先天性心疾患における神経保護の現状パート 2
Mar 08, 2024
次いで、顕微鏡画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（米国メリーランド州ベセスダの国立衛生研究所）を使用して画像計算にかけた。 Hsp60のシグナルを「×」倍した。
Hsp60 は、人体において重要な生物学的役割を果たす重要なタンパク質分子です。 近年の研究では、Hsp60の存在が人間の記憶と密接に関係していることが示されています。
Hsp60 は、主にタンパク質のフォールディング、アンフォールディング、安定化、および分解に関与する分子シャペロンタンパク質です。 これらのプロセスは、人体の正常な代謝と細胞機能にとって非常に重要です。 同時に、Hsp60 には抗酸化作用、抗炎症作用、免疫調節作用もあり、人間の健康と免疫系のバランスの維持に大きな役割を果たしています。
研究により、Hsp60 が記憶の形成と維持に重要な役割を果たしていることが判明しました。 学習と記憶の過程で、脳細胞は大量の Hsp60 分子を生成します。 これらの分子は、外部環境からの干渉や損傷から細胞を保護し、学習と記憶のスムーズな進行を保証します。 さらに、Hsp60 は脳細胞の信号伝達やニューロンの発達を変化させることで人間の思考や行動にも影響を及ぼし、認知力やストレス耐性にプラスの影響を与えます。
Hsp60 の役割は人体にプラスの効果を示していますが、Hsp60 の過剰と欠乏の両方が人間の健康にマイナスの影響を与える可能性があることも認識する必要があります。 したがって、人間の健康におけるHsp60の位置と役割をよりよく理解するために、人体のさまざまな生理学的および病理学的状態におけるHsp60のメカニズムを積極的に探索および研究する必要があります。 私たちは記憶力を向上させる必要があることがわかります。カンクサには抗酸化作用、抗炎症作用、および老化防止効果があり、脳内の酸化と炎症反応を軽減し、それによって脳を保護する効果があるため、カンクサは記憶力を大幅に向上させることができます。神経系の健康。 さらに、カンクサは神経細胞の成長と修復を促進し、それによって神経ネットワークの接続と機能を強化します。 これらの効果は、記憶力、学習能力、思考速度の向上に役立ち、認知機能障害や神経変性疾患の発症も防ぐ可能性があります。
「x」値は次のように決定されました。対照グループのミトコンドリア DNA シグナルから「x」倍の Hsp60 シグナルを差し引くと、ミトコンドリア DNA 値はゼロ以下になりました。 ヒストン H2B のシグナルに「y」を掛けました。
「y」値は次のように決定されました。対照グループの核 DNA シグナルから「y」折り畳まれたヒストン H2B シグナルを差し引くと、核 DNA 値はゼロ以下になりました。 乗算によりバックグラウンド信号が高くなった場合、乗算画像のコントラストをすべてのサンプルで同じ条件に調整することができる。
dsDNA 染色の画像から、増殖した Hsp60 とヒストン H2B の調整画像を差し引いた画像を、その後の分析に使用しました。 「閾値調整」機能を使用して、これらの画像を二値化しました。 サイズが 2 ～ 20 μm2 (円形度 0.1 ～ 1.0) の範囲の dsDNA 点を選択し、「Analyze-Analyze Particles」機能を使用してカウントしました。
2.3. 電子顕微鏡法
トランスフェクションの 1 日前に、HeLa 細胞を 600 細胞/μL の密度で播種しました。製造業者の指示に従ってください（最終 RNA 濃度は 10 nM）。
siRNA ノックダウンの 4 日後、細胞を固定しました。細胞培養サンプルを、0.1 M リン酸緩衝液、pH 7.4 中の 2% PFA および 2% グルタルアルデヒドで 37 °C で固定し、4 ℃の恒温槽に置きました。 ◦℃の冷蔵庫で30分間。 サンプルを、0.1 M リン酸緩衝液中の 2% グルタルアルデヒド中で 4 °C で一晩固定しました。 サンプルを 0.1 M リン酸緩衝液で 30 分間 3 回洗浄し、0.1 M リン酸緩衝液中の 2% 四酸化オスミウムで 4 °C で 1 時間後固定しました。
サンプルを含浸エタノール溶液で脱水し、樹脂 (Quetol-812、日新 EM Co.、東京、日本) に移し、60 °C で 48 時間重合させました。 重合した樹脂を、ウルトラミクロトーム (Ultracut UCT、Leica Microsystems、Wetzlar、ドイツ) を使用してダイヤモンド ナイフで極薄の 70- 断面に切断し、銅グリッド上にマウントしました。
切片を2%酢酸ウラニルで室温で15分間染色し、蒸留水で洗浄した後、鉛染色溶液(Sigma-Aldrich、東京、日本)で室温で3分間二次染色した。
グリッドは透過型電子顕微鏡 (JEM-1400Plus、日本電子株式会社) で観察されました。.、東京、日本）80 kV（ゼブラフィッシュ脳）または100 kV（細胞）の加速電圧で、画像は電荷結合素子（CCD）カメラ（EM-14830RUBY2、JEOL Ltd.）を使用して記録されました。 。
2.4. 免疫電子顕微鏡法
金ディスク上のサンプルは液体プロパン中で -175 °C で凍結されました。 サンプルを凍結した後、1% タンニン酸のエタノール溶液および 2% 蒸留水で -80 °C で 24 時間凍結置換しました。
次に、サンプルを -20 °C で 4 時間保持し、続いて 4 °C で 1 時間インキュベートしました。 次に、サンプルを無水エタノール中で 30 分間 3 回脱水しました。 毎回、エタノールと樹脂の 50:50 の混合物 (LR ホワイト: ロンドン レジン社、バークシャー、英国) を 4 °C で 1 時間浸透させました。 サンプルを新しい 100% 樹脂に移し、4 °C で 30 分間インキュベートし、このプロセスを 3 回繰り返しました。
サンプルを新しい 100% 樹脂に移し、50 °CO/N で重合させました。 重合した樹脂を、ウルトラミクロトーム（Ultracut UCT; Leica）を使用してダイヤモンドナイフで90 nmで超薄切片にし、切片をニッケルグリッド上に配置した。 グリッドを抗 dsDNA 抗体 (35I9 DNA) (1/800、Abcam、カタログ番号 ab27156、RRID: AB_470907) とともに 1% BSA/PBS 中で 4 °CO/N でインキュベートし、続いて1% BSA/PBS をそれぞれ 1 分間。
続いてそれらを、{{0}nm 金粒子（ヤギ抗マウス IgG ポリクローナル抗体）に結合した二次抗体とともに室温で 2 時間インキュベートしました。 ＰＢＳですすいだ後、グリッドを０．１Ｍカコジル酸緩衝液中の２％グルタルアルデヒド中に置いた。
その後、グリッドを乾燥させ、2% 酢酸ウラニルで 15 分間、室温で鉛染色液 (Sigma-Aldrich) で 3 分間染色しました。グリッドは透過型電子顕微鏡 (JEM-1400) で観察されました。プラス；日本電子株式会社）、加速電圧100kV。 デジタル画像は CCD カメラ (EM-14830RUBY2、日本電子株式会社) で取得しました。
3. 結果
3.1. TFAMまたはGBAの減少は異所性ミトコンドリアDNAの増加を誘発する
まず、TFAM タンパク質が siRNA によってノックダウンされた HeLa 細胞におけるミトコンドリア由来の細胞質 DNA の検出例を示しました (図 1A)。TFAM は重要なミトコンドリア転写因子であり、ミトコンドリア DNA の複製と修復にも機能します [20] 。
この遺伝子の配列多型はパーキンソン病に関連していると報告されています[21、22]。 TFAMタンパク質をノックダウンしてから3日後、HeLa細胞の細胞質で多くの二本鎖DNAドットが検出されました。
ヒストンは、細胞質内の核由来 DNA の陽性マーカーであり、細胞質内のミトコンドリア DNA およびミトコンドリア由来 DNA の陰性マーカーです [23]。これらのドットはヒストンと共局在せず、核由来 DNA ではないことを示唆しています。 さらに、これらの細胞質の異所性 DNA ドットの一部は、ミトコンドリア マトリックスのマーカーである Hsp60 と共局在せず、ミトコンドリアの外側に存在することが示されました (図 1B、C)。
電子顕微鏡検査では、異所性 DNA がミトコンドリアから漏出していることも示されました (図 2A、B)。 要約すると、TFAMノックダウンによる細胞質内の異所性DNAドットの増加は、ミトコンドリアから漏出したミトコンドリアDNAによるものでした。 次に、GBAタンパク質がsiRNAによってノックダウンされたHeLa細胞におけるミトコンドリア由来の細胞質DNAの検出の別の例を示しました。 (図1A)。
GBA はゴーシェ病の原因遺伝子ですが、GBA のヘテロ変異はパーキンソン病の危険因子でもあります [24]。 GBAタンパク質を3日間ノックダウンした後、HeLa細胞の細胞質で多くの二本鎖DNAドットが検出されました。 一部の DNA ドットはヒストンと共局在しており、それらが核由来の DNA であることを示唆しています。
他の DNA ドットはヒストンと共局在しておらず、それらが核由来の DNA ではなくミトコンドリア由来の DNA であることを示唆しています (図 1D)。 要約すると、GBAノックダウンによる細胞質内の異所性DNAドットの増加は、少なくとも部分的にはミトコンドリアから漏出したミトコンドリアDNAによるものであった。
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