先天性心疾患における神経保護の現状パート 3
Mar 08, 2024
3.2. 異所性ミトコンドリア DNA の半定量的評価
Hsp60 染色 (ミトコンドリア マトリックス) およびヒストン H2B 染色 (核マーカー) の画像を、dsDNA 染色の画像から差し引いた。 次に、画像ソフト（国立衛生研究所）の「AdjustThreshold」機能を用いて画像を二値化した。
ミトコンドリアは細胞内のエネルギー工場であり、細胞に必要なエネルギーを提供するための ATP の合成を担当します。 ミトコンドリアマトリックスはミトコンドリアの内部液体であり、さまざまな酵素やイオンが含まれており、ミトコンドリアのさまざまな生化学反応の重要な部位です。 記憶は人間の最も重要な認知能力の 1 つです。 この 2 つは無関係に見えるかもしれませんが、密接に関係しています。
研究により、ミトコンドリアマトリックスと記憶の間に相互作用があることがわかっています。ミトコンドリアマトリックス内の酵素とイオンは、ニューロン細胞のエネルギー代謝とイオンチャネルの状態を調節することで、ニューロンの興奮性に直接影響を与え、記憶に影響を与えます。また、ミトコンドリアマトリックスにはさまざまなシグナル伝達分子があり、ニューロンの軸索とシナプスを介して下流のニューロンに伝達され、ニューロンのシグナル伝達効率に影響を与え、記憶の形成と固定に影響を与えます。
同時に、記憶活動はミトコンドリアマトリックスの状態にも直接影響します。 記憶活動はニューロンのエネルギー消費を増加させ、ミトコンドリアマトリックス内の酸化還元反応を促進し、それによってミトコンドリアの代謝レベルと細胞内イオンバランスに影響を与え、さらにニューロンの興奮性とシグナル伝達効率に影響を与えます。
したがって、良好な記憶機能を維持するには、ミトコンドリアの健康を維持することが重要です。 規則的な食事、適度な運動、十分な睡眠などの良い生活習慣を維持することで、ミトコンドリアマトリックスの健康を維持することができます。 さらに、記憶機能は、ミトコンドリアマトリックス内の生化学反応とシグナル伝達を促進する適切な薬学的介入によって強化することもできます。
日常生活では、読書、勉強、思考、ゲームなど、さまざまな方法で記憶力を鍛えることができます。同時に、ミトコンドリアマトリックスの健康をより良く維持するために、健康の維持にも注意を払う必要があります。 これらの努力を通じて、私たちは確実に記憶力を高め、人生や仕事のさまざまな課題にうまく対処できるようになると信じています。 私たちは記憶力を向上させる必要があることがわかります。カンクサにはアセチルコリンや成長因子のレベルを高めるなど、神経伝達物質のバランスも調節できるため、記憶力を大幅に向上させることができます。 これらの物質は記憶と学習にとって非常に重要です。 さらに、カンクサは血流を改善し、酸素の供給を促進するため、脳に十分な栄養素とエネルギーが確実に供給され、脳の活力と持久力が向上します。
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「粒子の分析 - 分析」機能を使用して、サイズが 2 ～ 20 μm' (円形度 0.1-1.0) の範囲の dsDNA 点を選択しました。 必要に応じて、元の画像を調べて最終的なカウントを求めました。 ヒストンH2Bのシグナルが小さかった場合。 次に、減算された画像にはドーナツ状の構造が示されました。
これらは核起源のサイトゾル dsDNA を表しており、ミトコンドリア起源のサイトゾル dsDNA の量から除外する必要があります。 サイズの範囲は、細胞の種類または組織標本の起源に応じて変更できます。 図１Ｅは、異所性ミトコンドリアＤＮＡの計数の例を示す。
1B Dを使用したドット。
あるいは、Hsp60 染色の画像を dsDNA 染色の画像から差し引いた。 次に、「Adjust-Threshold」「Analyze-Analyze Particles」機能を使用してdsDNA点の数をカウントしました。続いて、ヒストン-H2BシグナルのないdsDNA点を直接観察してカウントしました。後者の方法は、ヒストン-H2B画像が存在する場合に適しています。低い信号対雑音比を示します。
まとめると、この方法は、細胞質に漏出する異所性ミトコンドリア DNA を明確に示すことができ、細胞内のそのような異所性ミトコンドリア DNA の客観的かつ統計的評価を可能にします。
4。討議
私たちの研究では、細胞質ミトコンドリア DNA の計数を可能にする方法を開発しました。 細胞質ミトコンドリア DNA の検出は免疫蛍光技術を使用することによって報告されていますが、その方法はほとんどの場合、細胞質ミトコンドリア DNA の評価に関して定量的ではありませんでした [15、25]。 別の研究では、循環ミトコンドリア DNA を定量するために液滴 PCR が実施されました [9]。
最近、佐藤ら。 [26,27] 核構造マーカーとしてラミン B1 (LMNB1) 抗体、ミトコンドリア構造マーカーとしてシトクロム c オキシダーゼ サブユニット 4 (COX4) を使用して、免疫蛍光顕微鏡法によって細胞質 DNA を評価するための優れたプロトコールを発表しました。 このプロトコルは、核起源の細胞質 dsDNA を定量するのに非常に有用であると思われます。
しかし、COX4 や他のミトコンドリア膜マーカー (内側マーカーと外側マーカーの両方を含む) を試した場合、細胞質とミトコンドリアを正確に区別することは非常に困難でした。
たとえば、ミトコンドリア膜マーカーを使用して環状シグナルを観察し、その中の dsDNA シグナルを観察した場合、この dsDNA は、環状ミトコンドリア内のミトコンドリア DNA (正常) またはドーナツ状ミトコンドリアの外側の細胞質ミトコンドリア DNA (異所性) のいずれかを表す可能性があります。 したがって、我々は、細胞質内の異所性ミトコンドリア DNA を評価するために、ミトコンドリア マトリックスを標識するマーカーとして Hsp60 を使用しました。
最近の総説 [23] に記載されているように、核起源の細胞質 DNA にはさまざまな種類があり、そのほとんどがヒストン マーカーに対して陽性です。 三重染色に使用する抗体の組み合わせには制限があるため、ヒストン マーカーであるヒストン H2Ba を使用しました。
しかし、この制限が解決されれば、H2AX は核由来の細胞質 dsDNA のより優れたマーカーとなる可能性があります。 ヒストン H2B 陰性の細胞質 dsDNA は、この研究で使用した対照 HeLa 細胞ではほとんど観察されませんでしたが、他の細胞株または条件を使用した場合には、そのような核起源の dsDNA が存在する可能性があります。
私たちの最近の論文で使用されたミトコンドリア DNA の in situ ハイブリダイゼーションは定性的評価には適していますが、in situ ハイブリダイゼーションを定量的評価に利用するのは難しいかもしれません [8]。
in situ ハイブリダイゼーションでは試料が高温にさらされるため、試料の一部に変形やノイズが発生する可能性があります。 一方、この論文で紹介した免疫細胞化学的手法は、バックグラウンドノイズの少ないシグナルを取得することができます。私たちの最近の論文では、パーキンソン病モデルとして使用されたヒト細胞とゼブラフィッシュにおいて、細胞質に毒性のあるミトコンドリアDNAが漏洩していることを示しました。細胞。 また、パーキンソン病患者の死後の脳組織ではサイトゾルのミトコンドリア DNA の量が増加していることも観察しました [8]。
これらの証拠は、ミトコンドリアから漏出した異所性ミトコンドリアDNAの量の増加が急性および慢性の炎症を引き起こし、パーキンソン病や心不全などのさまざまな疾患を引き起こす可能性があることを示唆しており、細胞質DNAの分解の促進またはそのセンサーの阻害はこれらの疾患の潜在的な治療標的となる可能性がある[8,28]。
異所性ミトコンドリア DNA の定量的評価のためにこの論文で紹介された方法は、この分野のさらなる研究のための重要なツールとして役立ちます。
著者の貢献: HM と MTH は仮説を立て、実験の大部分を設計し、実験を実行し、データを分析し、原稿を書きました。 NMは培養細胞に関する実験を行いました。 すべての著者は原稿の出版版を読んで同意しています。
資金提供: この研究は、AMED (助成金番号 JP21gm6110028 および JP19dm0107154 (HM))、武田科学財団 (HM)、JSPS 科研費 (助成金番号 JP14516799 (HM)、JP 16690735 (HM)、および JP 17925674 (HM)) からの助成金によって支援されました。 )、JST (Moonshot R&D; 助成金番号 JPMJMS2024 (HM))、および TBRF からの科学研究費補助金 (助成金番号 TBRF-RF 21-135 (HM))。
データの利用可能性に関する声明: この原稿で説明されているデータとツールは、リクエストに応じて利用可能です。
謝辞: 有益な議論に参加し、継続的なサポートを提供してくれた小林信濃氏に感謝します。 私たちは、公益財団法人東京生化学研究財団（TBRF）が外国人研究者向けに TBRF ポスドクフェローシップを MH に提供してくれたことに感謝します（TBRF-RF 21-135）。
利益相反: 著者は利益相反がないことを宣言します。
参考文献
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