ラミナリア・ジャポニカ・フコイダンとカンカンキエキスの相乗的な抗炎症効果

外来抗原に対する免疫応答として、マクロファージは腫瘍壊死因子 (TNF-)、インターロイキン-1 (IL- 1 )、IL-6 などの炎症誘発性サイトカインを放出します。このようなサイトカインは、顆粒球、単球、リンパ球、肥満細胞の損傷組織への走化性流入を誘導し、抗原の除去と組織の回復を促進します。しかし、過剰な浸潤と細胞の活性化は組織損傷を悪化させ、炎症のよく知られた現象である浮腫（血管浸出）と痛みを引き起こします。

TNF-は、いくつかの細胞株において一酸化窒素シンターゼ (iNOS) 遺伝子発現を誘導するための重要な因子です。 iNOS の活性化は一酸化窒素 (NO) の生成を引き起こし、殺菌や血管拡張などのいくつかの生理学的機能を調節するだけでなく、炎症も引き起こします。組織損傷後、ホスホリパーゼによる細胞膜リン脂質の分解によりアラキドン酸が生成されます。アラキドン酸はシクロオキシゲナーゼ（COX）によってさらにプロスタグランジン（PG）に分解されます。 COX-II によって形成される過剰な量の PGE2 は、炎症を引き起こすいくつかのサイトカインを誘導します。 NO と PGE2 は両方とも炎症と痛みの誘発の主要な因子として作用するため、TNF-–NO および COX-II–PGE2 経路が炎症プロセスの主流であり、これらはコルチコステロイドや非ステロイド系薬剤によって阻害されます。抗炎症薬(NSAID)、それぞれ。

ステロイドやNSAIDはいくつかありますが、炎症性疾患の治療、これらの薬剤は、免疫系、胃腸管、腎臓、肝臓、中枢神経系、血圧、心血管系に悪影響を与える可能性があります。したがって、化学療法を置き換えたり、天然物と組み合わせて使用​​したりすることで、化学療法の悪影響を最小限に抑える必要があります。

フコイダンは、多くの国に広く分布しているラミナリア・ジャポニカやクラドシフォン・オカムラヌスなどの海藻に含まれる硫酸多糖複合体であり、東洋医学の治療薬として古くから使用されてきました。以前の研究では、フコイダンには抗酸化作用、抗凝固作用、抗がん作用、および抗がん作用があることが証明されています。抗炎症作用。したがって、炎症性疾患、虚血、免疫機能不全、腫瘍に対するフコイダンの有益な効果が研究者の注目を集めています。一方で、カンクイ(CT) は中国の伝統薬としても広く使用されています。 CT 抽出物は、炎症経路における NO 産生の主な要因である TNF-α および IL- 4 の産生を低下させることが報告されています [19]。

このような以前の発見により、我々は炎症の 2 つの主要な経路に対するフコイダンと CT 抽出物の併用効果を調査することになりました。作用機序を解明するために、カラギーナン誘発性の空気嚢炎症からの浸出液中の NO と PGE2 を分析しました。

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材料と方法

材料

半精製フコイダンおよびCTの水抽出物は、Misuba RTech Co., Ltd. (牙山、韓国) から入手しました。フコイダンとCT抽出物を4℃に保ち、使用前に精製水に溶解して混合(1:3)し、5mL/kgの量で経口投与した。

細胞培養とNO定量

マウスマクロファージ RAW 264.7 細胞株は、American Type Culture Collection (米国マナサス州) から購入し、10% ウシ胎児血清および抗生物質 [100 U/mL] を含むダルベッコ改変イーグル培地 (Sigma、セントルイス、米国) で培養しました。ペニシリン (Sigma) および 100 μg/mL ストレプトマイシン (Sigma)]。細胞は、加湿された 5% CO2 雰囲気中、37 度でインキュベートされました。

NO の分泌に対するフコイダンと CT 抽出物の効果を評価するために、RAW 264.7 細胞 (1×106 細胞/mL) をフコイダンまたは CT 抽出物 (1 ～ 320 μg/mL) と 5 分間インキュベートしました。 、続いてインターフェロン-(IFN-α、10U/mL)およびリポ多糖(LPS、10μg/mL)を24時間投与した。我々の予備研究では、RAW 264.7 細胞の活性化のための IFN-+LPS による処理は、最大 24 時間まで細胞の生存率に影響を与えず、フコイダンと CT 抽出物は 1 mg/mL まで細胞毒性がないことが確認されました。 NOの指標としてNOの酸化生成物である亜硝酸塩（NO2 – ）の濃度を測定しました。培地を等量のグリース試薬 (2.5% リン酸中の 1% スルファニルアミド、0.1% ナフチル エチレンジアミン) [21] と混合し、室温で 10 分間インキュベートしました。亜硝酸塩濃度は 540 nm で分析され、NaNO2 を使用して標準曲線が作成されました。

動物と治療

雄の ICR マウス (7 週齢) を Daehan Biolink (Eumseong, Korea) から購入し、一定の環境条件 (22±2℃、相対湿度 40-70%、時間照度 12-) の部屋で飼育しました。 -暗サイクル; 150-300 ルクスの明るさ)。ペレット飼料および精製水を自由に摂取させた。すべての動物実験は、韓国の忠北国立大学（CBNU）の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認され、CBNU実験動物研究センターの標準操作手順（SOP）に従って実施されました。

マウス（n=8/群）をフコイダン（18または54 mg/kg）、CT抽出物（54または162 mg/kg）、またはそれらの混合物（18+54、{{6 }} または 90+270 mg/kg) を 1 日 1 回、7 日間投与します。低用量のフコイダン (18 mg/kg) および CT 抽出物 (54 mg/kg) は、体重 (Km{{14それぞれ人間の場合は }}、マウスの場合は Km=3)。最大の相乗効果を評価するために、フコイダンとCT抽出物の高用量は単独または混合で3倍に設定し、最高用量の混合物は5倍に固定しました。

フコイダンとCT抽出物による治療の1日目に、マウスの背中側に10 mLの滅菌空気を皮下注射して袋を形成しました[22、23]。 2 日後および 5 日後、パウチに 5 mL の空気を再注入しました。最終処理の 1 時間後、1 mL のカラギーナン (生理食塩水中 1%、Sigma) またはそのビヒクル (生理食塩水) をポーチに注入しました。

滲出液の分析

カラギーナン注射の６時間後に空気嚢を１ｍＬの冷生理食塩水で洗浄し、洗浄液の正味量を記録した。炎症細胞、好中球、単球、およびリンパ球の総数は、コールターカウンターを使用して測定されました。 NO および PGE2 の濃度は、それぞれ Griess 試薬 (Sigma) および Correlate-EIA キット (Assay Designs、米国アナーバー、アナーバー) を使用した酵素免疫測定法 (EIA) によって測定されました。

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病理組織学的検査

ポーチの内張り組織を除去し、中性ホルマリン溶液中で固定した。パラフィン包埋組織スライドをヘマトキシリン・エオシンで染色し、光学顕微鏡で炎症性病変を調べました。

統計分析

結果は平均値±標準誤差として表されます。実験群の比較は、一元配置分散分析とその後のテューキー検定補正によって行われました。 AP値<0.05 was considered statistically significant.

結果

インビトロでは、RAW 264.7 細胞培養、IFN-α、および LPS 処理により NO 産生が大幅に増加しました (図 1)。フコイダン (1 ～ 320 μg/mL) による前処理は、マクロファージ細胞株からの NO 放出に影響を与えませんでした (図 1A)。比較すると、CT 抽出物 (32 ～ 320 μg/mL) は NO 生成を有意に抑制し、抗炎症活性を示しました (図 1B)。

マウスの空気嚢にカラギーナンを注射すると、嚢内の滲出液量が著しく増加しました (図 2)。このような滲出液の増加は、フコイダン (18 mg/kg) および CT 抽出物 (54 および 162 mg/kg) による治療によって軽減されました。注目すべきことに、フコイダンとCT抽出物の併用治療は、個々の効果と比較して滲出液量をさらに減少させましたが、より高用量の組み合わせ（54+162 mg/kgおよび90+270 mg/kg）では追加の効果は示されませんでした最低用量の組み合わせ (18+54 mg/kg) (図 2A)。パウチ内の N 度含量も、カラギーナン注射後に大幅に増加しました (図 2B)。フコイダンの穏やかな効果と比較して、CT抽出物はN度濃度を顕著に低下させました。フコイダンとCT抽出物の併用治療は、用量依存的にNOレベルをさらに減少させた。同様に、PGE2 含有量の増加は、フコイダンと CT 抽出物の併用療法によって相乗的に抑制されました (図 2C)。

袋内の炎症性メディエーターと並行して、カラギーナン注射により炎症細胞の数が劇的に増加しました。好中球、単球、リンパ球はそれぞれ対照レベルの 37.8 倍、4.8 倍、24.1 倍でした (表 1)。しかし、フコイダンとCT抽出物は炎症細胞浸潤を有意に減少させ、フコイダンはCT抽出物よりも若干優れていました。予想外なことに、フコイダンとCT抽出物の同時投与では、炎症細胞浸潤における相乗効果は得られませんでした。

浸出液中の炎症細胞浸潤から推測されるように、空気嚢を囲む皮下組織は重度の炎症性病変を示しました（図 3）。カラギーナンに曝露された肥厚した皮下組織では、対照動物のほぼ正常な特徴（図 3A）と比較して、非常に多くの細胞が観察されました（図 3B）。このような炎症性病変は、フコイダン (図 3C および 3D) または CT 抽出物 (図 3E および 3F) による治療によって著しく軽減されました。

注目すべきことに、フコイダンとCT抽出物の併用療法により、より高い抗炎症効果が得られた(図3G-3I)。

議論

生体内アラギーナン誘導性空気嚢炎症モデルを使用して、齧歯動物の背中に空気を注入すると、腔の表面に重層化して滑膜に似た構造を形成する細胞の増殖が誘導されます。このモデルでは、カラギナン誘発炎症細胞浸潤の注射により浸出液が増加し、これは血管漏出を示しています。空気嚢は炎症細胞とメディエーターの貯蔵庫として機能し、局所的に蓄積する体液を簡単に測定できます。

血管透過性を誘導できる多様な炎症性メディエーターの中で、NO と PGE2 が多くの炎症性疾患の発症に関与する主要な因子であることはよく知られています。それらは、痛みの誘発と知覚のメディエーターとしても知られています。 iNOS は、炎症時に TNF および/または LPS による刺激によってさまざまな細胞型で発現および活性化され、高持続濃度の NO を生成します。 NO は、血管漏出を引き起こす血管拡張など、さまざまな生理学的機能における重要な調節分子です。 COXを介してアラキドン酸から生成されるPGE2は、多くの炎症性疾患の発症に寄与しており、さまざまな炎症刺激に応答したPGE2の過剰産生は、COX-IIレベルの上昇と炎症の進行に関連しています。したがって、TNF- - NO 経路と COX-II-PGE2 経路は、それぞれ iNOS (コルチコステロイド) と COX (NSAID) の阻害剤によってブロックされる、炎症プロセスの 2 つの主要な流れであると考えられてきました。

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本研究では、フコイダンとCT抽出物の同時投与によりパウチ内の浸出液量が減少し、それらが血管漏出に対する抑制活性を有することが示唆されました（図2A）。各フコイダンとCT抽出物の個別の効果と比較して、併用治療はさらに増加し​​、2度の化合物が相乗的に作用することを示唆しています。フコイダンとCT抽出物のこのような相乗効果は、滲出液中のNOおよびPGE2レベルに対するそれらの活性によって裏付けられました（図3Bおよび2C）。

しかしながら、興味深いことに、フコイダンは、インビトロアッセイにおいてマクロファージの活性化を直接阻害しないことが確認された（図１Ａ）。同様に、インビボアッセイにおける NO および PGE2 蓄積に対するフコイダンの阻害能力は、CT 抽出物の阻害能力よりも相対的に低かった (図 2B および 2C)。このようなフコイダンの作用機序は、CT抽出物による細胞の直接的な不活化とは異なります（図1B）。比較すると、フコイダンは袋内の炎症細胞浸潤の阻害に高い効果を発揮しました（表1）。フコイダンは、カラギーナン誘発組織損傷部位への好中球、単球、リンパ球の遊走を阻止する点でCT抽出物よりも優れていました。興味深いことに、相乗的な抗遊走効果はなく、フコイダンとCT抽出物の間には異なる作用機序があることを示しています。つまり、フコイダンは炎症細胞の浸潤をブロックするのに対し、CT抽出物は細胞の活性化を阻害します。

多形核細胞、特に好中球は、カラギーナンによって誘発される急性炎症部位に動員される主要な細胞成分です。さらに、マクロファージやリンパ球などの炎症細胞も、サイトカインを分泌することで炎症過程で中心的な役割を果たします。フコイダンまたはCT抽出物で前処理すると、カラギーナンを注入した空気嚢に移動した白血球の数が著しく抑制されました。この結果は、デキサメタゾンなどのコルチコステロイドによって得られる効果と一致しましたが、インドメタシンなどのNSAIDによっては得られませんでした。したがって、フコイダンおよびＣＴ抽出物は、ステロイドとしての性質を一部有していると考えられる。

炎症細胞走化性の遮断作用に加えて、CT 抽出物はマクロファージの活性化を抑制するようです。これは、マクロファージによって産生される主要な炎症性メディエーターであるNOに対するインビトロおよびインビボの阻害作用によって確認された。したがって、マクロファージに対する CT 抽出物の効果は、これらの細胞における mRNA 発現の抑制および/または iNOS 活性の直接阻害によるものである可能性があります。

PGE2 も主要な炎症メディエーターの 1 つです。これは組織浮腫と並行して増加しますが、COX の阻害剤である NSAID によって抑制されます。カラギーナンは、ポーチ浸出液中の COX-II mRNA および COX-II タンパク質を誘導することにより、PGE2 産生を増加させることができます。このモデルでは、カラギーナンは PGE2 の量を大幅に増加させましたが、CT 抽出物によって実質的に抑制されました。この結果が、NSAID インドメタシンによって得られる効果と一致していたことは興味深いことです。したがって、この結果から、CT 抽出物には NSAID の追加の特性があることが推測されます。総合すると、CT 抽出物はカラギーナン誘発炎症モデルにおいてコルチコステロイドと NSAID 様効果の両方を発揮し、フコイダンは炎症を増強したと考えられます。CTエキスの抗炎症効果炎症細胞の浸潤をブロックすることによって。

正確な作用機序を明らかにするにはさらなる研究が必要ですが、フコイダンとCT抽出物の混合物は、カラギーナン誘発性の空気嚢炎症におけるTNF--NOおよびCOX-II-PGE2経路をブロックすることにより、炎症の兆候を著しく軽減しました。これらの発見は、フコイダンとCT抽出物の併用治療が、コルチコステロイドまたはNSAIDに反応するさまざまな種類の炎症を軽減するための有望な候補である可能性があるという証拠を提供します。

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