先天性心疾患における神経保護の現状 パート 1
Mar 07, 2024
抽象的な：
細胞質内に異所性 DNA が存在すると、炎症と細胞死が誘発されます。 核 DNA の細胞質への漏出は主にサイクリックGMP-AMP シンターゼ (cGAS) によって感知できることが広く報告されています。
DNA は各人の遺伝情報を指定する分子であり、私たちのすべての細胞の中に存在します。 最近の研究では、DNA が特定の経路を通じて細胞質に漏洩し、私たちの記憶に影響を与える可能性があることが示されています。
この現象は、高齢者や認知障害のある人によく見られます。 DNA が細胞質に漏洩すると、細胞内の正常な機能が妨げられ、記憶喪失や認知障害のリスクが高まります。
しかし、このことで落ち込んだり絶望したりする必要はありません。 健康な脳を維持するために、記憶力と認知能力を向上させる方法はたくさんあります。
まず、健康的なライフスタイルを維持する必要があります。 これには、バランスの取れた食事、十分な睡眠、適度な運動、ストレスの軽減などが含まれます。 これらの習慣は脳の健康を促進し、それによって DNA 漏洩を防ぎ、記憶力を向上させます。
第二に、認知トレーニングが必要です。 これには、数学ゲームをする、読書する、新しいスキルを学ぶなどが含まれます。これらの活動は、脳を刺激し、DNA 漏洩を避けるために神経新生を促進するのに役立ちます。
最後に、前向きな姿勢を保ちましょう。 情緒不安定や過度のストレスは、DNA 漏出を促進する脳化学変化を引き起こす可能性があります。 したがって、私たちは人生の課題に前向きに直面し、楽観的な態度を維持することを学ぶ必要があります。
要約すると、細胞質への DNA 漏出は記憶に影響を与える可能性がありますが、正しいライフスタイルを採用し、認知トレーニングに取り組み、ポジティブな考え方を維持することで、脳の健康を改善し、DNA 漏出を回避し、最終的に記憶力を向上させることができます。 記憶力と認知能力。 私たちは記憶力を向上させる必要があることが分かります。カンクサは多くのユニークな効果を持つ伝統的な漢方薬素材であり、そのうちの 1 つは記憶力の向上であるため、カンクサは記憶力を大幅に向上させることができます。 カンクサの効能は、タンニン酸、多糖類、フラボノイド配糖体などを含む複数の有効成分に由来しています。これらの成分は、さまざまな経路を通じて脳の健康を促進します。
私たちは最近、リソソーム分解を免れたミトコンドリア由来の細胞質二本鎖 DNA (dsDNA) が培養細胞内および in vivo で重大な細胞毒性を誘発することを報告しました。 細胞質ミトコンドリア DNA はさまざまな病気や障害に関与していると考えられており、これを確認する論文がますます多く発表されています。 一方、細胞質内のミトコンドリア DNA を評価する現在の方法は定量的ではない可能性があります。
ここでは、細胞内の異所性ミトコンドリア DNA を評価する方法を詳しく紹介します。 この方法は、基礎研究だけでなく、老化、パーキンソン病、アルツハイマー病、心不全、自己免疫疾患、癌、その他の症状の研究にも役立ちます。
キーワード: 異所性 DNA。 ミトコンドリアDNA。 ミトコンドリア転写因子 A (TFAM); パーキンソン病。
1. はじめに
DNA には生存と継承のための重要な情報が含まれており、酸化剤や変異原などのさまざまなストレス要因から保護する必要があります。 真核細胞にはミトコンドリアが含まれており、ミトコンドリアは好気呼吸によって大量の活性酸素種とともにエネルギーを生成します。
したがって、真核細胞では、DNA は核またはミトコンドリアに存在し、それぞれ核膜またはミトコンドリア膜の内側に詰め込まれています。しかし、ウイルスまたは非ウイルス感染中などの特定の条件下では、DNA が細胞質に存在する可能性があります [1- 4]。
一部の非感染性状態（たとえば、老化、さまざまな加齢に関連した障害やがん）であっても、DNA が核またはミトコンドリアから細胞質に漏洩する可能性があります [5-7]。
細胞質内の DNA は、細胞に対して炎症を引き起こしたり、毒性を示す可能性があります。 核 DNA の細胞質への漏出は、主にサイクリック GMP-AMP シンターゼ (cGAS) - インターフェロン遺伝子刺激因子 (STING) 経路を介して、炎症、細胞毒性、老化関連分泌表現型 (SASP) を誘導することが広く報告されています。 5、6]。
我々は最近、リソソーム分解から逃れたミトコンドリア起源のサイトゾル二本鎖 DNA (dsDNA) がパーキンソン病の細胞モデルにおいて細胞毒性と神経変性を誘導することが示されたことを報告しました [8]。 このような異所性 DNA の存在の増加は、DNA 漏出自体の増加ではなく、代表的な顕微鏡画像や状況証拠によって示されることがよくありました。
この異所性 DNA の評価は、基礎研究だけでなく、老化やパーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、心不全、自己免疫疾患、糖尿病などの他の疾患の研究においてもますます重要になることが予想されます。非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、および癌。 cGAS-STING経路は、老化だけでなく、これらの疾患の発症にも重要であることが報告されている[8-17]。
おそらく、ミトコンドリア周囲の酸化状況とミトコンドリア DNA の効率的な DNA 修復システムの欠如により、ミトコンドリア DNA は核 DNA よりもはるかに突然変異や損傷を受けやすいです [18,19]。
核 DNA とは異なり、ミトコンドリア DNA は単一細胞内に複数のコピーで存在し、必要に応じて合成されます。したがって、ミトコンドリア DNA は、加齢や加齢関連疾患、ミトコンドリア機能不全などの悪性疾患の際に細胞質に漏出する可能性がはるかに高くなる可能性があります。 、または癌。
このような細胞質ミトコンドリア DNA の検出と測定は、さまざまな病気や老化の病因を理解する上で重要である可能性があり、バイオマーカーや治療標的になる可能性があります。
我々は、細胞質に漏出する異所性ミトコンドリア DNA を評価するための半定量的方法を開発しました。ここでは、その方法について詳しく説明します。 この論文はミトコンドリア DNA の漏洩を客観的に評価することを可能にし、さまざまな疾患の病態研究に役立ちます。
2。材料と方法
2.1. 細胞株、siRNA 処理、および定量的 PCR (qPCR) 分析
HeLa 細胞は、女性患者の子宮頸がん細胞 (ATCC、CCL-2) に由来しました。 HeLa 細胞は、10% 牛胎児血清 (FBS) (Biowest、ヌアイエ、フランス) およびペニシリン - ストレプトマイシン溶液を添加したダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) (ナカライテスク、京都、日本) 中で 5% CO2 下、37 °C で培養しました ( 100 単位/mL ペニシリン G および 100 μg/mL 硫酸ストレプトマイシン、大阪府和光市）。
トランスフェクションの 1 日前に、HeLa 細胞を 600 細胞/μL の密度で播種しました。 リポフェクタミン RNAiMAX トランスフェクション試薬 (ThermoFisher Scientific) に含まれる Stealth RNAi siRNA (ミトコンドリア転写因子 A、TFAM: HSS144251、グルコセレブロシダーゼ、GBA: HSS178140、Thermo FisherScientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を使用して、HeLa 細胞で目的の遺伝子の発現を抑制しました。メーカーの指示に従ってください (最終 RNA 濃度は 10 nM)。
siRNA ノックダウンの 3 日後、製造業者 (Thermo Fisher Scientific) の指示に従って TRIzol 試薬を使用して全細胞 RNA を単離しました。 cDNAテンプレートは、ProtoScript II First StrandcDNA Synthesis Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)とオリゴ(dT)20プライマーを使用して、精製RNAから合成されました。qPCRは、TB Green Premix Ex Taq II (タカラバイオ、草津)を使用して実行されました。 、日本）を使用し、サーマルサイクラーダイスリアルタイムシステムライト（タカラバイオ）で分析しました。 本研究で使用した PCR プライマーは、GBA フォワード (TGCTGCTCTCAACATCCTTGCC)、GBA リバース (TAGGTGCGGATGGAGAAGTCAC)、TFAM フォワード (GGCAAGTTGTCCAAAGAAACC)、TFAM リバース (GCATCTGGGTTCTGAGCTTTA)、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH) フォワード (CAGCCTCAAGATCATCAGCA)、および GAPDH でした。逆方向 (TGTGGTCATGAGTCCTTCCA)。
統計分析は、GraphPad Prism ソフトウェアバージョン 9.3.1 (GraphPad Software、米国カリフォルニア州サンディエゴ) を使用して実行されました。 両側スチューデントの t 検定を使用して、2 つのグループ間の算術平均を比較しました。 データは平均値±平均値の標準誤差として表示されます。
2.2. 異所性ミトコンドリア DNA の免疫蛍光検出と画像解析
トランスフェクションの 1 日前に、HeLa 細胞を 600 細胞/μL の密度で播種しました。製造業者の指示に従ってください（最終RNA濃度は10nM）。
siRNA ノックダウンの 3 日後、細胞を免疫蛍光染色に供しました。 ミトコンドリア DNA の検出には、抗 dsDNA 抗体 (Abcam、ケンブリッジ、英国、クローン 35I9、カタログ番号 ab27156、RRID: AB_470907 または EMD Millipore、ビレリカ、マサチューセッツ州、クローン AC-30-10 、カタログ番号 CBL186、RRID: AB_11213573) は、Hoechst 33258、DAPI、または Picogreen よりも優れた信号対雑音比を示しました。 ここでは、抗 dsDNA 抗体 (35I9 DNA) (Abcam、カタログ番号 ab27156、RRID: AB_470907)、抗ヒストン H2B 抗体 (Abcam、カタログ番号 ab134211)、および抗熱抗体の 3 つの一次抗体を組み合わせました。ショックプロテイン-60 (Hsp60) 抗体 (Abcam、カタログ番号 ab46798、RRID: AB_881444)。
他の抗体を選択したり、ヒストンで蛍光タグを付けたり、あるいは Hsp60 を使用したりすることもできますが、組み合わせごとに三重染色の条件を最適化する必要があります。
細胞をリン酸緩衝食塩水 (PBS) で 2 回洗浄し、氷冷メタノールで 4 °C で 10 分間固定しました。あるいは、4% パラホルムアルデヒド (PFA) を固定に使用することもできますが、バックグラウンドシグナルがPFA 固定サンプルではさらに大きくなります。 固定後、細胞をTween 20を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBST)で各5分間3回洗浄した。 細胞を0.2% (w/v) Triton X-100を含むPBSで10分間透過処理しました。
ＰＢＳＴで各回５分間３回洗浄した後、細胞をＰＢＳＴ中の２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともに３０分間インキュベートした。 細胞を、PBST 中の 2%(w/v) BSA で希釈した単一一次抗体である抗ヒストン H2B 抗体 (1/400、Abcam、カタログ番号 ab134211) とともに 4 °C で O/N でインキュベートしました。 PBST で各回 5 分間 3 回洗浄した後、細胞を Alexa Fluor 488-AffiniPure Donkey anti-Chicken IgY(IgG) (H+L) (1/200, Wako, Cat# {{17}) とともにインキュベートしました。 }}) 2% (w/v) BSA を含む PBST で室温 (RT) で 1 時間希釈しました。
PBSTで各回5分間3回洗浄した後、細胞を一次抗体、抗dsDNA抗体(35I9 DNA)(1/800、Abcam、カタログ番号ab27156、RRID:AB_470907)および抗-PBST 中の 2% (w/v) BSA で希釈した Hsp60 抗体 (1/400、Abcam、カタログ番号 ab46798、RRID: AB_881444) を室温で 1 時間、または室温で一晩 (O/N) 適用しました。 4℃。
PBST で各回 5 分間洗浄を 3 回行った後、細胞を高度に交差吸着した Alexa Fluor 680- 結合ロバ抗ウサギ IgG(H+L) (1/200、Thermo Fisher Scientific、カタログ番号 A10043) とともにインキュベートしました。 、RRID: AB_2534018) およびロバ抗マウス IgG H&L (Alexa Fluor® 594) (1/200、Abcam Cat# ab150108、RRID: AB_2732073) を 2% (w/v) で希釈PBST中のBSAを室温で1時間。
細胞をＰＢＳＴで各回５分間３回洗浄し、Ａ１Ｒ＋共焦点顕微鏡（ニコン、東京、日本）を使用して標本を分析した。
For more information:1950477648nn@gmail.com
