2型糖尿病のZucker糖尿病脂肪ラットにおける腎損傷、GRP78、およびオートファジー関連因子に対するCistanche Shenqiwanの効果

通常の生理食塩水の量。 ラットに 4 週間連続投与した。 ラットの全身状態を定期的に観察した。 空腹時血糖 (FBG) と 24- 時間の尿中微量アルブミン (24 h U-mAlb) レベルを測定しました。 腎組織を染色し、形態を観察した。 超微細構造は、透過型電子顕微鏡によって観察されました。 ラット腎組織における GRP78、Beclin-1、および LC3 の mRNA レベルをリアルタイム PCR で調べ、タンパク質レベルをウェスタンブロッティングで調べました。結果 モデル群と比較して、Shenqiwan 群のラットは

毛皮の光沢が改善され、体重が増加し、活動が活発になりました。 FBG と 24 h U-mAlb レベルの両方が減少しました (P < 0.05)。 の腎臓モデル群のラットの拡張した糸球体毛細血管、不規則に肥厚した基底膜、拡大したメサンギウム領域、および分節性硬化症。 これらの腎臓では、腎尿細管萎縮および腎間質線維組織も観察されました。 これらの病理学的変化は、Shenqiwan グループで軽減されました。 モデル群と比較して、Shenqiwan群ではGRP78の遺伝子レベルとタンパク質レベルの両方が減少しました(P < 0.05)。 ベクリンのタンパク質レベル-1

減少した (P < {{0}.05); LC3のタンパク質レベルは増加した(P < 0.05)。 結論:Shenqiwan は、小胞体ストレスを軽減し、オートファジーを強化することにより、ZDF ラットの腎障害を軽減し、糖尿病性腎疾患の進行を遅らせる可能性があります。

 

キーワード: 神旗湾;2型糖尿病; 糖尿病性腎疾患; 小胞体ストレス;オートファジー; GRP78; Zucker 糖尿病脂肪ラット

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糖尿病性腎疾患(DKD) は重要な微小血管合併症です。糖尿病そして、その大きな原因末期腎臓病[1]。 DKDは重要糖尿病の微小血管合併症と末期腎不全の主な原因[1]。 DKD 患者は、持続性タンパク尿を呈し、持続的に減少することがある糸球体濾過率[2]。 のDKDの病因は複雑であり、最近の研究では、腎臓の小胞体ストレス (ERS) が末期腎疾患の最も一般的な原因であることが示されています。 （小胞体ストレス（ERS）とオートファジーもDKDと密接に関連しており、それらの病因の研究はDKDの治療に重要である可能性があります. DKD は、中国医学の喉の渇き障害のカテゴリーにおける「低絶滅」に似ています。
のどの渇きと過度の飲酒と排尿の典型的な症状は、金鯱八尾 (金星占いの要点) に記録されています。腎気丸薬が主な治療処方として提案されています。 金匮要略は、喉の渇きと多尿の典型的な症状を記録し、腎気丸薬主な治療法として。 TCM による DKD の治療は、確かに腎機能を効果的に保護することができ、安全で信頼できる特徴があります [5-6]。 漢方薬による DKD の治療は、腎機能を効果的に保護することができ、安全で信頼できる特徴があります [5-6]。 腎臓の調子を整え、陽を助ける腎気丸薬の有効性は、関連する研究で確認されています[7]。 私たちの以前の研究もまた、私たちの以前の研究では、腎臓の気の丸薬が糖尿病マウスの腎臓組織の構造と機能に優れた保護効果をもたらすことも示されました[8]。 本研究では、Zucker 糖尿病脂肪ラット (ZDF) の腎組織損傷、ERS、およびオートファジー関連因子に対する腎気ピルの効果を観察しました。 この研究では、ZDF ラットにおける腎気の丸薬の効果を観察することにより、腎障害の考えられるメカニズムを調査しました。腎組織の損傷、ERSおよび腎気丸薬によって媒介されるオートファジー関連因子。

1 材料
1.1 実験動物
20 12- 週齢の SPF 雄 ZDF ラット (体重 390-410 g、2 型糖尿病の誘導を完了するために 5C08 の高品質の齧歯動物用飼料を 4 週間与えた) と 7 12- 週-古い SPF オス Zucker Lean (ZL) ラット (体重 350-380 g) は、Beijing Viton Lehua Laboratory Animal Technology Co. から購入しました。すべてのラットは、中日友好病院の臨床医学研究所のバリア環境で飼育されました。 、ライセンス番号: SYXK (北京) 2016-0043、プラットフォームはバリア内に独立した換気システムを提供し、12-時間の明暗の交互、23-25度の室温を維持しました、部屋の相対湿度は 50% -60% です。 給餌期間中は、すべてのラットに自由に飲水と給餌をさせた。

1.2 倫理審査
動物実験は、北京伝統中国医学大学 (BUCM) の学術委員会の実験動物倫理小委員会によって承認番号 BUCM-4-2021102801-4034 で承認されました。
1.3 主な医薬品と試薬
タブレット（Shu Di Huang、Shan Yu Fei、Shan Yao、Mudan Pi、Fu Ling、チスタンケ、Ze Xie、Gunner's Fructus、Gui Zhi）の煎じ薬腎気ピルは北京同仁堂から購入した。生理食塩水、仕様：500 mL、山東花鹿製薬株式会社提供Century Biotechnology Co., Ltd.)、mRNA Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific, Inc.)、RNA TRIzol Reagent (RNA TRIzol Reagent)、RNA TRIzol Reagent (RNA TRIzol Reagent)。 RNA TRIzol Reagent (Beijing Solabao Technology Co., Ltd.)、Rat Urine Microalbumin ELISA Kit (Jiangsu Kote Biotechnology Co., Ltd.、ロット番号 KT8560-A)、GRP78 BiP 抗体、LC3B 抗体および Beclin{ {5}}抗体（Abcam、英国）（バッチ番号：ab108613、ab192890、ab207612）、ウサギ抗GAPDHポリクローナル抗体（Proteintech、米国）、ヤギ抗ウサギIgG（H＆L）-HRP（Beijing Baiao Yijie Technology Co.株式会社）。

 

血糖測定器、血糖測定器（Shanghai Roche Diagnostic Products Co. Ltd.）、低温高速遠心分離機（Eppendorf、ドイツ）、蛍光定量PCR装置、二重垂直電気泳動装置およびトランスファー電気泳動装置（Burroughs Life Medical Products） Co. Ltd.)、ゲル イメージャー (Protein Simple、米国)、光学顕微鏡 (ライカ、ドイツ)、透過型電子顕微鏡 (ライカ、ドイツ)、およびゲル イメージャー。 (ライカ、ドイツ)、透過型電子顕微鏡 (日立、日本)。

2つの方法
2.1 実験薬の調製
の煎じ薬腎気丸薬「腸チフス処方の用量と割合に関する研究」[2015 ]、および実験に必要な煎じ薬の用量は次のとおりでした:Shu Di Huang 24 g、Shan Yu Fei 12 g、チスタンケ10 g、Shan Yao 12 g、牡丹皮 9 g、Fu Ling 9 g、Ze Xie 9 g、Gunnera 3 g、Gui Zhi 3 g。 薬物を蒸留水に 2 時間浸した。 次いで、煎じ薬を３０分間濃縮し、滅菌ガーゼを通して濾過した。 ハーブを 30 分間煎じてから、残りの薬を加えて 1 時間煎じます。 溶液の温度を室温まで下げた後、溶液を濃縮し、滅菌ガーゼを通して濾過し、濾液を包装して-20度で保存する。 薬の保存期間は 1 週間以内とし、溶液は投与前に室温に戻す必要があります。

2.2 動物モデルの確立とグループ化
ZDF ラットを 5C08 高脂肪食で 4 週間誘導し、12 週齢で尾端採血により血糖を測定しました。 腎気丸剤群のラットには腎気丸剤の水性煎剤を投与し、「実験動物における疾患モデル」[10]の計算式に従って、1 匹あたり 8.12 g/kg の 1 日投与量を計算し、投与濃度をは 0.812 g/mL であり、モデルおよび対照群のラットには、対応する量の生理食塩水が 4 週間与えられました。

2.3 ラットの全身状態と空腹時血糖（FBG）検査
ラットの全身状態を毎日観察および記録し、体重を定期的に測定した。 12 週齢および 16 週齢の終わりに、8 時間の絶食後にラットの尾の先端から血液を採取し、Roche 血糖測定器と試験紙で FBG を測定しました。 2.4 24-時間の尿中微量アルブミン（24-h U-mAlb）は、16週齢の終わりに測定され、24-時間のU-mAlb濃度は指示に従って測定されましたLISA キットの。

2.5 腎組織標本の収集
16 週齢の終わりに、すべてのラットを 8 時間絶食させました。 麻酔後、腹腔を開いて両側の腎臓を露出させ、腹膜をそのまま摘出して剥がした。 腎皮質を分離し、3 μm のパラフィン切片を調製するために 4% パラホルムアルデヒドで部分的に固定しました。 部分的に 1 mm3 の組織ブロックに切断し、超薄切片の調製のために 2.5% グルタルアルデヒドで固定しました。 残りの腎臓組織は、リアルタイム PCR およびウェスタンブロッティング アッセイのために -80 度で保存されました。

 

2.6 腎臓組織の形態観察の応用
PAS染色、マッソン染色、ヘキサアンモニウム銀-ヘマトキシリン-エオジン染色を用いて観察した。腎臓の組織病理学的変化光学顕微鏡下で画像を取得します。 透過型電子顕微鏡を適用して腎臓組織の超微細構造の変化を観察し、画像を収集しました。

 

2.7 リアルタイム PCR アッセイ
凍った腎臓組織氷上で粉砕し、TRIzol試薬を加えて全RNAを抽出し、半径9.5cm、4度で遠心分離した。 12 000 r/min、10 分間の遠心分離によって上清を抽出し、クロロホルムで 15 分間遠心分離しました。 上清を再び室温で１０分間、１５分間遠心分離し、上清を７５％エタノールで洗浄した。 mRNAレベルでの発現。 プライマーは、Primer Premier 5.0 ソフトウェアを使用して設計され、Shanghai Bioengineering Co. Ltd によって合成されました。プライマー配列は次のとおりです。