自己反応性T細胞のホーミングと炎症細胞の浸潤
Sep 05, 2022
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実験的自己免疫ブドウ膜炎 (EAU) は、炎症誘発性サイトカインと活性酸素種の同時増加を伴う自己免疫 T 細胞の浸潤を特徴とするヒト自己免疫ブドウ膜炎の動物モデルです。 この研究は、ベタインが Lewis ラットの EAU の進行を調節するかどうかを評価することを目的としていました。 EAU は、光受容体間レチノイド結合タンパク質 (IRBP) による免疫化と、ビークルまたはベタイン (100 mg/kg) の経口投与を 9 日間連続して行うことで誘導されました。 屠殺時に実験用ラットから脾臓、血液、および網膜をサンプリングし、T 細胞増殖アッセイ、血清学的分析、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、および免疫組織化学に使用しました。 Ｔ細胞増殖アッセイは、免疫後９日目のインビトロアッセイにおいて、ベタインがＩＲＢＰ抗原に対する脾臓Ｔ細胞の増殖にほとんど影響を与えないことを明らかにした。 血清学的分析は、血清スーパーオキシドジスムターゼのレベルが、ビヒクル処置群と比較してベタイン処置群で増加したことを示した。カンカエキスベタインの抗炎症効果は、EAU ラットの網膜における血管細胞接着分子 I やインターロイキン-1などの炎症促進関連分子のダウンレギュレーションによって確認されました。 組織病理学的所見は、イオン化カルシウム結合アダプター分子 I 免疫組織化学の所見と一致し、ビヒクル処置群と比較してベタイン処置群で網膜および毛様体の炎症が有意に抑制されたことをさらに検証しました。 本研究の結果は、ベタインが抗酸化および抗炎症作用を通じて EAU の緩和に関与していることを示唆しています。
キーワード:抗炎症、抗酸化、ベタイン、実験的自己免疫性ぶどう膜炎、網膜
序章
自己反応性 T 細胞のホーミングと単球などの炎症性細胞の浸潤は、EAU のブドウ膜炎と網膜炎を引き起こします [6]。 網膜は、酸化ストレスを受けるグリア細胞の活性化による炎症から損傷を受けます[7]。
トリメチルグリシン (CH: NO:) とも呼ばれるベタインは、フルクタス リキア由来のアルカロイドで毒性のない天然物質であり、代表的な抗酸化物質です [8]。 ベタインは、核因子誘導キナーゼ/I κ B キナーゼおよびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ [9] を介した核因子 kB の関与を通じてラットの加齢に伴う炎症を改善し、インターロイキン (IL) を含む炎症性サイトカインを抑制することによってヒトの心血管疾患を改善します{{ 6}} および腫瘍壊死因子-a(TNF-a)[10]、およびデキストラン硫酸ナトリウム誘発結腸腫瘍形成[11]。カンカ・ツブロサのレビュー、さらに、ベタインは、糖尿病性網膜炎のラットの病理学的血管新生/血管新生を防ぎ [12]、網膜神経節細胞を保護して、緑内障の動物モデルの視力を向上させました [13]。 しかし、ぶどう膜炎におけるベタインの影響の根底にある正確なメカニズムについてはほとんど知られていません.
この研究では、EAU の緩和におけるベタインの有効性が評価されました。 組織病理学的検査とサイトカイン測定に基づいて、EAUにおけるベタインの抗炎症効果を調査しました。 さらに、抗酸化物質としてのベタインの特定のメカニズムが EAU のラットで評価されました。
材料および方法
動物
雌雄のルイス ラット (生後 7 ～ 9 週、Orient Bio Inc、京畿道、韓国) を実験室条件下 (12- 時間の明/暗サイクル、温度 23±2 度) で施設に収容しました。 すべての実験手順は、済州国立大学の実験動物の管理と使用に関するガイドライン (許可番号:2020-0012) に従って実行されました。 すべての動物プロトコルは、実験動物の管理と使用を含む国際法および NIH ポリシーに準拠していました (NIH 発行番号 85-23、1985 年、1996 年改訂)。
EAUの誘導
等量のウシ間光受容体レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）（１ｍｇ／ｍｌ；ＰＴＡＲＳＶＧＡＡＤＧＳＳ－ＷＥＧＶＧＶＶＰＤＶ、Ｋｏｍａｂｉｏｔｅｃｈ、ソウル、韓国）およびフロインドの完全アジュバント（ＣＦＡ ) 後肢の足蹠に me mg/mL の Mycobacterium tuberculosis H37Ra (Difco Laboratories Inc.、Detroit、MI、USA) を添加した。
実験グループ
EAU に対するベタイン (図 1A) の効果を評価するために、4 つの実験グループが次のように指定されました。 CFA コントロール (n=8);EAU とビヒクル (n=8);および EAU とベタイン (n=8)。ベタインの治療効果をテストするための治療における用量 (1 0 mg/kg 体重/日、B2629、Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) は、以前の研究 [14] に基づいて選択されました。 ラットは、免疫化後０日から免疫化後９日までベタインで経口的に処置された。
組織の準備
免疫後９日目に、ＣＯ ２ ガス吸入による深い麻酔下でラットを屠殺した。シスタンシェ英国組織病理学的検査用の組織をパラフィンワックスに包埋し、切片にした
ミクロトーム (RM 2135; Leica, Nussloch, Germany) で 5 um の厚さにし、ヘマトキシリンとエオシンで染色します。 血液と網膜は、血清分析とリアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 分析のために -80 度で保存されました。
T細胞増殖アッセイ
各グループの動物からの脾臓単核細胞は、以前の研究[15]で説明されているように解離および懸濁されました。 次に、10 ug/ml IRBP (最終濃度) をウェルに加えた。 IRBP で 48 時間刺激した後、細胞を 1 μCi の 1 H-メチルチミジン (比活性 42 Ci/mmol; アマシャム、アーリントンハイツ、イリノイ州、米国) で 18 時間。 次に、細胞を採取してチミジンの取り込みを測定しました。
ニシンはアンチエイジングできる
血清学的分析
サンプリング日にラットを屠殺し、心臓から血液を採取した。 遠心分離機 (VS-5500 CFN; Vision Scientific、大田、韓国) を使用して、全血サンプルを血清と血球に分離しました。 血清中のスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）活性は、SODキット（ab65354; Abcam、Cambridge、UK）を使用して評価されました。
免疫組織化学
免疫組織化学は、以前の研究 [16] で説明されているものと同じプロトコルを使用して実行されました。和光純薬工業株式会社、大阪、日本)、CD68(ED1;1:800;MCA341、Serotec、Kidlington、UK)、およびグルタミン合成酵素(GS)(1:5、000;MAB302、Chemicon In -ternational, Temecula, CA, USA) をそれぞれミクログリア、マクロファージ、ミュラー細胞のマーカーとして使用しました。
リアルタイム PCR
すべてのグループの眼球の全 RNA (グループあたり n=5) を TRIzol RNA Isolation Reagent (Life Technologies、Thermo Fisher Scientific、Carlsbad、CA、USA) で分離し、CellScript M All-in を使用して cDNA を調製しました。 -1 つの 5X First Standard cDNA Synthesis Master Mix (CellSafe、京畿道、大韓民国)。 プライマー情報を表 1 に示します。PCR は、2x SYBR Green (PhileKorea、ソウル、韓国) を使用して MIC サイクラー (BMS、クイーンズランド、オーストラリア) と次のプログラムで実行されました: 55 サイクルの変性 (5 秒、95程度）、アニーリング（20秒、60度）、およびエクステンション（10秒、72度）。
ウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析は、以前の研究[16]で説明したものと同じプロトコルで実行されました。シスタンシェ・ウィルクングKelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1)(1:1,000;abl19403,abcam,MA,USA)、Nuclear factor erythroid-2- re-lated factor2(Nrf2)を含む一次抗体)(1:1,000;sc-722、サンタクルーズ、カリフォルニア州、米国)。
統計分析
すべての測定値は、3 つの独立した実験の平均として報告されます。 すべての値は、平均の平均標準誤差 (SEM) として表示されます。 一元配置分散分析を使用して結果を分析した後、多重比較のためのスチューデント-ニューマン-クールス事後検定を行いました。 p値<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" significance.="" immunostaining="" was="" analyzed="" semi-quantitatively="" based="" on="" the="" positive="" areas="" in="" the="" photographs="" using="" imagej="" software="" (national="" institutes="" of="" health,="" bethesda,="" md,="" usa).eau="" was="" histopathologically="" evaluated="" using="" a="" method="" modified="" from="" a="" previous="" study="" [17].="" antibody-positive="" areas="" were="" measured="" as="" follows:(1)three="" different="" sections="" from="" each="" rat="" (n="3" animals="" per="" group)="" were="" used;="" then,="" (2)="" the="" percentage="" of="" the="" stained="" area="" [(positive="" area/total="" area)x100(%)]="" was="" calculated.="" the="" total="" area="" included="" all="" layers="" of="" the="" retina.="" these="" results="" are="" presented="" as="" the="">
結果
Betaine had no immunomodulatory function in EAU The T cell proliferation assay was performed to determine whether betaine affected the proliferation of IRBP-specific T cells (Fig.1B). No significant changes were observed between the EAU-induced groups in medium only and those that were IRBP-stim-ulated (medium only, p>0.05 vs.EAU+Vehicle; IRBP stimulation, p>0.05 vs.EAU プラス車両)。 これらのデータは、ベタインが IRBP 特異的 T 細胞またはその自己反応性に関与していないことを示しています。
ベタインは EAU の血清 SOD レベルをアップレギュレートしました
酸化的修飾のマーカーとしてSODを使用して、血清中の酸化的損傷を評価しました。 正常群とCFA群の間に有意差は観察されなかった。 SOD 活性は、通常のコントロールおよび CFA グループのレベルと比較して、EAU とビヒクル グループで大幅に減少しました。 ベタイン治療は、SOD活性のレベルを正常な対照群およびCFA群のレベルに有意に回復させました（図2）。 この結果は、ベタイン治療が EAU ラットの酸化ストレスを抑制したことを示しています。
ベタインは、EAU 誘発ラットの毛様体および網膜における Ibal 陽性細胞の浸潤を減少させた
毛様体は血管が豊富なため、主要な炎症細胞浸潤部位です[18]。 正常群と CFA 群では毛様体に少数の円形細胞しか検出されなかったが（図 3A、3B）、EAU 誘導群では円形型細胞の浸潤が確認された（図 3C の矢印）。 、3D)。 正常（図３Ｅ）およびＣＦＡ（図３Ｆ）群は、ＩｂａＩ免疫反応性について観察されたものと同様の結果を一貫して示した。 Ibal陽性の免疫反応性は、EAUとビヒクルおよびEAUとベタインのグループで増加しました（図3G、3Hの矢印）。 しかしながら、ＩｂａＩ陽性細胞の数は、ＥＡＵ＋ビヒクル群と比較して、ＥＡＵ＋ベタイン群において有意に減少した（図３Ｉ）。 また、毛様体における炎症細胞浸潤の正確な位置を評価するためのさらなるアプローチとして、EDIの局在を分析しました.ED1-陽性細胞は、正常細胞(図3G)およびCFA細胞(図3K)ではほとんど検出されませんでした。 )グループ。 対照的に、多数の ED1- 陽性細胞が、EAU とビヒクルおよび EAU とベタインのグループで検出されました (図 3L、3M の二重矢印)。シトラスバイオフラボノイドED1- 陽性細胞数の半定量分析により、ベタイン処理が EAU 誘発ラットの毛様体における炎症細胞の浸潤を抑制することが確認されました。
次に、網膜の病理組織学的変化を調べました（図4）。 EAUの網膜では少数の炎症細胞が検出されましたが、正常およびCFAラットの網膜では検出されませんでした（図4A〜4D）。 病変は、EAU の重症度に応じて組織病理学的にスコア付けされ [17]、網膜炎症の緩和が明らかになりました (図 4E)。 網膜炎症を示すミクログリア細胞とミュラー細胞の活性化は、それぞれグローバル (図 4F~4I) と GS 免疫反応性 (図 4K~4N) に基づいて確認されました。 ミクログリアにおける Ibal の局在は、正常および CFA グループでは非常にまれでした (それぞれ図 4F、4G の矢印)。 ミクログリアの活性化は、ベタイン処理によって EAU ラット (図 4H の矢印) で抑制されました (図 4I、4J)。 GS 陽性の免疫反応性の結果は、網膜の全体的な結果と同様でした (図 4K~4N)。 ＥＡＵ＋ビヒクル群における活性化ミュラー細胞は、より低いＧＳ免疫反応性レベルを有していた（図４０）。
ベタインはEAUの接着分子と炎症誘発性メディエーターを抑制しました
次に、リアルタイムPCRを用いて接着分子の発現を調べました（図5A）。 EAUとベタインのグループでは、血管細胞接着分子1（VCAM1）mRNAレベルの急激な減少が観察されました（p<0.05 vs.eau+vehicle).="" the="" mrna="" levels="" of="" serpina3n,interleukin-1β(il-1β),="" tumor="" necrosis="" factor-alpha="" (tnf-a),="" inducible="" nitric="" oxide="" synthase(inos),="" and="" cyclooxygenase="" at-2(cox-2)as="" pro-inflammatory="" mediators,="" were="" assessed="" to="" confirm="" the="" inflammatory="" condition="" (fig.="" 5b).="" the="" mrna="" levels="" of="" serpina3n,="" il-1β,="" tnf-a,="" cox-2="" were="" significantly="" downregulated="" in="" the="" eau+betaine="" group="" compared="" with="" that="" of="" vehicle-treated="" eau="" group="" (fig.5b).="" these="" results="" indicate="" that="" the="" betaine="" treatment="" suppressed="" the="" upregulation="" of="" pro-inflammatory="">
ベタインは、抗酸化酵素カタラーゼ (CAT) および SODinEAU を上方制御しました
血清中の酸化損傷レベルの研究により、CAT、SOD1、SOD2、および SOD3 を含む抗酸化酵素の抗酸化応答状態を調査するようになりました (図 5C)。 EAU とベタインのグループの眼球では、EAU とビヒクルのグループと比較して、CAT、SOD1、SOD2、および SOD3 の発現レベルが大幅にアップレギュレートされていることが観察されました。
ベタインは Keapl-Nrf2 経路を活性化しました
ベタインの抗酸化効果をサポートするために、Keapl-Nrf2 経路を調べました (図 6)。 Keapl のタンパク質レベル (0.75±0.05 倍の変化、p<0.05,fig.6a)and nrf2(0.79±0.04fold=""><0.05,fig.6b)in eau+vehicle="" group="" were="">
ノーマルコントロールと比較。 他方で、Ｋｅａｐ１およびＮｒｆ２は、ＥＡＵ＋Ｖｅｈｉｄｅ群のものに対して、１．４６±0.00倍の変化または１.１３±{{７}}.３４倍の変化を示した（ｐ<0.01 and=""><0.001,>
討論
これは、ベタインが抗炎症作用および抗酸化作用によって EAU 病因の進行を緩和するが、T 細胞増殖を抑制することによって緩和しないことを報告した最初の研究です (図 7 の模式図)。
自己免疫疾患の原型であるEAUを使用して証明された自己免疫疾患におけるベタインの調節効果は、ベタインによるT細胞増殖ではなく、酸化ストレスおよび炎症誘発性メディエーターの減少によるものと考えられています[19]。 同様に、本研究は、ベタインが EAU モデルの T 細胞増殖および培養上清中のサイトカインプロファイルにほとんど影響を及ぼさないことを明らかにし、ベタインが EAU における自己免疫 T 細胞の増殖の免疫応答に影響を与えないことを示唆しています。 ブドウ膜は EAU の標的臓器です。 ブドウ膜と網膜は、リンパ管を持たない免疫学的に隔離された臓器です[20]。 EAU の自己免疫 T 細胞は、毛様体動脈と眼動脈の枝を介して侵入します [21]。 酸化ストレスは、炎症反応の進行に対する重要なシグナル伝達であり、活性酸素種の増加は内皮機能障害と組織損傷を引き起こします [22]。 乱された内皮細胞は、炎症細胞および炎症分子の通過の促進につながります[22]。 ブドウ膜の炎症性メディエーターと細胞が網膜色素上皮細胞で誘発され、桿体細胞と錐体細胞と色素上皮細胞の間の接合部が乱れ、網膜剥離につながる[23]。 毛様体は、眼の炎症の侵入部位です。 典型的な網膜炎症は、血液網膜関門の破壊による常在ミクログリアの活性化と炎症細胞の浸潤に関与しています [24]。 脳腫瘍 [25]、軸索切断 [26]、およびウイルス感染 [27] を含む神経病理学的条件下では、活性化されたマクロファージとミクログリアは Ibal によって区別されました。 さらに、活性化された常在ミクログリアは、網膜変性疾患で発生する病理学的変化に関与し、疾患プロセスを悪化させる炎症性メディエーターを放出します [28]。 これらの結果は、ベタインが EAU の主な標的であるブドウ膜と毛様体で抗炎症効果を発揮し、血清中の酸化ストレスを軽減する可能性があることを示唆しています。 ただし、正確なメカニズムはまだ研究されていません。
活性化されたミクログリアは、網膜変性状態における炎症誘発性サイトカインの主な供給源です [29]。 IL や TNF などの炎症誘発性サイトカインは、眼の炎症 [30] や網膜炎 [6,29] と強く関連しています。 ミクログリアに加えて、ミュラー細胞は網膜で発生するすべての病理学的事象の下で活性化されます [31]。 活性化されたミュラー細胞は、炎症関連分子を合成および放出することにより、網膜の神経炎症効果に関与しています [31]。 ベタインは、ミクログリアとミュラー細胞の活性化を抑制することにより、EAU 誘発ラットの炎症反応を緩和すると仮定します。 VCAM1 のアップレギュレーションは、炎症細胞の浸潤に大きく関与しています [32]。炎症[34]、ミュラー細胞、アストロサイト、および光損傷を受けた網膜の網膜色素上皮[35]で検出され、錐体細胞が損傷したNrl'mouse網膜では有意に変動するレベルを有する[36].セルピンa3nはEAUで増加する重度の網膜炎症を伴うが、ベタインで治療されたEAUグループでは大幅に減少しました。 神経炎症を伴う統合失調症についても同様の所見が報告されている [34]。マウスのセルピン a3n はヒトのセルピン a3 のオルソログである [37]。 さらに、IL-1 の増加は、高フルクトース誘発性網膜損傷で観察されました [38]。 ベタインの抗炎症効果は、EAU 誘発ラットにおける VCAM1、Serpina3n、および IL-1 のダウンレギュレーションに関連していると仮定します。 Keep-Nrf2 経路は、酸化ストレスを監視するために使用されます [39]。 ベタインは、抗酸化分子として知られており、アセトアミノフェン誘発急性肝障害モデルの Keapl-Nrf2 経路に関連していました [40]。 さらに、3H-1,2-ジチオール-3-チオン処理後に肝臓遺伝子発現プロファイリングが行われ、発がん物質の解毒を促進し、新形成から保護する役割を果たしました [4]。 このプロファイリングの結果、Keap1-Nrf2 が、AF033381 を含む nrf2- 依存 3H-1,2-dithiole-3- チオン誘導性遺伝子を調節することが明らかになりました。ベタイン ホモシステイン メチル トランスフェラーゼが増加し、解毒と抗酸化に関与した [41]。 EAU における炎症反応は、T 細胞やマクロファージなどの炎症細胞の浸潤 [42]、および特に初期段階の光受容体ミトコンドリアにおける酸化ストレスの生成によって誘導された [43]。 これらの結果によると、ベタイン治療は、酸化ストレスの調節への重要な経路として、Keap1-Nrf2 経路の調節によって EAU による組織損傷を軽減する候補でした。
ベタインの抗酸化効果は、ラジカル誘発傷害モデルで広く評価されています [44]。 SOD1、SOD2、および SOD3 は、異なるメカニズムによって活性化され、それぞれ細胞質、ミトコンドリア、および細胞外マトリックスに局在しています [45]。 抗酸化分子としてのベタインは、酸化損傷の軽減に関与しています [46]。 酸化ストレスの減少は、アルツハイマー病、パーキンソン病、および多発性硬化症を含む多くの疾患における Ibal 陽性マクロファージ/ミクログリアによって示される炎症の解消にまで及んだ [47]。 ベタイン治療は、EAU プラス ビヒクル群と比較して、酸化ストレス マーカーの mRNA レベルまでアップレギュレートされました。 この結果は、ベタイン治療が、ラット EAU モデルの免疫器官における T 細胞の増殖を妨げることなく、循環系の酸化ストレスを減少させたことを意味します。
まとめると、本研究は、おそらく抗酸化および抗炎症メカニズムを通じて、ベタインが EAU 誘発ラットの網膜および毛様体の炎症を軽減できることを示唆しています。
この記事は https://doi.org/10.5607/en21011 から抜粋したものです
