫蛍光分析を使用して、ミトコンドリアの質の監視、酸化ストレス、および心筋細胞の炎症反応を分析しましたが、IDH2スクシニル化レベルは免疫沈降を使用して検出しました。 心筋線維化と心不全の発生率は、TAC後に増加し、心臓駆出機能が異常でした。 高グルコース処理後、HL -1細胞活性が阻害され、活性酸素種の過剰産生とミトコンドリア呼吸複合体I/II活性およびミトコンドリアの阻害を引き起こしました。酸化防止剤 エンザイム活動、ならびに酸化ストレスと炎症反応の増加、ミトコンドリアの質の監視と恒常性の不均衡、およびアポトーシスの増加。 ケルセチンは、ミトコンドリアのエネルギー代謝を増加させ、ミトコンドリアの融合/分裂とミトコンドリアの生合成を調節することにより、心筋線維症を抑制し、心機能を改善し、炎症反応と酸化ストレス損傷を抑制しました。 さらに、TACはミトコンドリアレベルでSIRT5の発現を抑制し、IDH2のスクシニル化を増加させました。 ただし、ケルセチンはSIRT5の発現を増加させることによってIDH2の脱スクシニル化を促進しました。 さらに、si-SIRT5による治療は、細胞生存率に対するケルセチンの保護効果を無効にしました。 したがって、ケルセチンは、SIRT5を介してIDH2の脱スクシニル化を促進し、ミトコンドリアを維持する可能性があります恒常性、マウスを保護する心筋細胞炎症性条件下で、心筋線維化を改善し、それによって心不全の発生率を減らします。
1.はじめに
心不全は、さまざまな器質的または機能的な心臓病による心室充満または排出機能障害につながる状態であり、さまざまな心血管疾患、特に糖尿病性心筋症に関連する疾患の末期を表します。 したがって、心不全は、臨床診療において「糖尿病性心血管疾患の最後の戦場」と呼ばれています[1]。 過去数十年の間に、ほとんどの研究は、糖尿病性心筋傷害の維持、心臓の血行動態、および膵島システムの調節に焦点を合わせてきました。 心不全の患者の糖尿病は、冠状動脈性心臓病、高血圧、または糖尿病のない患者よりもかなり早く発生することが示されています。 心筋線維化は、酸化ストレス、炎症反応、ミトコンドリアエネルギー代謝障害、細胞の老化などの要因に対して脆弱です[2]。 心室リモデリングの主な原因として[3]、心筋線維症は心筋コンプライアンスの低下と心臓の収縮および拡張機能の障害を促進する可能性があります。 最終的に、長期的なボリュームまたは圧力の過負荷は心不全につながる可能性があります。 したがって、糖尿病性心筋症から心不全への進行は、重度の心筋線維化または心肥大を伴います[4,5]。 このように、心筋線維化を改善することは、心不全を遅らせ、心機能を改善することが示されており、糖尿病性心筋症および心不全を治療するための新しいアプローチとなっています[6]。
細胞のエネルギー代謝センターであるミトコンドリアは、心臓の高エネルギー需要を満たすために酸化的リン酸化によってエネルギーを生成します[7,8]。 心筋収縮や細胞内恒常性の維持など、心臓で発生する多くの重要な生理学的活動には、ATPが必要です[9-11]。 ミトコンドリアには、ミトコンドリアの分裂、融合、生合成、およびマイトファジーを調節することによって構造とエネルギー代謝を維持および回復する独自の品質管理システムがあります[12、13]。 この監視システムは、ミトコンドリアと心筋細胞をストレス刺激から保護することができます[8,13]。 さらに、糖尿病性心筋症による心筋障害は、ミトコンドリアの質の監視の不均衡によって引き起こされるミトコンドリアの機能障害に関連している可能性があります。
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したがって、正常な心臓の生理学的機能には、無傷で完全に機能するミトコンドリアが必要です。 確かに、ミトコンドリアの活性酸素種（ROS）の過剰な産生または心筋の抗酸化システムへの損傷は、心室肥大および壁のリモデリングに関連しており、心筋線維化および心不全につながる可能性があります。 研究により、心不全と糖尿病性心筋症を合併した真性糖尿病患者の心筋ミトコンドリアの形態と構造に異常があることが明らかになりました。 さらに、ミトコンドリア膜の損傷と構造異常が心不全のイヌモデルで報告されています。 ミトコンドリア膜電位の低下、ミトコンドリア透過性遷移孔（mPTP）の異常な開口、ATP合成の低下、および過剰なROS産生も検出されています[14、15]。 したがって、ミトコンドリアの質量と恒常性を標的とすることによってミトコンドリアの質の監視を行うことは、酸化ストレスと炎症反応を抑制し、それによって線維症を改善するのに役立つかもしれません[16]。 酸化ストレスと炎症反応は、心筋線維化を誘発する重要な要因であり、さまざまな心血管疾患の同じ病変部位に共存することがよくあります[16、17]。 急性または慢性の心筋傷害を伴うさまざまな心血管合併症または代謝性心筋症が発生すると、免疫系が活性化され、酸化ストレス傷害を誘発し、心筋線維芽細胞を活性化し、異常なコラーゲン代謝、心筋細胞壊死、および組織を引き起こす多数の炎症性因子を放出します変性、したがって最終的には心筋線維症と心不全につながります[18、19]。 Sirtuin 5（SIRT5）は、核、細胞質、ミトコンドリアに広く分布しています。 SIRT5はデアセチラーゼ活性を示しますが、リジンのスクシニル化を調節することができます[20]。 そのN末端ペルオキシソーム局在化シグナルPTS2を介して、SIRT5はペルオキシソームに入り、細胞内のH、O、産生を減少させることができるため、細胞の酸化において主要な役割を果たします。 さらに、報告によれば、SIRT5は急性心筋梗塞の保護メカニズムとして脱スクシニル化を促進します[21-23]。 具体的には、急性心臓虚血および低酸素症は、PGC-1 / PPAR-y経路を介してSIRT5の発現をアップレギュレーションし、心筋細胞のエネルギー代謝に関与する重要なタンパク質のその後の脱スクシニル化を引き起こし、これらの細胞に保護効果を及ぼす可能性があります[24]。 SIRT5の翻訳後修飾は、主にミトコンドリアで発生します。 また、ミトコンドリア内で発生するNADPと依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼ2（IDH2）は、グルタチオンペルオキシダーゼ（GPX）の活性を含むグルタチオン-（GSH-）関連ミトコンドリア抗酸化システムの正常な動作に影響を与える可能性があります[25]。 さらに、IDH2はグルタチオンレダクターゼとチオレドキシンレダクターゼにNADPHを提供し、それによってミトコンドリアを酸化ストレスから保護するための調節効果を引き出します[26]。 ただし、心不全におけるSIRT5およびIDH2スクシニル化の調節を評価した研究はほとんどありません。
ケルセチンは、自然界に広く存在するフラボノイドです。 薬理学的研究は、ケルセチンが血管内皮機能損傷および心臓終末損傷を遅らせることができることを報告しました[27]。 ケルセチンはまた、心筋線維化の予防において調節的役割を果たし[28]、膵島機能をさらに調節することができます。 さらに、ケルセチンがSIRT1 / TMBIM6を介してマイトファジーと小胞体ストレスを調節し、ミトコンドリアのエネルギー代謝を改善し、ヒトの心筋細胞を保護できることを以前に発見しました[27]。 ただし、SIRT5スクシニル化に対するケルセチンの効果と心筋細胞に対するその保護効果の根底にある調節メカニズムは不明なままです。 したがって、SIRT5によって調節されるスクシニル化は、ミトコンドリアの質の監視とミトコンドリアの恒常性を介して細胞の代謝成長に影響を与えると仮定しました。 SIRT5の欠失は、スクシニル化の増加につながる可能性があり、それが心筋細胞の活動と心筋線維化に影響を与えることがわかりました。
2。材料と方法
2.1。動物と薬物治療。
すべての実験手順は、実験動物の管理と使用に関するNIHガイドに従って実施され、山東中医薬大学の動物実験委員会によって承認されました。 簡単に説明すると、30匹の雄の野生型C57BL / 6]マウス（8-週齢）を山東中医薬大学の実験動物センターから入手し、ランダムに3つのグループに分けました。 2）横大動脈狭窄（TAC）、および（3）TACとケルセチン。 TACとケルセチンのグループに50mg/kgのケルセチンを毎日15日間腹腔内投与しました（Shanghai Yuanye Biotechnology Company、上海、中国）。 偽マウスおよびTACマウスに、対応する通常の生理食塩水の腹腔内注射を行った。
2.2。 動物モデルの確立。
うっ血性心不全モデルは、TACを使用して確立されました[29]。 簡単に説明すると、ペントバルビタール（50mg / kg; Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国）の静脈内注射によってマウスを麻酔し、人工呼吸器を接続した後、開胸術を行いました。 大動脈を右動脈と左総頸動脈の間に8-0絹糸で結紮し、27Gの針で元の断面積の25-30パーセントに縮小しました。
2.3。 細胞培養。
HL {{0}}筋細胞は、山東中医薬大学の実験センターから提供されました。 細胞は、10％ウシ胎児血清、100U / mLペニシリン/ストレプトマイシン、0.1 mMノルアドレナリン、および2mML-グルタミンを含むクレイコム培地で培養しました。 細胞は37度と5パーセントのCOで培養されました[30]。 グルコースはSigma-Aldrichから購入しました。 ケルセチンはShanghaiYuanyeBiotechnologyCompanyから入手しました。 細胞は4つの実験グループにランダム化されました：（1）コントロール、（2）高グルコース（HG）、（3）HGとケルセチン、および（4）HGとケルセチンとsi-SIRT5。 HL -1細胞は、高グルコース（30mmol / L）とケルセチン（150mg / L）で処理されました。 低分子干渉RNA（siRNA）トランスフェクションでは、Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）を使用して、処理の24時間前に50nMsiRNAをHL-1細胞にトランスフェクトしました。 すべてのsiRNAはJikaiBiology（Shanghai、China）から入手しました。
2.4。 フローサイトメトリー。
アポトーシスレベルを分析するために、HL -1細胞をリン酸緩衝生理食塩水（Gibco、グランドアイランド、ニューヨーク、米国）に再懸濁し、70％エタノールで24時間固定し、洗浄した後、50ug/mLヨウ化プロピジウムに入れました。解決。 30分後、細胞を再懸濁し、フローサイトメトリーを実施して、前述のようにアポトーシスを検出しました。
2.5。細胞生存率アッセイ。
HL -1細胞の生存率は、MTTアッセイを使用して評価されました。 細胞を12-ウェルプレートに50、000細胞/ウェルの密度で播種しました。 22時間後、細胞に新鮮な増殖培地を補充し、24時間インキュベートした後、MTTアッセイによって細胞生存率を測定しました[31]。
2.6。酵素免疫測定法。
酵素免疫測定法（ELISA）キットを使用して、マウス心筋組織ホモジネートおよびHL-1細胞における抗酸化酵素および炎症性因子の活性を定量的に分析しました。 簡単に説明すると、心筋組織ホモジネートとHL-1細胞懸濁液を収集しました。
2.7。酸素消費率。
異なるグループのHL-1細胞の酸素消費率は、Seahorse XF Cell Mitochondrial Pressure Testキット（Agilent Technologies、カリフォルニア州サンタクララ、米国）を使用して測定しましたが、細胞外酸性化率はSeahorseXF解糖系を使用して測定しました。レートアッセイキット（AgilentTechnologies）。 両方のアッセイは、製造業者の指示に従って実施された。 2.8。 リアルタイム定量PCR。 TRIzol試薬を使用してトータルRNAを抽出し、アガロースゲル電気泳動でRNAの完全性を分析しました。 ファーストストランドcDNAは、iScript "cDNA合成キット（1μLのトータルRNA; Bio-Rad、Hercules、CA、USA）を使用して総量20μLで合成しました。CFX96RT-PCRシステム（Bio-Rad）を使用しました。 500×10-nM特異的プライマーを使用してcDNAのレベルを2回分析します。各実験では、連続希釈した混合cDNAを使用してPCR分析の効率を評価しました。遺伝子発現はハウスキーピング遺伝子の幾何学的平均と比較して定量化されました。研究された遺伝子と同じサンプルで発現が増幅され、遺伝子発現は方法[32]でした。2-AACTを使用して決定されました
2.9。統計分析。
データは、平均±平均の標準偏差として表されます。 一元配置分散分析を使用して複数のグループ間の差異を検証し、Student-Newman-Keuls事後検定を実行しました。 両側t検定を使用して、2つのグループを比較しました。 統計分析は、SPSS 22。0ソフトウェア（SPSS、Inc.、Chicago、IL、USA）を使用して実行されました。 統計的有意性はPに設定されました<>
3.結果
3.1。 ケルセチンは、TAC後の心筋肥大と心機能障害を軽減します。 C57BL / 6J雄マウスは、ランダムに3つのグループ（コントロール、TAC操作、およびTAC操作とケルセチン）に分けられました。 ケルセチンは、TACとケルセチンのグループに投与されました（50mg / kg、12時間ごと）。 TACの7週間後、TACモデルグループのマウスの約20％とケルセチン治療グループのマウスの10％が死亡しました。 偽手術群と比較して、TAC群の心機能は3週間後に著しく悪化した（図1（a）-1（i））。 しかし、ケルセチンで治療されたマウスの心機能は、ケルセチンで治療されていないマウスと比較して改善されました（図1（a）-1（））。
次に、TAC +ケルセチン治療後のTACマウスの心筋肥大を、TACの8週間後にヘマトキシリンおよびエオシン、WGA、およびTUNEL染色を使用して評価しました（図1（j）-1（m））。 偽手術群と比較して、TACマウスの心肥大および心筋細胞肥大または死亡の程度は有意に増加した（図1（j）-1（m））。 ただし、この効果はケルセチン処理後に大幅に減少しました（図1（j）-1（m））。
3.2。 ケルセチンは、TAC後の心筋線維化と炎症レベルを軽減します。
免疫組織化学により、異なるグループの心筋でコラゲナーゼIレベルを検出しました。 モデルグループの心筋のコラゲナーゼI/IIレベルは、TAC後に有意に増加しました（図2（h）-2（i））。 この効果はケルセチンによって逆転しました（図2（h）-2（I）。また、マッソン染色によってさまざまなグループの心筋線維化の程度を評価しました。モデルグループの心筋線維化の程度は次のとおりです。
TAC後に大幅に増加しました。 ケルセチンによる治療はこの現象を逆転させ、心筋組織を保護しました（図2（a）および2（b））。
心筋線維症は、主に長期的な圧力過負荷と炎症反応によって引き起こされる複雑な病理学的プロセスです。 TGF-、TNF-、IL -13、IL -18、MMPなどの多くの炎症誘発性因子が心筋線維化に関与する可能性があります。 したがって、ELISAによって選択された炎症誘発性因子（TNF-、IL -13、およびIL -18）の存在量を検出し、TGF-およびMMP-9の転写レベルはRT-PCR。 モデル群のTNF-、IL -13、IL -18の発現レベル、およびTGF-とMMP -9のmRNAレベルは、対照群よりも高かった（図2（図2） c）-2（g））。 ケルセチンはこの現象を逆転させ、炎症を抑制しました（図2（c）-2（g））。ケルセチンの治療メカニズムがSIRT5とIDH2に関連しているかどうかを確認するために、SIRT5とIDH2のmRNAとタンパク質の発現を検出しました。 mRNAおよびタンパク質の発現レベルはTAC後に有意に抑制されました（図2（m）-2（p）。ケルセチンはこれらの効果を逆転させ、ケルセチンが心筋線維化および心不全から保護するためにSIRT5およびIDH2を標的とすることを示しています（図2（図2（ m）-2（p））。
心筋線維化またはTAC後の心筋傷害に対するケルセチンの保護メカニズムをさらに検証するために、心筋組織でのROS産生を調査し、TAC後に有意に増加することを発見しました（図2（k）および2（I）、ケルセチンは阻害ROの過剰産生（図2（k）および2（））。これらの所見は、心筋線維化または心筋傷害に対するケルセチンの保護効果が、レドックスホメオスタシスの調節に関連していることを示唆しています。
3.3。 ケルセチンは、酸化ストレスを調節することにより、高グルコース誘発性のHL-1炎症傷害を軽減します。 前述の実験結果は、ケルセチンが心臓機能を改善し、TAC後のマウスの心筋線維化のレベルを阻害できることを予備的に示しました。 その保護効果は、SIRT5と抗炎症因子の調節に関連している可能性があります。 ただし、これらのイベントが直接規制メカニズムを介して発生するかどうかは不明でした。 高グルコース条件下でのケルセチンの調節メカニズムを研究するために、高グルコースによるHL -1細胞損傷を誘発し、これらの細胞をケルセチンで処理し、siRNAでSIRT5をノックダウンしました。 細胞活性はMTTおよびCCK-8アッセイを使用して検出され、アポトーシスレベルはフローサイトメトリーを使用して検出され、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）、GSH、TrxR、およびマロンジアルデヒド（MDA）活性はELISAを使用して検出されました。 CCK -8を使用して、さまざまなグルコース濃度でのHL-1細胞の生存率を分析しました。 図3（j）に示すように、細胞生存率は30mMの高グルコース濃度で大幅に減少しました。 MTTおよびフローサイトメトリーにより、高グルコース条件が細胞活性を阻害し、アポトーシスとROS産生を増加させ、細胞死を促進することが明らかになりました（図3（a）-3（e））。 対照群と比較して、高グルコース刺激はMDA活性を増加させ、SOD、GSH、TrxRなどの抗酸化酵素の活性を阻害しました（図3（f）-3（i））。
ケルセチンはMDAの活性を阻害し、SOD、GSH、およびTrxRの活性を増加させ（図3（f）-3（I）、アポトーシスとROS産生を阻害しました（図3（a）-3（e） ））、および改善された細胞活性（図3（c））。しかし、si-SIRT5とケルセチン処理はMDAの活性をさらに高め、アポトーシスとROS産生のレベルを増加させ、細胞活性を阻害しました（図3（a）{ {8}}（i））まとめると、これらの結果は、ケルセチンが高グルコースによって刺激されたレドックス状態の不均衡を調節し、HL-1心筋細胞を保護することを示しています。この調節効果はSIRT5に直接関連している可能性があります。
3.4。 ケルセチンは、SIRT 5-関連の脱スクシニル化修飾を促進することにより、高グルコース誘発性HL-1炎症傷害を軽減します。
酸化ストレスは心筋細胞の構造と機能に直接影響を及ぼし、MMPなどの心筋線維症に関連するシグナル伝達分子を直接活性化して、炎症反応を伴うROSの過剰産生に関連する心筋細胞の肥大とアポトーシスを引き起こします。 過剰なROS産生は、その形成部位またはその近くのミトコンドリア高分子に損傷を与える可能性があります。 心不全におけるミトコンドリアの構造的損傷と機能崩壊は、ROSのレベルの上昇に関連しており、主にミトコンドリアの過酸化脂質の増加とミトコンドリア呼吸複合体I、III、およびIVの酵素活性の低下として現れます。 しかし、エネルギー代謝
図2：ケルセチン（Que）は、横大動脈狭窄（TAC）後の心筋線維化と炎症レベルを軽減します。 （a）マッソン染色。 （b）線維性領域（パーセント）。 （ce）IL -18、TNF-、およびIL -13の発現レベルはELISAを使用して検出されました。（f、g）MMP_9およびTGF-BのmRNA発現はRTを使用して検出されました-PCR。（hj）コラゲナーゼ（collage）I / Illの発現は、免疫組織化学を使用して検出されました。 （k、I）ROSの変更。 （mp）SIRT5およびIDH2のタンパク質/RNA発現が検出されました。平均±SD;* P<>
ミトコンドリアはスクシニル化によって調節されています。 以前の実験結果は、心筋線維化と心不全に対するケルセチンの治療効果がSIRT1に関連していることを確立しました。
現在の研究では、高グルコース刺激HL -1細胞におけるSIRT5およびIDH2のmRNAレベルの分析と免疫沈降により、HL-1細胞におけるIDH2発現が高グルコース刺激後に有意に阻害されることが示されました。一方、IDH2のスクシニル化レベルは大幅に増加しました（図4（a）-4（d））。 さらに、ケルセチンの介入後、SIRT5とIDH2のmRNA発現とIDH2脱スクシニル化のレベルが増加しました（図4（a）-4（d））。 SIRT 5-を介したスクシニル化がミトコンドリア呼吸鎖に及ぼす影響をさらに検証するために、ミトコンドリア呼吸複合体I、III、およびIVを評価しました。 高グルコース刺激後、これらの複合体のレベルは減少しました。 しかし、ケルセチンはこの現象を逆転させました（図4（e）-4（g））。
ミトコンドリア呼吸複合体およびIDH2スクシニル化に対するケルセチンの調節効果も、si-SIRT5治療後に阻害されました（図4（a）-4（g））。 したがって、SIRT 5-を介したIDH2の脱スクシニル化は、心筋線維症および心不全の重要な調節メカニズムである可能性があります。 さらに、ケルセチンは、IDH2のSIRT5-を介した脱スクシニル化を通じて炎症反応と酸化ストレス損傷を改善する可能性があります。 ただし、ミトコンドリアの恒常性の調節メカニズムは、さらなる分析が必要です。
3.5。 ケルセチンは、ミトコンドリアのエネルギー代謝とNLRP3を調節することにより、高グルコース誘発性のHL-1炎症傷害を軽減します。
ミトコンドリアのエネルギー代謝は、スクシニル化によって調節されています。 しかし、さまざまな要因によって引き起こされる心不全または心筋線維化は、炎症状態における酸化ストレスおよびミトコンドリアエネルギー代謝障害の重要な病理学的メカニズムを伴う。 したがって、ミトコンドリアのエネルギー代謝と恒常性に対するケルセチンの調節効果を検証しました。 免疫蛍光分析は、NLRP3が高グルコース刺激後に高度に発現され、ケルセチンによって逆転したことを示しました（図5（f）および5（g））。 さらに、si-SIRT5処理により、NLRP3に対するケルセチンの調節効果が排除されました（図5（f）および5（g））。
ミトコンドリアの恒常性の調節は、NLRP3の活性化と密接に関連しています。 実際、NF-xBは、損傷したミトコンドリアを排除することにより、NLRP3の活性化を制限することができます[33、34]。 我々は、ケルセチンがNLRP3を調節することによりミトコンドリアの恒常性に影響を与えることを発見した。 高グルコース刺激HL-1
細胞はミトコンドリアのエネルギー代謝の深刻な障害を示しました。 ミトコンドリアのATPレベル、基礎呼吸、最大呼吸、および呼吸予備能が大幅に減少しました。 さらに、mPTP開口部が異常に増加しました（図5（a）-5（e））。 ケルセチンはこれらの効果を逆転させ、ミトコンドリアのエネルギー代謝とmPTP閉鎖を回復させました（図5（a）-5（e））。 しかし、si-SIRT5治療は、ミトコンドリアのエネルギー代謝とmPTPに対するケルセチンによって誘発された調節を逆転させました（図5（a）-5（e））。 したがって、炎症と酸化ストレスを伴うROSの過剰産生は、ミトコンドリアの酸化ストレスによる損傷につながる可能性があり、NLRP3はミトコンドリアのエネルギー代謝と相互作用する可能性があります。 ミトコンドリアは炎症の「トロイの木馬」である可能性があり、これは以前の研究の結果と一致しています[35]。
この記事は、Hindawi Oxidative Medicine and Cellular Longevity Volume 2021、Article ID 5876841、17ページhttps://doi.org/10.1155/2021/5876841から抽出されています。
