人間の皮膚は人体の最大の器官であり、環境毒素から体を保護します
Sep 05, 2022
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概要：近年、皮膚におけるメラニンのアンチエイジングやメラニン生成抑制の役割が明らかになり、皮膚の恒常性を維持できる素材の開発が注目されています。 この研究では、Codonopsis pilosula 抽出物 (CPE) の抗メラニン形成効果、および酸化ストレス下で、H2O2 に曝露されたメランαメラノサイトにおける細胞保護効果をさらに調査しました。 第一に、CPE治療は、メランのMAPK / JNKのリン酸化の結果として、小眼球関連転写因子（MITF）、チロシナーゼ、およびチロシナーゼ関連タンパク質2（TRP 2）を含むメラニン形成関連タンパク質を阻害することにより、メラニン産生を大幅に減少させた. -細胞。 次に、酸化ストレス誘発性皮膚損傷に対する CPE の保護効果とその分子メカニズムを調査するために、メラノサイトを H2O2 に曝露して酸化ストレスを誘発した後の CPE の効果を決定しました。 CPE は、Bax プロアポトーシスタンパク質をコードする遺伝子の発現を減少させることにより、H2O2- 誘導性の細胞毒性から細胞を保護しましたが、B 細胞リンパ腫 (Bcl2) ファミリーおよび転写調節因子である MITF をコードする遺伝子を誘導しました。メラノサイトの分化を促進します。 さらに、我々の結果は、CPEがBeclin-1や軽鎖3（LC3）Ⅱなどのオートファジー関連タンパク質の産生を増強したことを示しています。 これは、3-メチルアデニン（MA、オートファジー阻害剤）の前処理によって実質的に逆転しました。 まとめると、我々の調査結果は、CPE治療が正常なメラノサイトで抗メラニン形成効果を示すだけでなく、オートファジーとMITF発現を誘導することにより、酸化ストレスを受けたメラノサイトで細胞保護効果を示すことを示しています。シスタンシェの陰茎のサイズ、したがって、CPE はメラノサイトの細胞維持の有力な候補であると考えています。
キーワード:Codonopsis pilosula; メランα細胞; メラニン形成; オートファジー; 酸化ストレス
1.はじめに
人間の皮膚は人体の最大の器官であり、環境毒素、アレルゲン、および酸化ストレスから体を保護します. 主にメラノサイトによって生成されるメラニンは、皮膚疾患の予防に重要な役割を果たすことが知られており、人体のさまざまな組織に存在します [1,2]。 しかし、ストレス、紫外線 (UV) 放射、老化による活性酸素種 (ROS) の過剰な生成と蓄積は、色素沈着過剰、肝斑、最終的にはメラノサイトの分解など、多くの皮膚障害を引き起こします。 メラニン形成の治療に関するいくつかの研究は、小眼球症関連転写因子 (MITF) の発現とチロシナーゼ活性の調節に焦点を当てています [3-5]。 さらに、最近の研究では、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ (MAPK) シグナル伝達、プロテインキナーゼ A (PKA)、環状アデノシン一リン酸 (cAMP) 媒介経路など、いくつかのメラニン形成シグナル伝達経路を介して皮膚のメラニン形成が媒介されることが示されています [6]。
ニシンはアンチエイジングできる
細胞のオートファジーシステムは、損傷したタンパク質を分解するか、細胞内の機能不全のオルガネラを分離し、リソソームで分解して細胞の恒常性を維持する細胞の自己消化プロセスとしてよく知られています [7,8]。 最近の研究では、オートファジーがメラノサイトの正常な機能およびメラニン形成転写因子 MITF の発現調節に関与していることが確認されています。 したがって、オートファジー誘導剤は、紫外線や脂質酸化によって引き起こされる損傷を制限し、メラノサイトとケラチノサイトの恒常性を維持する可能性があります [9-11]。シスタンシュパウダー、ただし、メラノサイトを酸化ストレスから保護する天然のオートファジー誘導製剤の適用に関する情報はほとんどありません。
Codonopsis pilosula はカンパニュラ科に属する Codonopsis pilosula (Fr.) Nanny. の根です。 韓国の江原道の山地で生育または栽培されており、関西地方や山西地方など、中国の北部および西部地域にも分布しています [12]。 民間療法では、エネルギーを補給して免疫システムを強化し、胃腸疾患を軽減し、血圧を調整するなどの同じ薬理活性があるため、何百年もの間高麗人参の代替品として使用されてきましたが、価格は低くなっています. 植物化学研究では、C. pilosula には大量のスクロース、多糖類、トリテルペン、サポニン、フィトステロール、フェノール配糖体、アルカロイド、およびポリアセチレンが含まれていることが示されています [13]。 その中でも、C. pilosula の主要なアセチレンであるロベチオリンは、NF-kB を活性化し、免疫刺激効果があることが知られています [14]。また、C. pilosula 抽出物のエタノール抽出物の効果に関する最近の研究によると、 C. pilosula はオボアルブミンによって引き起こされるアレルギー反応を大幅に抑制し、水抽出物は血漿グルコースレベルを低下させ、ブタノール抽出物はフリーラジカル消去活性とラット脳ホモジネートの脂質過酸化に対する阻害効果を示します[15-17] .
以前、C.pildsula の抗酸化活性は、使用する抽出溶媒に応じてポリフェノール含有量が異なるため、変化することがわかっていました [18]。 したがって、機械的シグナル伝達経路を介した通常の条件下での C. pilosula 抽出物 (CPE) のメラニン生成抑制効果、および Melan-a メラノサイトにおける H2O2- 誘導酸化ストレスに対する細胞保護効果を調査しました。
2。材料と方法
2.1.試薬
RPMI 1640 およびウシ胎児血清 (FBS) は、Welgene (大邱、韓国) から購入しました。シスタンチサルサエキスペニシリン - ストレプトマイシンは、GibcoBRL (エッゲンシュタイン、ドイツ) から購入しました。 ホルボール 12-ミリステート 13-アセテート (TPA) は、TOCRIS (ブリストル、英国) から購入しました。過酸化水素 (HaO2)、3-(4,5-ジメチルチアゾール{{7} }yl)-2、5-臭化ジフェニルテトラゾリウム (MTT)、4'、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)、および 3-MA は Sigma から購入しました-アルドリッチ (米国ミズーリ州セントルイス)。 他のすべての化学物質と試薬は分析グレードのものでした。
2.2. Codonopsis Pilosula 抽出物の調製
C.pilosula の根 (CP) を単純に切り刻み、100 g の CP を 1 L の 50% エタノール (w/v) に浸しました。 次に、30度の超音波を使用して3回抽出しました。 各抽出物を遠心分離して上清を回収した後、上清を濃縮、凍結乾燥してC.pilosula抽出物(CPE)を調製した。
2.3. CPEの細胞培養とストック調製
メラノサイト Melan-a 細胞は、10% FBS、ペニシリン (100 U/mL)、ストレプトマイシン (100 U/mL)、および 200 nM ホルボール 12-ミリステート 13- を添加した RPMI 1640 で増殖および維持されました。アセテート (TPA) を使用し、5% CO2 インキュベーターで 37 度に維持します。 6ウェルプレートで1ウェルあたり3×105個の細胞を培養した後、培地の色が黒色に変化するまでメラン-a細胞をインキュベーターに48時間置いた。 CPE の原液 (100mg/mL) を滅菌水に溶解し、-20 度で保存しました。
2.4.細胞生存率の測定
Melan-a 細胞における CPE の細胞生存率は、MT 比色アッセイとフローサイトメトリーを使用して決定されました。 96- ウェルプレートで 80 パーセントの集密度に達するまで細胞を維持し、その後、CPE および/または 0.5 mMH2O2 で 24 時間処理しました。 10 μL の MTT 溶液（5 mg/mL）を含む細胞培地を添加し、細胞をさらに 4 時間インキュベートしました。 細胞のインキュベーション後、不溶性ホルマザン結晶を100uLのジメチルスルホキシドに溶解した。 マイクロプレートリーダーを用いた分光測光法により、540 nmでの吸光度を測定した。 死細胞は、製造元のプロトコルに従って、PI /アネキシンV細胞死検出キット（EMDミリポアコーポレーション、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国）で決定されました。 簡単に説明すると、細胞を洗浄し、FITC-アネキシン V および PI を含む暗所で室温で 15 分間インキュベートしました。 その後、死んだ細胞を MuselM セル アナライザーで分析しました。
2.5.In Vitro メラニン推定
約2×105細胞/ウェルを6ウェルプレートで増殖させた。 前述の [19] ように CPE および/または 0.5 mM H-Op で処理した後、PBS で洗浄した細胞を回収し、1 パーセントの Triton X-100 を含む 1 × PBS で溶解し、4 度、13 度で遠心分離しました。 000 rpmで15分間。 細胞のメラニン含有量は、1N NaOHを使用して可溶化しました。 ELISAプレートリーダーを使用して、405 nmでの吸光度を測定することによりメラニンを定量しました。 ３回の実験からデータを得て、メラニン含有量を計算し、対照細胞と比較した倍率変化として示した。 2.6. タンパク質分離とウエスタンブロットアッセイ
以前の研究 [20] で説明したように、タンパク質サンプルを抽出しました。 次に、細胞溶解物のタンパク質濃度をBCAタンパク質アッセイキット（Thermo Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を使用して測定しました。 等量の変性細胞溶解物 (サンプルあたり 30 μg の細胞溶解物) を 10% ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) で分離し、ニトロセルロース膜に転写しました。 0.05% Tween 20 を含む PBS (PBST) 中の 5% スキムミルク粉末で希釈した一次抗体と共にメンブレンを 4 ℃ で一晩インキュベートしました。
一次抗体のインキュベーションに続いて、メンブレンを洗浄し、PBST 中の 5% スキムミルクで希釈した HRP 結合二次抗体で室温で 1 時間インキュベートしました。 増強化学発光（ＥＣＬ）検出システム（ＡＩ６８０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用してタンパク質発現を分析した。
2.7.DCFH-DA染色による細胞内ROSの推定
Hoo 処理した Melan-a 細胞の細胞 ROS レベルは、DCFH-DA 蛍光顕微鏡法によって推定されました [21]。 細胞内 DCF 蛍光のレベルは、生成される細胞内 ROS に比例します。 最初に、2 × 105 細胞/ウェルを個々の濃度の CPE および/または H-O2 で 24 時間処理し、次に DCFH2-DA を反応終了の 2 時間前に添加しました。 データは、3 つ以上の独立した実験から収集されました。 2.8.統計処理
すべての実験結果は、3 つの生物学的複製の平均 ± 標準偏差 (SD) として表示されます。シスタンシェの茎複数の平均値間の統計的有意性は、一元配置分散分析 (ANOVA) と、それに続く SPSS 18 を使用したダンカンの多重比較検定によって評価されました。0 (SPSS Inc.、シカゴ、イリノイ州、米国)、伝説に示されているように。 p値<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
3. 結果
3.1.CPEによるメラノサイトのメラニン形成のダウンレギュレーション
メラノサイトは、紫外線などの外的刺激に反応してメラニンを合成します。 メラノサイト刺激ホルモン (-MSH)、幹細胞因子 (SCF)、エンドセリン-1 (ET-1) などの主要な因子がメラノサイトから分泌され、MITF の発現を増加させ、それによってメラニン形成を促進します。 [22,23]。 まず、CPE 処理がメラニン産生とメラニン形成関連タンパク質を阻害するかどうかを調べました。
100、200、および 300 ug/mL での CPE 処理は、陰性対照と比較してメラニン生成を大幅に減少させました。 特に、300 ug/mL の CPE で処理すると、アルブチン処理によって誘導されるのと同様の減少が生じました (図 1A、B)。さらに、メラニン形成タンパク質チロシナーゼ、TRP-1、TRP{{6 }}、ウエスタンブロッティングによるMITF。カンカのツブロサの利点と副作用濃度 300 ug/mL の CPE で処理すると、MITF、TRP-2、およびチロシナーゼタンパク質のレベルが大幅に低下しました (図 1C)。 CPEがMITF関連タンパク質の発現を阻害し、メラニン形成を阻害することが確認されたので、CPEがMAPKシグナル伝達経路に影響を与えるかどうかをさらに調べました。 CPE は用量依存的に MAPK リン酸化を増加させ、特に JNK リン酸化を誘導しました (図 1D)。 これらの結果は、CPE によるメラニン形成阻害が、JNK/MAPK リン酸化の誘導による MITF およびチロシナーゼ発現のダウンレギュレーションに起因することを示唆しています。
3.2.H2O2-によるメラノサイトの細胞死に対するCPEの効果
ケラチノサイトやメラノサイトなどの皮膚細胞は、過酸化水素 (HzOz) やスーパーオキシド アニオンなどの ROS に敏感に反応して、正常な状態を維持します。 しかし、過剰な細胞 ROS による酸化防止状態の不均衡は、損傷したタンパク質やオルガネラの蓄積につながり、最終的にはアポトーシス細胞死につながる可能性があります [24,25]。 最近では、メラニンが皮膚の外部環境に応じてメラニン生成を刺激することで皮膚の老化を促進することや、細胞内のメラニン成分が保持されることで皮膚の健康が維持されることが報告されています[26]。 したがって、H2O2処理による酸化ストレスを受けた細胞に対するCPE抽出物の効果を調査しました。 HzO2- で処理した細胞は、未処理の細胞と比較して細胞生存率が 32.8% 低下しました。 ただし、CPE 処理は、H-O2 処理下で濃度依存的に細胞生存率の阻害を減少させました。 特に、300 ug/mL の CPE は細胞生存率を 91.9% まで回復させました (図 2A)。さらに、CPE および/または H2O2- 処理細胞のアポトーシス死は、アネキシン V による二重染色によって検出されました。 FITC/PI、続いてフローサイトメトリー分析。 H2O2 処理後、アポトーシス細胞のパーセンテージは、未処理細胞の 14.8% と比較して 34.5% に増加しました。 しかし、CPE 処理は H2O2- 誘導アポトーシス死を著しく阻害し、アネキシン V 染色細胞の割合は 22.2% でした (図 2B)。 これは ROS 含有量と同じパターンを示しているため、これらの結果は、CPE が H2O2- 誘導 ROS (図 2C) からの保護を介して細胞死を阻害することにより細胞生存率を維持していることを示しています。
3.3.HzO2-によるメラノサイトの細胞死に対するCPEの効果
以前に確認されたように、CPE は、HzO2 処理後のアポトーシスの増加を阻害することにより、細胞生存率を維持します。 したがって、次に、細胞死に関与するタンパク質と、H2O2 の存在下でメラニン産生を調節する MITF タンパク質の発現に対する CPE の影響を調査しました。 図 3 に示すように、H2O2 処理細胞では MITF の発現がわずかに減少しているのに対し、CPE 処理細胞では MITF の発現は無処理細胞とほぼ同じでした。 さらに、H2O2 はアポトーシスを誘導する Bax タンパク質の発現を増加させたが [27,28]、CPE 処理細胞では濃度依存的に Bax 発現を減少させた。 対照的に、H2O2 は細胞の生存を促進する Bcl2 タンパク質の発現を減少させたが [28,29]、Bel2 の発現は CPE 処理によって濃度依存的に増加した。 これら2つのタンパク質の発現を計算してBax / Bcl2比を決定したところ、同じ傾向が観察されました。 したがって、H2O2- 誘導の酸化ストレス下では、MITF の発現は細胞死の誘導によって減少しましたが、CPE は強力な保護効果を示し、H2Oz 誘導の細胞死を防ぎ、MITF の発現を維持しました。
3.4。 酸化ストレス誘発メラノサイトにおけるオートファジー活性化に対するCPEの影響
最近の研究では、オートファジーとその制御因子が、ヒト細胞における ROS 誘発酸化ストレスに対する抗酸化応答において重要な役割を果たすことが明らかになりました [26,30]。 Feng ら [31] Apocymum venetum 葉抽出物は、ROS によるオートファジーの活性化を減少させることにより、損傷したニューロンを H2O2- によるアポトーシスから保護することを示しました。 オートファジーの調節と抗メラニン形成の間の関連性が確立されているため、H-Oz による酸化ストレスに対する CPE の保護効果におけるオートファジーの役割をメラン a 細胞で調査しました。 オートファゴソームタンパク質であるLC3のレベルは、オートファジーの指標として使用されました。 ウエスタンブロットのデータは、CPEがプロオートファジーLC3-ⅡおよびBeclinタンパク質の発現を有意にアップレギュレートし、その発現はH2O2処理によって減少したことを示しました。 これは、CPE が細胞内酸化ストレスによるオートファジー活性化による細胞保護効果を持っていることを示唆しています (図 4A)。 次に、強力なオートファジー阻害剤である 3-MA を使用して、HzOz 処理した Melan-a 細胞における CPE の細胞保護効果とオートファジーの間の内部関係をさらに分析しました。 以前のデータと比較して、3-MA および CPE で前処理し、H2O2 で刺激した細胞は、LC3-II 発現レベルの低下を示しました (図 4B)。 全体として、これらのデータは、オートファジーの阻害が HzO2- 処理細胞における CPE の細胞保護効果に悪影響を与えることを示唆しており、オートファジーが CPE の細胞保護効果に不可欠であることを示しています。
4。議論
私たちは以前、最高の抗酸化活性とポリフェノール含有量をもたらす最適な抽出方法を確立しました[18]。 この研究では、高収率の超音波抽出法を適用し、抽出物が酸化ストレス条件下でオートファジーを活性化し、メラン-a細胞のメラニン形成を阻害することにより、細胞保護効果を示すことを発見しました。
まず、CPE の抗メラニン形成効果をさらに調査しました。CPE は、MITF、チロシナーゼ、TRP-2 などのメラニン形成に関連する遺伝子の発現を減少させることにより、メラニン形成をダウンレギュレートしました。 いくつかの研究は、酵素発現に関連するメラニン形成の生合成メカニズムが、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ (MAPK)、プロテインキナーゼ A (PKA)、および PI3K/Akt を含むさまざまなシグナル伝達経路によって媒介されることを実証しています [32]。 その中でも、MAPK シグナル伝達経路の活性化は、ヒト初代メラノサイトのタンパク質安定性レベルと転写レベルで MITF を抑制した [33,34]。 MAPK のリン酸化と、細胞外応答キナーゼ (ERK)、c-Jun N 末端キナーゼ (JNK)、および p38 のシグナル伝達カスケードも、メラニン産生を調節します。 その中でも、JNK アクティベーターは、CREB 制御転写コアクチベーター 3 (CRTC3) 依存性 MITF 発現のリン酸化阻害を介してメラニン形成を抑制します [35,36]。 私たちの結果は、MAPK、特にJNKのリン酸化が、コントロール細胞と比較してCPE処理後に効果的に増加することを示しています。 これらの知見は、メランαメラノサイトにおけるCPE誘発性色素脱失がMITF/JNK調節シグナル伝達経路によって起こる可能性があることを示唆している。
メラノサイトはメラニン色素を生成し、ケラチノ サイトに転送します。ケラチノ サイトでは、色素が大気汚染物質、化学製品、紫外線による損傷などの酸化的環境ストレス要因から皮膚を保護するのに役立ちます [37-39]。 MITF は、メラノサイトの発達と分化を促進し、メラニン形成を調節する重要な遺伝子に関与する主要な転写調節因子の 1 つです。 さらに、MITF は、増殖 (CDK2 など) やアポトーシス (Bcl2 など) に関与するタンパク質をコードする遺伝子など、細胞の恒常性を維持する特定の遺伝子の発現を調節します [40-42]。 Stein-Grimson ら [43] は、MITF 変異マウスが、破骨細胞やマスト細胞の欠陥だけでなく、メラノサイトの喪失の結果としての難聴や色素障害の影響を受けていることを特定しました。 これは、MITF がこれらの細胞型の発生に重要な役割を果たしていることを示唆しています。
CPE は、そのアンチエイジングおよび抗アレルギー効果により、胃腸およびアレルギー疾患の治療に使用される漢方薬の派生物です [15,44]。 ただし、CPE がメラノサイトを酸化ストレスから保護できるかどうかは不明のままです。 酸化ストレスに応答したメラノサイトの生存に対する CPE の影響を推定するために、H-O2 にさらされたメラノサイトの細胞死を最初に観察しました。 0.5 mM H-O2 で 24 時間処理した後、細胞の生存率は未処理の細胞と比較して減少しました。 ただし、CPE 処理細胞の生存率は、ROS 含有量を減らすことで回復しました。 その後、H2O2- 処理細胞とは異なり、Bax/Bcl2 比と MITF 発現が増加しました。
オートファジーは、リソソームの損傷が分解をもたらす主要な細胞内分解システムです。 水島ら。 [45]は、飢餓、炎症、または酸化ストレスの条件下で、オートファジープロセスが細胞内の損傷したタンパク質とオルガネラの分解を調節できるため、細胞の修復と恒常性を達成できることを実証しました. 微小管関連タンパク質 1 軽鎖 3 (LC3) と Beclin-1 は、哺乳類のオートファジーで主要な役割を果たします。 LC3 は 2 つの形態、すなわち細胞質型 (LC3 I) と、成長するオートファゴソームの内膜と外膜の両方に挿入される脂質ホスファチジルエタノールアミン結合型 (LC3 III) で存在します [46,47] Zhang ら [ 48] LC3IからLC3IIへの変換を生化学マーカーとして使用して、メラノサイトのオートファジーの状態を分析しました。 さらなる研究により、LC3 は最終的なオートファゴソーム形成のマーカーであるのに対し、Beclin-1 はオートファゴソーム形成の初期段階に関与し、オートファジーを活性化することが示されました [49]。 構成的なオートファジー活性は、メラノサイトの酸化的損傷を防ぐ上で重要な役割を果たしますが、酸化ストレス下のメラノサイトのオートファジーを調節する分子メカニズムに関する研究はほとんどありません。
その結果、酸化ストレスを受けたメラノサイトの細胞生存に対するCPEを介したオートファジーの影響を調査しました。 私たちの結果は、CPE 処理後、Beclin-1 の発現増加と LC3I から LC3 II への変換の誘導によってオートファジーが活性化されたことを示しています。 これは、CPEが酸化ストレスを受けたメラノサイトのオートファジー活性化を通じて細胞保護効果を発揮することを示唆しています。
結論として、本研究は、CPE治療が正常なメラノサイトのMITF / JNK経路を介して抗メラニン形成効果を有するだけでなく、HzOg誘導酸化ストレス下で、細胞生存を維持し、MITFを介して細胞保護を発揮し、持続的な活性化をもたらすことを実証した.細胞におけるオートファジーの発現。
この記事は、化粧品 2021 年 8 月 67 日からの抜粋です。 https://doi.org/10.3390/cosmetics8030067
