パートⅠ：常染色体優性多発性嚢胞腎患者の赤血球前駆細胞から生成された腎臓オルガノイド
Mar 23, 2022
詳細情報：ali.ma@wecistanche.com
Roberta Faciolio、Fernando Henrique Lojudice、他
序章
常染色体優性多発性嚢胞腎腎臓病（ADPKD）は、世界中で慢性腎臓病（CKD）の最も頻繁な遺伝的原因であり、最も一般的な遺伝性の単一遺伝子疾患の1つであり、推定1：400-1000 [1] .ADPKD（常染色体優性多発性嚢胞腎腎臓病）は、PKD1（タイプ1多発性嚢胞腎）およびPKD2（タイプ2多発性嚢胞腎）遺伝子の変異によって引き起こされ、それぞれポリシスチン-1（PC1）およびポリシスチン-2（PC2）をコードします。繊毛の変化と嚢胞の形成をもたらします。 両方のタンパク質は、組織の形態形成と機能だけでなく、多数の分子経路を調節します。 ただし、嚢胞形成の根底にある正確な分子メカニズムは不明であります。 嚢胞形成には、正常な対立遺伝子における生殖細胞変異とそれに続く体細胞変異（セカンドヒット）が必要であることが広く認められています[2,3]。 さらに、オーソロガスなマウスモデルの結果に基づいて、成熟した腎臓での急速で重度の嚢胞の成長には、追加の腎傷害（サードヒット）が必要であることが実証されています[4,5]。 人間では、ほとんどの2番目のヒットは腎臓の発達中に発生し、子宮内でも嚢胞の形成と成長につながるようです。 したがって、PKD1（1型多発性嚢胞腎）およびPKD2（2型多発性嚢胞腎）の変異に起因する腎疾患の重症度と進行速度は、遺伝子の不活性化のタイミング、腎臓の発達など、いくつかの要因の影響を受ける可能性があります病期、環境への影響、付随する腎病変の存在、および遺伝的変異の多様性。
ADPKD（常染色体優性多発性嚢胞腎）の病態生理学的メカニズムに関する無数のデータがありますが腎臓病）オーソロガスおよび非オーソロガスのマウスモデルを使用した研究から収集されたもので、嚢胞形成のヒト細胞モデルに焦点を当てた研究はほんの一握りしか利用できません[6]。 2007年、Takahashi et al。[Zは、体細胞を胚性の多能性幹細胞に再プログラムすることに成功し、それらを「人工多能性幹細胞」（iPSC）と名付けました。 それ以来、多くの体細胞源が動物またはヒト組織（hiPSC）[Z]からiPSC（人工多能性幹細胞）に再プログラムされており、成人の線維芽細胞が後者の主な源となっています。 2013年、Freedmanetal。[8] ADPKD（常染色体優性多発性嚢胞腎）の線維芽細胞から誘導されたhiPSC（誘導された多能性幹細胞）腎臓病）患者とポリシスチン-2の繊毛発現の低下を発見し、多発性嚢胞腎（PKD）の病態生理学を調査するためのそのような細胞の使用をサポートしています。 最近、Chenらは2016年に、赤血球前駆細胞からhiPS細胞を取得したと報告しました[9]。
過去数年にわたって、iPSC（人工多能性幹細胞）からの3-次元オルガノイドの生成に大きな進歩がありました[Z、10-12]。 主要な肝臓尿細管上皮オルガノイドは、腎臓組織および尿に由来する可能性があり、Schutgens et al。によって示されているように、これらのオルガノイドは、個別化された疾患モデリングのための重要なツールです。 [13]。その後の研究では、Freedmanetal。[14] 生成することができました肝臓市販のhiPS細胞株に由来するオルガノイドであり、ネフロンのすべての構造を生じさせる後腎腫瘤に存在する細胞型を生成するためのプロトコルを確立します。 次に、PKD1（1型多嚢胞性卵巣症候群）をノックダウンします肝臓疾患）またはPKD2（2型多発性嚢胞腎）遺伝子、これらの研究者はからの嚢胞形成を観察しました肝臓尿細管。 これらすべての先進的かつ革新的な技術を考慮して、ADPKD（常染色体優性多発性嚢胞腎）の循環赤芽球前駆細胞からiPSC（人工多能性幹細胞）を取得することを目指しました。腎臓病）患者とinvitroで腎臓オルガノイドの発生をテストして、器官形成に関与するステップを要約し、初期の嚢胞形成に関連するいくつかの病態生理学的イベントを引き起こそうとします。
方法患者の選択
ADPKD（常染色体優性多発性嚢胞腎）と臨床的に診断された2人の無関係な女性患者（PT1およびPT2）から血液サンプルを収集しました（PT1：66歳、eGFR 43.8 mL / min / 1.73 m2およびPT2：56歳、eGFR 60.2 mL / 1.73 m2あたりの分）、多発性嚢胞腎でフォローアップ。 サンパウロ連邦大学腎臓内科（UNIFESP）の外来クリニックと、1人の健康な女性から別のサンプルを収集しました。これは、技術を安定させ、正常化するためのコントロールとして機能しました。 ADPKD（常染色体優性多発性嚢胞腎）の診断は、Peiらによる超音波診断基準[15]によると、陽性の家族歴と腎嚢胞の存在に基づいていました（家族の血統はS1A図に示されています）。 両方の患者は嚢胞性の腎臓と肝臓を持っていました（磁気共鳴画像はS1B図に示されています）。 この研究は、大学の倫理諮問委員会によってレビューおよび承認されました（CEP UNIFESP、「Comite de Etica em Pesquisa da Universidade Federal de Sao Paulo」、Nr.1199。-0079-10 / 2018）。 研究の目的を説明するためのインタビューの後、患者と健康な対照の両方がインフォームドコンセントフォームに署名しました。
全血から分離された赤芽球前駆細胞の増殖血液サンプルは、室温でEDTA（抗凝固剤として）を含むバキュテナーチューブに収集されました。 次に、赤血球前駆細胞（EP）をRosetteSep法（15216; Stem Cell Technologies）で分離し、目的のEP集団を維持しながら、成熟したRBCや血小板などの不要な細胞を除去しました。 全血中のEP濃度が低いため、細胞を増殖させ、サイトカインとサプリメントを含む特定の培養培地（X-Vivo培地、Lonza）で培養しました。EP細胞は、トランスフェリン受容体（CD71）を使用したフローサイトメトリーによって同定されました。 GFPで標識されたマーカーとしてのグリコホリンA（GlyA）（S2図）。
赤血球前駆細胞の再プログラミング
増殖したEP細胞を収集し、5つのリプログラミング因子（Oct -4、Sox2、Lin28、L-Myc、およびKlf4）。 トランスフェクション（エレクトロポレーション）は、Lonza Nucleoファクターキットのエピソームベクター（ウイルスフリー、非組み込み）を使用して実行されました。 トランスフェクション後、細胞をReproTeSR特異的培地にプレーティングし、標準的な細胞培養条件下（37C、95％CO、5％O）で再プログラミングしました（Stem Cell Technologies）。
核型分析
再プログラミングプロセスが染色体の完全性を維持したかどうかを検証するために、UNIFESPの遺伝学部で核型分析を実施しました。細胞を5mlのiP中の10 0 ulのコルヒチン（0.08ug / ml）で処理しました。細胞周期停止を誘導するための細胞培養培地、続いて核腫脹を誘導するための0.075M低張KCl溶液の添加。 次に、細胞をメタノールと酢酸（3：1）の混合物で固定しました。 中期染色体を採取し、ライト染色を使用してGバンドの細胞形成分析を行いました（S3図）。
iPSC（人工多能性幹細胞）コロニーの特性評価
EP細胞は、典型的なiPSC（人工多能性幹細胞）コロニーを形成するエピソームベクターによって再プログラムされ、正常な核型を示しました（S3図）。 iPSC（人工多能性幹細胞）コロニーの特徴を、H9株細胞（hESC、ヒト胚性幹細胞、WA 0 9、米国ウィセル研究所から入手可能）に由来する確立された対照の特徴と比較しました（図1B）。 iPSC（人工多能性幹細胞）は典型的な形態を示したため、多能性マーカーは蛍光抗体法によって同定されました。 細胞を4％パラホルムアルデヒドで室温で30分間固定しました。 固定後、サンプルをPBSで3回洗浄し、5％PSAおよび0.3％Triton-X -100 / DPBSでブロックし、一次抗体（Cell Signaling、Ma、EUA）、つまりOCT4（1 ：400希釈）多能性のテストとして。 翌日、新しいスライドを準備し、PBSで洗浄し、Alexa Fluor二次抗体（1：200希釈、Cell Signaling）とインキュベートし、DAPI（1：1000、Invitrogen、MA、USA）を核に添加しました。身元。
図1.iPS細胞の生成と特性評価(人工多能性幹細胞)。 iPSCは、健康な対照（HC）と2人の異なるADPKD患者（PT1とPT2）からの拡張赤血球前駆細胞（EP）から再プログラムされました。
A.腎臓オルガノイドの概略的な段階的生成B.iPSCの類似性（a。市販のH9胚性細胞からのiPSCの典型的な画像。b。健康な対照からの前駆赤芽球細胞からのiPSC）
C.iPSCコロニーの形態D.EVOSfl倒立デジタル蛍光顕微鏡で観察されたiPSC多能性の特性評価。
OCT4抗体標識は、HC、PT1、およびPT2コロニーの多能性の性質を特徴付ける多能性マーカーとして使用されました。
細胞核はDAPIで標識されました（図1Bのスケールバー：200μm;図1Cのスケールバー：1000μm;図1DのスケールバーHC / PT2：1000μm;図1DのスケールバーPT1：200μm）。
iPSC（人工多能性幹細胞）が3つの胚葉すべてに分化する能力
iPSC（人工多能性幹細胞）は、mTeSR1培地（Stem Cell Technologies、BC、Canada）でマトリゲル（1：10、BD Biosciences、NY、EUA）でコーティングされた6-ウェルプレートで培養されました。 iPSC（人工多能性幹細胞）の分化を防ぐために、顕微鏡下でピペットチップを使用して機械的に断片化することによりコロニーを手動で継代するか、Gentle Cell（Life Technologies）を使用した酵素消化によりコロニーを分離しました（S4図）。 これらの方法を使用して、iPSC（人工多能性幹細胞）を22回の連続継代で維持し、細胞が再プログラミング因子を適切に組み込んだことを確認しました。 次に、iPSC（人工多能性幹細胞）を刺激して、STEMdiff Trilineage Differentiationキット（Stem Cell Technologies）を使用して3つの胚葉に分化させました。 5日後、中胚葉および内胚葉の系統年齢特異的マーカーの分析のために細胞を回収し、7日後、STEMdiff Trilineage Differentiationプロトコル（S5図）に従って外胚葉について分析しました。
qRT-PCRによる3つの生殖系統すべての分子特性
3つの胚葉の培養物からのトータルRNAは、GE RNA Spin Miniキット（GE Healthcare、米国）を使用して抽出し、High Capacity Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems、米国）を製造元の指示に従って使用してcDNAに変換しました。 定量的リアルタイムPCR（gRT-PCR）は、SYBR Green PCRキット（Applied Biosystems、USA）を使用して、製造元のプロトコルに従って実行されました。mRNA発現レベルは、2^Ct法を使用して計算されました。 ヒドロキシメチルビランシンターゼ（HMBS）とグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）を内部対照として使用し、OCT4の発現を定量的対照として使用しました。 SOX17の発現は内胚葉への分化を特定するために使用され、CXCR4は中胚葉への分化を特定するために使用され、PAX6は外胚葉への分化を特定するために使用されました（S6図）。 すべてのプライマー配列はS1表に指定されており、効率曲線は各プライマーペアについて評価されました。
異なる胚葉の蛍光抗体法
iPSC（人工多能性幹細胞）は、6ウェルプレートのカバーガラス上で分化するように誘導されました。 分化後、カバースリップを元のウェルから取り出し、新しいプレートに移し、そこで細胞を上記のように4パーセントのパラホルムアルデヒドで固定し、次にPBSで洗浄した。 OCT4（1：400; Cell Signaling）、CXCR4（1; 100; Cell Signaling）、PAX6（1：100; Thermo Fisher）、およびSOX17（1：100; R＆D Systems）に対する一次抗体を使用しました。 Alexa Fluor二次抗体（1：200; CellSignaling）。
iPSC（人工多能性幹細胞）からの腎臓オルガノイドの分化
レナロオルガノイドは、Cruzらによって記述されたプロトコルに従って生成されました。 [6]いくつかの適応があります。 簡単に説明すると、HCおよび2人のADPKD（常染色体優性多発性嚢胞腎）患者からの50、000 iPSC（人工多能性幹細胞）を使用して、Accutase剥離溶液（Stem Cell Technologies）で単一細胞の懸濁液を作製しました。 単一細胞に10uMRho-kinase阻害剤（Y27632、Stem Cell TechnologiesまたはStemgent）を補充しました。 16時間後、培地を1mLのmTeSR1+ 2.5％マトリゲル+10μuMY27632に交換しました。20時間後、培地を1mLのmTeSRIのみに交換しました。14時間後、培地を交換し、細胞を誘導しました。 6 uM CHIR99021（AT104;幹細胞またはStemgent GSK -3b阻害剤/Wnt経路アゴニスト）+ Advanced RPMI（Thermo Fisher）+ Glutamax（Life Technologies）+ 10 ug / ml抗生物質（アンピシリン; 1：1000; Gibco ）。 最後に、36時間後、培地をAdvanced RPMI（Thermo Fischer）とGlutamax（Thermo Fischer）とB27サプリメント（17504-044; Life Technologies）と抗生物質を含むDRB培地に交換しました。 DRB培地は28日間3日ごとに交換されました。 この期間（28日）は、オルガノイドが顕微鏡で見えるのに十分でした。
RT-PCRによるオルガノイドの分子特性
半定量的遺伝子発現は、胚形成過程でRT-PCRによって評価され、0日目（iPSC（人工多能性幹細胞））および14、21、28、および14日目に形成された細胞構造からトータルRNAが精製されました。分化誘導の35日後。 WT1（発生中の腎臓）、AQP1（近位管）、およびECAD（嚢胞上皮マーカー）の発現を評価しました。GAPDHを内部対照として使用しました。 OCT4の発現を定量的基準として使用した。
結果
赤血球前駆細胞（EP）からiPSC（人工多能性幹細胞）を取得する
赤血球前駆細胞から腎臓オルガノイドを取得するために採用されたプロトコルが要約されています。 EPの拡大により約20日後に1x10度の細胞が得られ（S2A図）、約2か月後、EPはマーカーCD71およびGly Aの発現によって同定されました。分離法の効率により発現が明らかになりました。細胞の88％ CD71陽性であり、57.4パーセントがGly A陽性でした（S2BFig）。
細胞がEPであることを確認した後、リプログラミング因子（Oct -4、Sox2、Lin28、L-Myc、およびklf4）をトランスフェクトし、リプログラミング用の特定の培地（ReproTeSR、Stem Cell Technologies）で維持しました。約5日間。 iPSC（人工多能性幹細胞）は、同じ細胞培養に存在する再プログラムされていない細胞とは異なる形態のコロニーを形成することにより、典型的な細胞特性を発達させました。 市販のH9細胞株（Eig 1B）のコロニーに類似した典型的なiPSC（人工多能性幹細胞）様コロニーが観察されるまで細胞をモニターしました。iPSC（人工多能性幹細胞）コロニーも比較的大きなサイズで認識されました。タイトなセルパッキング、明確に定義された均質な形状、および規則的なエッジ。 同定は、フィーダーフリーの再プログラミング培地（Eig 1C）での分化細胞からのコロニーの低成長によって促進されました。 図1Dに示すように、HCおよびADPKD（常染色体優性多発性嚢胞腎）患者（PT1およびPT2）のiPSCコロニー間で、コロニーの形態および多能性マーカーに関して検出可能な差異は見つかりませんでした。
iPSC（人工多能性幹細胞）は、3つの胚葉に分化する能力によってさらに特徴づけられました。 HCからの細胞における胚葉発達の進行の典型的な画像をS5図に示します。3つの胚葉の発達は、典型的な形態（Eig 2A）および分化マーカー、すなわち内胚葉のFOXA2の免疫蛍光標識によって検証されました。 、中胚葉には平滑筋アクチン（SMA）、外胚葉にはSOX2（Eig2B -2 D）。 抗体のネガティブコントロールをS7に示します。図2Eは、RT-PCRで検出された、内胚葉（SOX17）、中胚葉（CXCR4）、および外胚葉（PAX6）の特定のマーカーの遺伝子発現レベルを示しています。
図2.3つの胚葉の特性。 健康管理（HC）およびADPKD1患者（PT1およびPT2）。
A.3つの胚葉の典型的な形態。 胚葉は、特定の抗体を使用した免疫蛍光染色によって特徴づけられました。 B.内胚葉（FOXA2）、
C.中胚葉（SMA）およびD.外胚葉（SOX2）。 細胞核はDAPIで染色されました。 最後の列は、マージされた画像を示しています。
E. OCT4の遺伝子発現は、iPSCの多能性を示し、SOX17は内胚葉のマーカー、CXCR4は中胚葉のマーカー、PAX6は外胚葉のマーカーでした（n=2）。
iPS細胞によるOCT4発現は、内部の定量的コントロールとして使用されました。 OCT4の発現は、3つの胚葉の細胞では検出できませんでした（スケール：200μm）。
iPSC（人工多能性幹細胞）からの腎臓オルガノイドの生成
三次元腎構造は、HCおよび両方のADPKD（常染色体優性多発性嚢胞腎）患者に由来するiPSC（人工多能性幹細胞）から、胚発生を再現するステップに従って生成されました。 図3は、それぞれの胚性構造を取得するために必要な手順を示しています。 iPSC（人工多能性幹細胞）コロニー（Eig 3A）をアキュターゼ（図3B）と分離して、単一のiPSC（人工多能性幹細胞）（図3C）を得た。 通常の胚形成過程を考慮すると、コロニーは胞胚、次に原腸陥入に分化すると予想されますが、細胞は自発的にアポトーシスを起こすため、培養中のiPSC（人工多能性幹細胞）の自発的分化は依然として課題です[16]。 この望ましくない結果を回避するために、シグナル伝達のROCK阻害剤（10μMRhoキナーゼ阻害剤Y27632）を単一細胞段階の16時間後に添加しました。 ROCK経路を阻害すると、細胞が死の経路を誘発するのを防ぎ、細胞が生き残り、分化プロセスに進むように調整できるようになります。 その後、iPSC（人工多能性幹細胞）は、スフェロイド空洞の存在を特徴とするエピブラスト段階に達するまで成長しました（図3D）。 次に、強力なGSK -3b阻害剤/Wnt経路アゴニスト（CHIR99021）を追加し、続いてDRB培地を追加して、上皮間葉転換（図3Eおよび3E）、最後に間葉上皮転換（図3Eおよび3E）を誘導しました。図3G）; これらのステップにより、上皮化と尿細管前凝集体および腎小胞の連続形成が可能になり（Eig 3H）、最終的に尿細管オルガノイドの形成が可能になりました（図3D）。 これらのinvitro胚形成ステップはすべて、HC患者とADPKD（常染色体優性多発性嚢胞腎）患者の両方に由来する細胞で類似していた。
尿細管構造の存在は、免疫蛍光法による特定のマーカーの発現によって確認されました：近位尿細管のNHE3とAQP1（Eig4A）および糸球体のNPHS2（Eig 4B）対照的に、AQP2標識は検出されませんでした（Eig 4B）。方法論では、後腎腫瘤の発生のみが許可され、尿管芽の発生は許可されませんでした。 マーカーECADは、フォルスコリンの非存在下では検出されませんでした（図4B）。
前駆腎の発達過程全体で発現する特定のマーカーの存在を確認するために、すべてのサンプル（HC、PT1、およびPT2）を分化過程全体の5つのポイントで収集しました：日0（iPSCs（人工多能性幹細胞））、14、21、28日目、そして35日目（嚢胞誘導の7日後）。 図5A-5Cに示すように、遺伝子発現の時間経過により、胚発生過程での分化が明らかになりました。 多能性マーカーOCT4はiPSCによって発現されましたが（O日目）、そのレベルは14日間で減少し、分化後に非常に低いレベルに達しました。 対照的に、後腎間葉（WT1）および近位尿細管（AQP1）の特定のマーカーの発現は、分化プロセスが14日目までに開始され、21日目までにプラトーに達すると徐々に増加しました。図5Dは、嚢胞形成であるECADの発現を示しています。マーカー、フォルスコリンによる嚢胞誘導の35日目、すなわち7日後。 フォルスコリンがない場合、ADPKD（常染色体優性多発性嚢胞腎）患者でさえ、ECADの発現は非常に低かった。 しかし、フォルスコリンを追加した場合（28日目）、両方の患者がECAD発現の増加を示しました。 しかし、フォルスコリンの存在下でも低レベルのECAD発現を維持したHCオルガノイドでは同じパターンは観察されませんでした。
Eig6に示すように、フォルスコリンで刺激されたオルガノイドから形成された嚢胞の存在は、ADPKD（常染色体優性多発性嚢胞腎）患者で明らかでした。 上のパネルは、フォルスコリン（Eig6Aa）を追加する前の28日目のオルガノイドの画像を示しています。Eig6Ab（パノラマビュー-4 X）および6Ac（20Xビュー）は、フォルスコリンは、両方の患者（PT1およびPT2）からのサンプルに嚢胞様構造の存在を示していますが、HCサンプルには存在していません。 嚢胞の存在は、免疫蛍光染色によっても確認されました（図6B）。ECAD標識はHCオルガノイドでは検出されませんでしたが、両方の患者のオルガノイドで明確に観察されました。 興味深いことに、嚢胞内腔の存在も観察できます。
図3.管状オルガノイドの生成。
HC、PT1、およびPT2グループから生成されたiPSCからの28日での上皮尿細管腎オルガノイドの生成の位相差画像。 最初の36時間、iPS細胞は3D培養で維持されました。
次に、それらを分離し、単一細胞に形質転換し、Y -27632で処理しました。これにより、細胞の再編成と生存が可能になり、エピブラストスフェロイドが生成されました（d）。
次に、CHIR99201とDRBを添加し、Wnt /-カテニン経路を活性化し、管状オルガノイドへの分化を可能にしました（I）。
ADPKD患者とHCドナーに由来するスフェロイド間の形態は類似しています。 （aおよびfのスケールバー：1000μm; b、cd、e、g、hおよびiのスケールバー：200μm）。
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