プロテアーゼ Calpain2a は硬骨魚の TRAF6 を標的とすることで自然免疫を制限する
Dec 19, 2023
TNF 受容体関連因子 6 (TRAF6) は、抗菌シグナル伝達経路と抗ウイルスシグナル伝達経路の両方において重要なシグナル伝達の役割を果たします。 しかし、下等脊椎動物におけるTRAF6の調節機構はあまり報告されていない。 この研究では、カルパイン 2a が独特の加水分解酵素活性を持つカルシウム依存性プロテアーゼファミリーのメンバーであり、硬骨魚類の抗菌および抗ウイルス免疫の重要な調節因子として機能していることを特定しました。 リポ多糖 (LPS) 刺激により、カルパイン 2a がノックダウンされ、炎症性サイトカインの上方制御が促進されます。 機構的には、カルパイン 2a は TRAF6 と相互作用し、加水分解によって TRAF6 のタンパク質レベルを低下させます。 酵素活性が失われると、変異体カルパイン 2a は TRAF6 の二量体形成と自己ユビキチン化を競合的に阻害します。 カルパイン 2a のノックダウンも細胞の抗ウイルス応答を促進します。 加水分解酵素活性を欠く変異カルパイン2aは、TRAF6からのIFN調節因子（IRF）3/7のユビキチン化を抑制する。 総合すると、これらの発見は、硬骨魚類のTRAF6を標的とすることにより、カルパイン2aを自然免疫応答の負の調節因子として分類する。
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自然免疫は、侵入する病原体に対する防御の第一線として、細菌の侵入やウイルス感染から体を守る上で重要な役割を果たします。 膜上のパターン認識受容体 (PRR) は、病原体関連分子パターン (PAMP) を即座に認識します 1-3。 自然免疫において最も広く研究されている 3 つの PRR は、Toll 様受容体 (TLR)、RIG-I 様受容体 (RLR)、および NOD 様受容体 (NLR) です。これらは、さまざまな PAMP を認識し、炎症誘発性サイトカインや炎症促進性サイトカインを活性化するシグナルカスケードをトリガーします。抗ウイルス因子4-6。 TNF 受容体関連因子 (TRAF) 6 は、細菌の侵入やウイルス感染との戦いに不可欠な部分です。 リポ多糖（LPS）によって活性化される重要なシグナル経路として、核転写因子-κB（NF-κB）経路が詳細にマッピングされています。 NF-κB シグナル伝達経路におけるタンパク質機能のほとんどは、広範囲に研究されています 1,7。 骨髄分化因子 88 (MyD88) は、LPS に応答して TLR によって最初に活性化され、IRAK4 は MyD88 を TRAF68-11 に結び付ける IRAK1 および IRAK2 を活性化することによってメディエーターとして機能します。 Ubc13 と Uev1A は TRAF6 の K63- 結合ユビキチン化を触媒し、K63 ユビキチン鎖を TAB2 と TAB3 に転移させ、TAK112-16 の活性化を引き起こします。 TRAF6- によって制御される IKK アクチベーター 2 (TRIKA2) は、TAK1、TAB1、TAB2 で構成され、IκB キナーゼ (IKK) / リン酸化の阻害剤を活性化します 17-19。 転写因子 NF-κB は核に入り、炎症性サイトカインの産生を促進します20。 TLR7/9 がウイルスを認識すると、MyD88- IRAKs-TRAF6 複合体が IFN 調節因子 (IRF) 7 にシグナルを伝達し、IRF7 のユビキチン化を促進し、核内へのリン酸化を活性化します 21,22。 RLR シグナル伝達経路では、RIG I および黒色腫分化関連遺伝子 5 (MDA5) がミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達タンパク質 (MAVS) を活性化します 23,24。 MAVS の集約は、RLR 信号送信の始まりの重要な特徴です 23,25,26。 TRAF2/3/6 は、MAVS によって活性化される最初の因子です 27,28。 TRAF3はTBK1-IRF3シグナル伝達を活性化し、MAVS-TRAF6複合体はNF-κBシグナル伝達を活性化し、IFN-1の発現を促進します27,29。
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TRAF6 活性化の分子機構はすでに証明されています。 二量体形態のTRAF6は、リングフィンガードメインおよびZFフィンガードメインに関連するUbc13およびUev1Aの触媒作用の下で自己ユビキチン化を受ける。 TRAF6/Ubc13~UB のモデルは、K63 ユビキチン鎖の凝集と伝達における TRAF6 二量体の重要な役割を裏付けています 30。 さらに、ゼブラフィッシュ TRAF6 結晶モデルでは、リングフィンガーおよび ZF フィンガードメインが E2~ub コンジュゲートをリクルートすることが報告されており、TRAF6 が同じ TRAF ファミリーの TRAF5 とヘテロ二量体を形成できることが初めて発見されました 16。 脱ユビキチン化ファミリータンパク質:A20、CYLD、USP2a、USP4、および USP20 は TRAF6 を標的として、K63- 結合ユビキチン化を除去し、下流のシグナル伝達を減少させます 31-35。 酵母ツーハイブリッドシステムは、UBE2O と TRAF6 の間の相互作用をスクリーニングし、この相互作用が MyD8836 による TRAF6 の活性化に直接影響を与えることを確認します。 TRAF6 の下流シグナル伝達過程では、中間タンパク質として ECSIT が TRAF6 および TAK1 とそれぞれ相互作用し、この相互作用により TRAF6 と TAK137 の結合が強化されます。 LPS 誘導性の TLR4 シグナル伝達では、PRDX は TRAF6 が ECSIT を動員して K63 ユビキチン鎖を送達するのを防ぎ、オートファジー経路で TRAF6 によって活性化される BECN1 も阻害します 38。 MST4 は、Thr463 および Thr486 での TRAF6 リン酸化を活性化し、TRAF6 の二量体化とユビキチン化を阻害します 39。 哺乳類では、TRAF6 のタンパク質調節機構が抗菌免疫および抗ウイルス免疫において広く研究されています。 しかし、下等脊椎動物におけるTRAF6の研究はあまり研究されていません。 硬骨魚類の免疫応答は、主に TLR および RLR 経路に依存して、病原体感染後の免疫応答を実行します。 したがって、TRAF6-媒介シグナル伝達経路の制御機構を探索することが重要です。 カルパイン 2 (m-カルパイン) はカルシウム依存性プロテアーゼのファミリーであり、哺乳類や他の多くの生物で 16 を超えるメンバーで構成されています 40。 カルパインタンパク質ファミリーの最も初期の研究は細胞運動に関連したものでした41。 カルパインは細胞遊走を促進し、好中球遊走と p38 MAPK および ERK MAPK42 の活性化を阻害することが判明しました。 加水分解酵素の活性はカルパインの重要な機能の 1 つです。 免疫調節において、カルパイン-2はIkBを加水分解することによってNF-κBの放出を促進し、シグナル伝達経路を活性化します43。 この研究では、カルパイン 2a が TRAF6 と相互作用し、硬骨魚類 miiuy croaker (Miichthys miiuy) の抗菌および抗ウイルス反応における負の制御因子として機能することを確認しました。 カルパイン 2a は、加水分解酵素活性を通じて TRAF6 タンパク質レベルの分解を促進します。 一方、加水分解酵素活性を欠く変異カルパイン2aは、TRAF6の二量体を阻害することでK63ユビキチン鎖の形成を阻害する。 カルパイン２ａおよび変異体カルパイン２ａの両方が、ＥＣＳＩＴ／ＢＥＮＣ１／ＩＲＦ３／ＩＲＦ７へのＴＲＡＦ６のユビキチン化を終結させることが反映されている。 カルパイン2aは、TRAF6を標的とすることでNF-κBおよびIFNシグナル伝達プロセスを停止します。 私たちの結果は、下等脊椎動物におけるTRAF6-媒介免疫制御の研究のための分子を提供する。
結果
カルパイン 2a は TRAF6 と相互作用し、NF-κB シグナル伝達を負に制御します。
硬骨魚類の自然免疫応答における TRAF{0} 関連タンパク質についての洞察を得るために、アフィニティー精製と質量分析を使用してミイベ TRAF6 インタラクトームを特徴付けました。 ラベルフリー定量（LFQ）強度によって並べ替え、データの一部をインターセプトして表示しました（図1a）。 TRAF6-関連タンパク質の中で、カルパイン 2a は TRAF6 活性を調節し、TRAF6- を介したシグナル伝達経路に影響を与えている可能性があります。 まず、タンパク質レベルでのカルパイン 2a と TRAF6 の関係を調査する必要があるため、Miiuy croaker 腎臓細胞株 (MKC) でカルパイン 2a と TRAF6 の相互作用を確認しました。 内因性免疫共沈降実験により、カルパイン2aがTRAF6と相互作用することが示されました（図1b、c）。 一過性トランスフェクションおよび免疫共沈降実験によって示されるように、過剰発現されたカルパイン2aとTRAF6は相互作用しました（図1d、e）。 これらはすべて、カルパイン2aがTRAF6と相互作用することを示しており、それらの作用機序を調査するにはさらなる実験が必要である。 ヒト、マウス、ゼブラフィッシュ、およびニベのカルパイン2aタンパク質の多重配列アラインメントにより、カルパイン2aは魚類と哺乳類の間で進化的に保存されています（図1f）。 自然免疫におけるカルパイン 2a の機能を決定するために、カルパイン 2a が LPS 刺激によって誘導される NF-κB の活性化と関連しているかどうかを調べました。 我々は、NF-κB ルシフェラーゼ レポーター、内部対照ウミシイタケルシフェラーゼ レポーター、およびカルパイン 2a をコードするベクターまたは空のベクターを用いて、ウミシイ科丘疹上皮腫 (EPC) 細胞をトランスフェクトしました。 カルパイン２ａは、ＬＰＳ刺激時に用量依存的にＮＦ－κＢレポーター活性を実質的に減少させた（図１ｇ）。 さらに、LPS刺激に応答するIL-1やIL-8プロモーターなどの炎症誘発性サイトカインは、カルパイン2a過剰発現EPC細胞では著しく減少し（図1h、i）、炎症性シグナル伝達におけるカルパイン2aの潜在的な役割を示唆しています。 LPS 刺激によって誘導される経路。
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カルパイン2aによるLPS誘導性NF-κBシグナル伝達の負の制御。
NF-κB シグナル伝達におけるカルパイン 2a の潜在的な役割を調べるために、LPS の時間勾配を用いて MKC のカルパイン 2a をトランスフェクトし、LPS に応答する炎症促進性サイトカインを評価しました。 カルパイン2aの過剰発現は、IL-1、IL-8、およびIL-6の発現の下方制御を引き起こしました（図2a）。 次に、カルパイン 2a を効率的に下方制御する 2 つのカルパイン 2a 特異的低分子干渉 RNA (siRNA) を設計しました (図 2b、d)。 カルパイン2aのノックダウンは、MKCおよびMiiuy croaker腸細胞株（MIC）におけるIL-1およびIL-8を含むLPS誘導性炎症誘発性サイトカインを有意に増強した（図2c、e）。 LPS 刺激細胞のグループでは、カルパイン 2a のノックダウンにより細胞増殖が促進されました。 同様に、刺激の非存在下では、カルパイン 2a のノックダウンも細胞増殖を促進することがわかりました (図 2f)。 カルパイン2aがLPS誘導性NF-κBシグナル伝達のタンパク質を阻害したかどうかを判断するために、カルパイン2aはTRAF6の内因性タンパク質レベルを顕著に阻害したが、MyD88、IRAK4、またはTAK1は阻害しなかった（図2g）。 要約すると、カルパイン 2a および炎症誘発性サイトカイン発現の動態は、LPS 誘導性 NF-κB シグナル伝達におけるカルパイン 2a の機能的関与を示唆しました。
図 1 カルパイン 2a は TRAF6 と相互作用し、NF-κB シグナル伝達経路を阻害します。 a ラベルフリー定量強度に基づく TRAF6 インタラクトームのリスト (セクション)。 b、c 6 cm2 ディッシュに播種された MKC 細胞。 24 時間後、細胞溶解物を抗 TRAF6 または抗カルパイン 2a アフィニティーゲルで免疫沈降 (IP) しました。 次に、免疫沈降物と細胞溶解物を、それぞれ抗 TRAF6 抗体と抗カルパイン 2a 抗体を用いた IB で分析しました。 d、e 6 cm2 ディッシュに播種した HEK 293 細胞に、プラスミド calpain2a-Flag および TRAF6-Myc (それぞれ 2 μg) をトランスフェクトしました。 24 時間後、細胞溶解物を抗 Myc d または抗 Flag e アフィニティーゲルで免疫沈降 (IP) しました。 次いで、免疫沈降物および細胞溶解物を、それぞれ抗Mycおよび抗Flag Abを用いたIBによって分析した。 f ヒトカルパイン 2a (Hu-カルパイン 2)、マウス カルパイン 2a (Mu-カルパイン 2)、ゼブラフィッシュ カルパイン 2a (ZF-カルパイン 2a)、およびミイユ カルパイン 2a (M-カルパイン 2a) の同じアミノ酸は、黒い背景で強調表示されます。 g-I EPC 細胞に、NF-κB、IL-1、および IL-8 ルシフェラーゼ レポーターとともにカルパイン 2a-Flag または空のベクターをトランスフェクトしました。 トランスフェクションの 24 時間後、細胞を未処理 (モック) または LPS で 6 時間処理しました。 ルシフェラーゼ活性値は、ウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して達成されました (グループあたり n=3)。 ウェスタンブロット分析を使用して、一過性にトランスフェクトされたカルパイン 2a フラグの発現を測定しました。 チューブリンの発現をローディングコントロールとして使用しました。 データは二元配置分散分析 (g、h、i) によって分析されました。 **p < 0.01。 すべての実験は少なくとも 3 つの独立した実験で実行されました。
カルパイン2aとTRAF6の相互作用。
ドメイン分析は、保存ドメイン データベース (CDD) NCBI を使用して行われました。 カルパイン2aは、カルパインファミリーシステインプロテアーゼ（CysPc）ドメイン（aa 46-339）、中央カルパイン大サブユニットドメインIII（aa 360-499）、およびC末端ペンタEFハンドドメイン（ああ500-697)。 カルパイン 2a のどのドメインが TRAF6 との相互作用に必要かを決定するために、カルパイン 2a (1-339)、カルパイン 2a (340-697)、およびカルパイン (500-697) の 3 つの切断変異体を作成しました。 (図3a)。 HEK293 細胞をカルパイン 2a-Flag 野生型 (WT)、カルパイン 2a-Flag 切断変異体、または TRAF6- HA ベクターでトランスフェクトしました。 我々は、全長カルパイン2aと3つの切断変異体の両方がTRAF6と相互作用できることを発見した（図3c）。 TRAF6 は、C 末端 TRAF ドメイン、コイルドコイルドメイン、ジンクフィンガードメイン、およびリングフィンガードメインで構成されています 38。 TRAF6 のどのドメインがカルパイン 2a との相互作用に必要であるかを調べるために、TRAF6 (1-139)、TRAF6 (140-574)、TRAF6 (280-574 などの一連の TRAF6 切断変異体を作成しました) }})、TRAF6 (400-574)。 一方、ドメイン変異体として、TRAF6ΔRing（リングフィンガードメインが欠失）、TRAF6ΔZF（ジンクフィンガードメインが欠失）、TRAF6ΔCC（コイルドコイルドメインが欠失）、TRAF6ΔTRAF-C（ C末端TRAFドメインが削除されている）（図3b）。 カルパイン2aは、全長TRAF6およびC末端TRAFドメイン、コイルドコイルドメイン、ジンクフィンガードメインを含むTRAF6の切断部分と相互作用しましたが（図3d、f）、リングフィンガードメインとは相互作用しませんでした（図3e）。 。 ルシフェラーゼアッセイは、カルパイン2aの過剰発現とこれらの切断変異体がEPC細胞におけるNF-κBおよびIL-1レポーター活性を有意に阻害することを示した（図3h）。 さらに、カルパイン 2a と TRAF6 の細胞内共局在を調査しました。 EPC細胞にTRAF6-GFPと空のベクターまたはカルパイン2a-mCherryをトランスフェクトしました。 共焦点顕微鏡分析により、TRAF6の緑色シグナルがカルパイン2aの赤色シグナルと重複することが実証され、これはカルパイン2aがEPC細胞においてTRAF6と共局在することを示した（図3i、j）。 これらのデータは、TRAF6の複数のドメイン（C末端TRAFドメイン、コイルドコイルドメイン、ジンクフィンガードメイン）の構造的基礎が、カルパイン2aとの結合の決定要因であるが、リングフィンガードメインではないことを示している（図3g）。
図 2 カルパイン 2a は LPS 誘導性 NF-κB シグナル伝達経路をネガティブに制御します。 カルパイン2a-Flagまたは空のベクターで形質導入され、生理食塩水（0）で処理されるか、さまざまな症状に対してLPSでチャレンジされたMKC内のIL-1、IL-8、およびIL{6}} mRNA回 (2 時間、4 時間、6 時間、8 時間、10 時間) (グループあたり n=3)。 b、d MKC細胞およびMIC細胞をsi-カルパイン2a #1およびsi-カルパイン2a #2（100 nM）またはsi-ctrl（100 nM）でトランスフェクトしました。 トランスフェクションの 48 時間後、カルパイン 2a 発現を qRT PCR によって測定しました (グループあたり n=3)。 カルパイン 2a タンパク質のレベルは、ウェスタンブロッティングによって決定されました。 c、e si-カルパイン2a #1またはsi-ctrl（コントロールベクター）で安定に形質導入され、生理食塩水（0）で処理されるか、さまざまな目的でLPSでチャレンジされたMKCおよびMICのIL-1、IL-8 mRNA回 (4 時間、8 時間) (グループあたり n=3)。 f MKC 細胞を si-ctrl または si-calpain2a #1 でトランスフェクトしました。 トランスフェクションの 36 時間後、細胞を LPS で 12 時間刺激し、その後細胞増殖アッセイを測定しました (グループあたり n=3)。 スケールバー、100μm。 g カルパイン2a-Flagを、さまざまな時間(3時間、6時間、9時間)でLPSでチャレンジしたMKC細胞にトランスフェクトしました。 示された Abs を使用した細胞溶解物の免疫ブロット分析。 相対的な mRNA レベルは、各サンプルのアクチンをコードする遺伝子の発現に対して正規化されました。 すべての実験は少なくとも 3 つの独立した実験で実行されました。 データは二元配置分散分析 (a、c、e、f) または一元配置分散分析 (b、d) によって分析されました。 *p < 0.05、**p < 0.01。
図 3 カルパイン 2a と TRAF6 の相互作用。 a、b この研究では、ミチニベカルパイン2a、TRAF6、および変異体のドメイン構成の概略図を使用しました。 「+」はTRAF6またはカルパイン2aとの相互作用を表し、「-」は相互作用がないことを意味します。 c HEK293細胞を、示されているように、モック、カルパイン2a-Flag野生型（WT）、およびカルパイン2a-Flag切断変異体、またはTRAF6-HAでトランスフェクトしました。 トランスフェクションの 24 時間後、トランスフェクトされた細胞を抽出し、細胞溶解物を抗 HA 抗体による免疫沈降に供し、続いて抗 HA または抗 Flag 抗体を使用した IB に供しました。 d〜f HEK293細胞に、示されているように、モック、TRAF6-HA野生型（WT）、TRAF6-HA切断型変異体、またはカルパイン2a-Flagをトランスフェクトしました。 トランスフェクションの 24 時間後、トランスフェクトされた細胞を抽出し、細胞溶解物を抗 HA 抗体 d、f、または抗 Flag 抗体 e で免疫沈降し、その後抗 HA または抗 Flag 抗体を使用して IB を行いました。 g TRAF6 とカルパイン 2a の相互作用部位。 h EPC 細胞に、TRAF6- HA、カルパイン 2a-Flag、またはカルパイン 2a-Flag 切断変異体を、NF-κB および IL-1 ルシフェラーゼ レポーターとともにトランスフェクトしました。 トランスフェクションの 36 時間後、ウミシイタケルシフェラーゼ活性に対するルシフェラーゼ活性値が達成されました (グループあたり n=3)。 Ij EPC細胞をモック、カルパイン2a-mCherry、およびTRAF6-GFPでトランスフェクトした。 DAPI で染色された核は青色で示されています。 カルパイン2aは赤色蛍光で検出され、TRAF6は緑色蛍光で検出された。 スケールバー、10 μm。 すべての実験は少なくとも 3 つの独立した実験で実行されました。 データは一元配置分散分析によって分析されました (h)。 **p < 0.01。
カルパイン2aは、タンパク質分解活性によりTRAF6タンパク質の発現レベルを阻害します。
TRAF6 に対するカルパイン 2a の制御機構を調べるために、我々はまず、カルパイン 2a がタンパク質レベルで TRAF6 に影響を与えるかどうかを調べました。 カルパイン2a-MycとTRAF6-FlagをEPC細胞に同時トランスフェクトすると、TRAF6のタンパク質レベルは30時間で部分的に分解されました（図4a）。 図4bに示すように、カルパイン2aは用量依存的にTRAF6の分解を促進しました。 カルパイン 2a の存在下では、カルパイン 2a は TRAF6 の mRNA レベルに影響を与えず、カルパイン 2a が TRAF6 のタンパク質レベルにのみ影響を与えることを示しています。 一方、阻害剤シクロヘキシミド（CHX）アッセイは、カルパイン2aがTRAF6タンパク質の半減期を加速できることを実証しました（図4c）。 MKC細胞におけるカルパイン2aの過剰発現は、内在性TRAF6の不安定化を引き起こした（図4d）。 カルパイン 2a によって媒介される TRAF6 の分解がユビキチン - プロテアソーム、オートファゴソーム、リソソーム経路などに依存しているかどうかを調べるために、これらの経路を阻害する試薬、MG132、3-MA、および NH4Cl で EPC 細胞を処理しました。 ただし、カルパイン2aを介したTRAF6の不安定化は、プロテアソーム阻害剤MG132、オートファジー阻害剤3-MA、またはリソソーム阻害剤NH4Clによっては逆転しませんでした（図4e）。 次に、EPC 細胞を試薬、E-64 (カルパイン加水分解酵素活性を不活性化するカルパイン阻害剤) および PMSF (非特異的セリンプロテアーゼ阻害剤) で処理しました。 カルパイン阻害剤E-64がTRAF6タンパク質レベルで分解を防止することがわかりました（図4f）。 図4gに示すように、E-64はカルパイン2aによる内在性TRAF6タンパク質レベルの分解も逆転させた。
図 4 カルパイン 2a は TRAF6 タンパク質の発現を阻害します。 a 空のベクターまたはカルパイン2a-MycプラスミドとTRAF6-フラグの時間勾配実験をEPC細胞で実施しました。 細胞溶解物を、抗 Myc、抗 Flag、および抗チューブリン Ab を用いた IB に供しました。 細胞からRNAを抽出して逆転写し、TRAF6とアクチンをPCRプライマーで増幅しました。 b EPC細胞を12-ウェルプレートに一晩播種し、TRAF6-Flagおよびカルパイン2a-Myc（0.3、0.6、または{{ 18}}.9μg）を48時間。 TRAF6-Flag および calpain2a-Myc タンパク質の発現はウェスタンブロッティングによって検出されました。 細胞からRNAを抽出して逆転写し、TRAF6とアクチンをPCRプライマーで増幅しました。 c カルパイン2a-Mycまたは空のベクターをTRAF6-フラグとともにEPC細胞に同時トランスフェクトしました。 トランスフェクションの 36 時間後、トランスフェクトされた細胞をシクロヘキシミド (CHX) で 2 または 4 時間処理しました。 d MKC 細胞をカルパイン 2a-Flag または空のベクターでトランスフェクトしました。 トランスフェクションの 48 時間後、細胞溶解物を抗 TRAF6、抗 Flag、および抗チューブリン Ab による IB に供しました。 e、f EPC細胞に、MG132、3-MA、NH4CL、E-64（50または75μM）、またはPMSFの存在下または非存在下で、指定のプラスミドを6分間トランスフェクトしました。イムノブロット分析を実行する 1 時間前。 g MKC細胞をE{{50}}（50または75μM）の存在下または非存在下でカルパイン2a-Flagで6時間トランスフェクトした後、免疫ブロット分析を実行しました。 h カルパイン2a-Flagおよびカルパイン2a-ΔCysPc-FlagをTRAF6-HAとともにEPC細胞に同時トランスフェクトした。 トランスフェクションの 48 時間後、細胞溶解物を指定の Abs による IB に供しました。 Iカルパイン2a-Flagおよびカルパイン2a-ΔCysPc-FlagをMKC細胞に同時トランスフェクトした。 トランスフェクションの 48 時間後、細胞溶解物を抗 TRAF6、抗 Flag、および抗チューブリン Ab による IB に供しました。 j カルパイン2a-Flagおよびカルパイン2a-ΔCysPc-Flagで安定に形質導入され、生理食塩水(0)で処理されるか、またはLPSで4時間チャレンジされたMKC内のIL-1、IL-8 mRNA (n=3グループごと）。 相対的な mRNA レベルは、各サンプルのアクチンをコードする遺伝子の発現に対して正規化されました。 すべての実験は少なくとも 3 つの独立した実験で実行されました。 データは二元配置分散分析によって分析されました (j)。 **p < 0.01。
TRAF6 の分解がカルパイン 2a の加水分解酵素活性に依存しているかどうかを確認するため。 哺乳類におけるカルパイン 2a の以前の構造的および生化学的研究を利用して、我々はカルパイン 2a のシステイン、ヒスチジン、およびアスパラギン残基をアラニンに変異させました (カルパイン 2a C105A、H262A、N286A、および 3 A)。これにより、触媒 - トライアッド配位が失われました 44-46。 TRAF6の分解はこの変異の影響を受けないことが観察されました（補足図1a）。 そこで、カルパイン 2a のカルパインファミリー システイン プロテアーゼ (CysPc) ドメインであるプロテアーゼ ドメインを変異させました (カルパイン 2a-ΔCysPc と指定)。 過剰発現したTRAF6も内因性TRAF6もカルパイン2a-ΔCysPcの影響を受けません（図4h、i）。 しかし、炎症誘発性サイトカインIL-1およびIL-8は、LPS刺激時に野生型または変異型カルパイン2aによって同時に影響を受けます（図4j）。 加水分解酵素活性を欠く変異体カルパイン 2a は TRAF6 のタンパク質レベルに影響を与えませんが、加水分解酵素活性を欠く変異体カルパイン 2a は依然として下流の炎症誘発性サイトカインの発現に影響を与えます。 これは、カルパイン 2a が TRAF6 を調節する潜在的なメカニズムについての研究のきっかけとなりました。 総合すると、これらの結果は、カルパイン 2a がカルパイン ヒドロラーゼ活性を通じて TRAF6 タンパク質レベルの発現を抑制することにより、NF-κB シグナル伝達を調節していることを明らかにします。
カルパイン2aはTRAF6ユビキチンリガーゼ活性を阻害します。
次に、カルパイン 2a が TRAF6- 活性化 NF-κB シグナル伝達を負に制御する分子機構と、酵素活性の喪失時のカルパイン 2a と TRAF6 の相互作用がユビキチン リガーゼ活性を調節するかどうかを調べました。 MKC 細胞を LPS で処理し、TRAF6 を免疫沈降させました。 精製組換えタンパク質を用いたユビキチン化アッセイにより、カルパイン2aおよびカルパイン2a-ΔCysPcがTRAF6のユビキチン化を減少させることが確認されました（図5a）。 図5b、cに示すように、カルパイン2aおよびカルパイン2a-ΔCysPcの両方は、TRAF6のWTおよびK63ユビキチン化タンパク質を有意に減少させた。 カルパイン2aおよびカルパイン2a-ΔCysPcの濃度勾配は、TRAF6のWTおよびK63ユビキチン化タンパク質を用量依存的に減少させた。 カルパイン2a-ΔCysPcは、TRAF6タンパク質レベルに影響を与えることなく、TRAF6のK63ユビキチン鎖凝集を依然として防止しました（図5d、e）。 次に、Flagタグ付きカルパイン2a-ΔCysPcの存在下または非存在下でMycタグ付きTRAF6を発現するようにMKC細胞をトランスフェクトし、抗Myc抗体を用いた免疫沈降実験を実施し、抗UBを用いた免疫ブロットによって分析しました。 このようなTRAF6のユビキチン化は、カルパイン2a-ΔCysPcによって実質的に減弱された(図5f)。 LPS によって刺激された TRAF6 は、K63- 結合ユビキチン鎖を TAK1 に送達し、これにより TAK1 の自己リン酸化が刺激され、NF-κB18 が活性化されます。 TAK1のWTおよびK63ユビキチンタンパク質はTRAF6の存在下で著しく増強されましたが、TAK1-関連ユビキチン化はカルパイン2a-ΔCysPcの存在下で阻害されました（図5g、h）。 これらのデータは、ヒドロラーゼ活性を欠く変異体カルパイン2aが、TRAF6タンパク質レベルに影響を与えることなく、同様にTRAF6ユビキチンリガーゼ活性を阻害することを裏付ける。
カンクサの利点-免疫システムを強化する
カルパイン2aはTRAF6のホモオリゴマー化を阻害します。
TRAF6 によって合成される Lys63 ユビキチン鎖は、シグナル伝達において重要な役割を果たします。 TRAF6 の二量体化はユビキチン鎖の合成に必須であることが報告されています 16。 二量体化モデルは、K63 ユビキチン化を生成する Ubc13 の組み合わせと密接に関連しています 16,30。 魚のTRAF6が二量体を形成できるかどうかを検証するために、異なるタグを持つTRAF6プラスミド（Mycタグ付きTRAF6とHAタグ付きTRAF6）をco-IP実験に使用しました。 IPアッセイは、Myc-TRAF6と相互作用する抗HA抗体であるHATRAF6を使用して実行されました（図6a）。 TRAF6-二量体相互作用におけるカルパイン2aの阻害効果を調べるために、Flagタグ付きカルパイン2a、HAタグ付きTRAF6、およびMycタグ付きTRAF6をHEK293細胞に一時的に発現させました。 予想通り、TRAF6-二量体相互作用はカルパイン2aの存在下で減少しました（図6b）。 同時に、カルパイン2aによるTRAF6の分解の存在を回避するため。 Flagタグ付きカルパイン2a-ΔCysPcをトランスフェクトし、TRAF6-二量体相互作用がカルパイン2a-ΔCysPcの存在下で徐々に減少することを発見しました（図6c）。 図6d、eに示すように、HA-TRAF6がMyc-TRAF6のWTおよびK63ユビキチン化を強化することがわかりました。 HEK293 細胞はカルパイン 2a およびカルパイン 2a-ΔCysPc で同時トランスフェクトされましたが、ユビキチン化の促進は抑制されました。 これらの結果は、野生型カルパイン 2a と加水分解酵素活性を欠く変異型カルパイン 2a の両方が TRAF6 のホモオリゴマー化と自己ユビキチン化を阻害することを示唆しています。
カルパイン2aは、TRAF6のユビキチン化のECSITおよびBECN1への送達を阻害します。
図5dに示すように、カルパイン2aがTRAF6からTAK1へのユビキチン化プロセスを妨げることがわかりました。 ECSIT は TAK1 および TRAF6 のアダプタータンパク質として機能し、LPS 刺激による NF-κB シグナル伝達を促進することが報告されています 37。 ECSITが硬骨魚類で前述の機能を持っているかどうかを検証するために、ヒト、マウス、およびキベリのECSITタンパク質の複数の配列アラインメントを実行しました（補足図1b）。 EPC細胞にNF-κBルシフェラーゼレポーターをトランスフェクトしたところ、ECSITはLPS刺激後にNF-κBレポーター活性を大幅に増強しました（補足図1c）。 MKC細胞におけるECSITの過剰発現は、TNF-のmRNAレベルの上方制御を引き起こしました（補足図1d）。 HEK293細胞に魚のECSITとTRAF6をトランスフェクトした後、TRAF6がECISTと相互作用することがわかりました（図7a）。 同様に、ECSIT と TAK1 を同時トランスフェクトし、2 つのタンパク質も相互作用を維持しました (図 7b)。 続いて、カルパイン2a-ΔCysPcがTRAF6-ECSIT複合体の形成を阻害するかどうかを検証するために、3つのプラスミドをHEK293細胞にトランスフェクトし、カルパイン2a-ΔCysPcがTRAF6-ECSIT複合体を阻害することを発見しました（図7c） ）。 NF-κBシグナル伝達におけるユビキチン鎖の伝達プロセスを検証する。 図7dに示すように、TRAF6はECSITのユビキチン化を促進する可能性があります。 予想通り、カルパイン2a-ΔCysPcは、TRAF6がユビキチン鎖をECSITに伝達するプロセスを阻害した。 BECN1 は、LPS 誘導オートファジーにおける重要なタンパク質です。 K63 のユビキチン化により BECN1 が修飾され、活性化されることが確認されています。 脱ユビキチン化酵素 A20 は BECN1 のユビキチン化を除去し、LPS によって引き起こされるオートファジーを阻害します。TRAF6 は、このシグナルにおける BECN1 のユビキチン化を担う E3 リガーゼです 47。 図7eに示すように、TRAF6はBECN1と相互作用し、BECN1のユビキチン化を促進しました。 次に、BECN1、TRAF6、カルパイン2a、およびカルパイン2a-ΔCysPcをHEK293細胞にトランスフェクトしたところ、TRAF6はBECN1のユビキチン化を促進しました。 カルパイン2a-ΔCysPcは、TRAF6がユビキチン鎖をBECN1に伝達するプロセスを阻害した（図7f）。 これらの結果は、野生型カルパイン2aおよび加水分解酵素活性を欠く変異型カルパイン2aが、LPS誘導性オートファジーおよびNF-κBシグナル伝達におけるTRAF6のユビキチン化能力を阻害することを示唆している。
カルパイン2aによる抗ウイルス応答の負の制御。
RLR 経路では、TRAF6 は MAVS によって動員される E3 リガーゼとして機能し、NF-κB、IFN およびサイトカインの産生を活性化します。 次に、カルパイン 2a が IFN 媒介抗ウイルスプロセスにおいて TRAF6 の阻止に役割を果たしているかどうかを調べました。 EPC 細胞では、IFN-1、ISRE、および IRF3 プロモーター駆動のルシフェラーゼ レポーターが発現されました。 我々は、カルパイン２ａが、プロイ（Ｉ：Ｃ）刺激およびシニペルカチートラブドウイルス（ＳＣＲＶ）感染時に、用量依存的にこれらのプロモーター駆動のルシフェラーゼ活性を実質的に低下させることを発見した（図８ａ、ｂ）。 カルパイン２ａのノックダウンは、Ｐｌｏｙ（Ｉ：Ｃ）およびＶｉｐｅｒｉｎ、Ｍｘ１、およびＩＳＧ１５を含むＳＣＲＶ誘発遺伝子発現を有意に増強した（図８ｃ、ｄ）。 カルパイン2aのノックダウンにより、MKC細胞におけるSCRV感染時の細胞生存率の発現が増加しました（図8e）。 図8fに示すように、細胞増殖アッセイにより、カルパイン2aのノックダウンがSCRV感染時の細胞増殖を増強することが明らかになった。 SCRV感染後のウイルス複製に反映されるように、カルパイン2aの過剰発現はウイルスの増殖を急激に促進しました（図8g）。 カルパイン2aおよびカルパイン2a-ΔCysPcは、Ploy（I：C）刺激およびSCRV感染時に、IFN-1、ISREおよびIRF3プロモーター駆動のルシフェラーゼレポーターを大幅に減少させました（補足図2a、b）。 これらの結果は、カルパイン2aがTRAF6の阻害を通じてRLRシグナル伝達経路を負に調節し、それによってIFNの活性化を阻害する可能性があることを示唆している。
図 5 カルパイン 2a は TRAF6 ユビキチンリガーゼ活性を阻害します。 a カルパイン2a-Flagおよびカルパイン2a-ΔCysPc-Flagで形質導入され、チャレンジされなかった(-)またはLPSでチャレンジされた(+)MKC細胞における内在性TRAF6のユビキチン化。抗TRAF6による免疫沈降および入力免疫ブロット分析後の抗ユビキチンによる免疫ブロット分析によって評価示された絶対値。 b、c HEK293細胞を、TRAF6-HAおよびWT-ユビキチン-HisまたはK63Oユビキチン-His（リジン63のみが保持される）と、カルパイン2a-Flag、カルパイン2a-ΔCysPc-Flagまたは空のベクターとともに同時トランスフェクトしました。 トランスフェクションの 24 時間後、細胞を溶解し、Ni-NTA アガロースで精製しました。 d、e HEK293細胞を、TRAF{{30}}HAおよびWT-ユビキチン-HisまたはK63O-ユビキチン-His（リジン63のみが保持される）とカルパイン2a-Flag（{{45 }}.5 ug、1 ug)、カルパイン2a-ΔCysPc-Flag (0.5 ug、1 ug)、または空のベクター。 トランスフェクションの 24 時間後、細胞を溶解し、Ni-NTA アガロースで精製しました。 f カルパイン2a-ΔCysPc-Flagで形質導入されたMKC細胞における過剰発現TRAF6のユビキチン化。抗Mycによる免疫沈降後の抗ユビキチンによる免疫ブロット分析および示されたAbによる入力免疫ブロット分析によって評価。 g、h HEK293細胞を、TAK1-Myc、TRAF6-HA、およびWT-ユビキチン-HisまたはK63O-ユビキチン-His（リジン63のみが保持される）とカルパイン2a-Flagで同時トランスフェクトしました。 、calpain2a-ΔCysPc-Flag または空のベクター。 トランスフェクションの 24 時間後、細胞を溶解し、Ni-NTA アガロースで精製しました。 すべての免疫沈降物と、抗 Myc、抗 Flag、抗 HA、および抗チューブリン Ab を使用したインプット免疫ブロット分析。 すべての実験は少なくとも 3 つの独立した実験で実行されました。
カルパイン2aは、TRAF6からのIRF3およびIRF7のユビキチン化を抑制します。
MAVS-TRAF3/6複合体によって引き起こされる抗ウイルスシグナルにおいて、TRAF6の活性がIRF3およびNF-κB48の活性化に必要であることが報告されている。 図9a、bに示すように、TRAF6はWTおよびIRF3のK63-関連ユビキチン化を促進し、この強化はカルパイン2a-ΔCysPcの発現によって阻害されます。 一方、ウイルスがTLR依存性シグナル伝達シグナルを誘発すると、TRAF6はIRF7と密接に関連し、活性化された抗ウイルス因子とともにIRF7のユビキチン化を促進します22、49、50。 TRAF6は、WTおよびK63-に関連したIRF7のユビキチン化を促進し、この強化はカルパイン2a-ΔCysPcの発現によって阻害されます（図9c、d）。 これらのデータは、野生型カルパイン 2a および加水分解酵素活性を欠く変異型カルパイン 2a が、TRAF6- を介した IRF3 および IRF7 のユビキチン化を阻害することを示唆しています。
議論
TRAF6 は、腫瘍壊死因子 (TNF) 受容体関連因子 (TRAF) ファミリーの 7 つのメンバーのうちの 1 つであり、シグナルアダプターとして同定されており、シグナル伝達を行います 51,52。 TRAF ファミリーには、E3 リガーゼ活性を有する環指ドメインが含まれています。 HECT ドメインを持つ E3 リガーゼは基質のポリユビキチン化を促進し、リング ドメインを持つ E3 はポリユビキチン化を伝達するために E2_ub を必要とします 53,54。 二量体 Ub 結合酵素 Ubc13/Uev1A は、TRAF6 のポリユビキチン化の凝集に関与していることが確認されています 16。 マウス TRAF6 の K124 がノックアウトされると、TRAF6 は K63 自己ユビキチン化の活性を失い、この部位の変異により TRAF6- 媒介 NEMO のユビキチン化と TAK1、IKK、NF-κB55 の活性化が排除されます。 。 PRDX1 は K124 に含まれる TRAF6 環指ドメインに結合し、TRAF638 のユビキチン化を除去するため、これは正確です。 TRAF6 のユビキチン化は、その N 末端ドメイン (リングフィンガーおよび ZF フィンガードメイン) の二量体化と密接に関連していることが報告されています。 Ubc13との複数のN末端相互作用部位が変異しており、Ubc13はpoly~ubをTRAF616に伝達できなかった。 カルパイン2aとTRAF6変異体との間の相互作用は、リングフィンガードメインを除いて、TRAF6のほとんどのドメインがカルパイン2aと相互作用することを示した。 カルパイン2aとTRAF6のZFフィンガードメイン間の相互作用により、我々はカルパイン2aがTRAF6の二量体化をブロックすることで自己ユビキチン化を阻害するのではないかと推測した。 続いて、TRAF6 のさまざまなタグの相互作用を検証しました。 加水分解酵素活性を欠く変異体カルパイン2aの発現が増加するにつれて、TRAF6の異なるタグの相互作用が弱まった。 HAタグ付きTRAF6はMycタグ付きTRAF6のユビキチン化を促進し、変異型カルパイン2aはHAタグ付きTRAF6によって増強されるユビキチン化を阻害する。 TRAF6-TAK1 シグナル伝達のプロセスの中間体として、ECSIT は TRAF6 の C 末端ドメイン (CC ドメインおよび TRAF-C ドメイン) に結合し、NF-κB シグナル伝達に関与することが確認されています 37。 ECSITKD THP-1 細胞では炎症誘発性サイトカインの発現が減少しました。 しかし、ECSITKD THP-1 細胞で ECSIT を過剰発現させた後、IRF7、IL-1、CD44 などの遺伝子が大幅に増加しました 37。 PRDX1 は TRAF6 のリングフィンガードメインに結合し、TRAF6 のポリユビキチン化の形成を阻害することで、NF-κB における ECSIT および BECN1 のユビキチン化とオートファジーシグナルを阻害します 38。 硬骨魚類では、ECSITがNF-κBシグナル伝達経路を活性化し、TRAF6およびTAK1とそれぞれ相互作用し、TRAF6によって生成されるポリユビキチン鎖を伝達することを確認した。 カルパイン2aはTRAF6のZFドメイン、CCドメイン、TRAF-Cドメインに結合し、TRAF6-ECSITの相互作用を阻害した。 我々は、加水分解酵素活性を欠く変異カルパイン2aがTRAF6からECSITおよびBECN1へのポリユビキチン鎖を妨げることを確認した。
図 6 カルパイン 2a は TRAF6 の自己ユビキチン化を弱めます。 a HEK293 細胞を TRAF6-Myc、TRAF6-HA、または空のベクターでトランスフェクトしました。 トランスフェクションの 24 時間後、細胞を溶解し、HA 抗体で IP 分析しました。 b HEK293 細胞を TRAF6-Myc、TRAF6-HA、空ベクター、またはカルパイン 2a-Flag でトランスフェクトしました。 トランスフェクションの 24 時間後、細胞を溶解し、HA 抗体で IP 分析しました。 c HEK293細胞をTRAF6-Myc、TRAF6-HA、空ベクター、またはさまざまな濃度のカルパイン2a-ΔCysPc-Flagでトランスフェクトしました。 トランスフェクションの 24 時間後、細胞を溶解し、HA 抗体で IP 分析しました。 d、e HEK293細胞を、TRAF6-Myc、TRAF6-HA、およびWT-ユビキチン-HisまたはK63O-ユビキチン-His（リジン63のみが保持される）とカルパイン2a-Flagで同時トランスフェクトしました。 、calpain2a-ΔCysPc-Flag または空のベクター。 トランスフェクションの 24 時間後、細胞を溶解し、Ni-NTA アガロースで精製しました。 免疫沈降と、抗 Myc、抗 Flag、抗 HA、および抗チューブリン Abs による免疫ブロット分析を入力します。 すべての実験は少なくとも 3 つの独立した実験で実行されました。
図 7 カルパイン 2a は、TRAF6- を介した ECSIT および BECN1 のユビキチン化を阻害します。 a HEK293 細胞を ECSIT-Myc、TRAF6-Flag、または空のベクターでトランスフェクトしました。 トランスフェクションの 24 時間後、細胞を溶解し、Flag 抗体を使用して IP 分析しました。 b HEK293 細胞を TAK1- Flag、ECSIT-Myc、または空のベクターでトランスフェクトしました。 トランスフェクションの 24 時間後、細胞を溶解し、Myc 抗体で IP 分析しました。 c HEK293細胞をTRAF6-Myc、ECSIT-HA、空ベクター、またはさまざまな濃度のカルパイン2a-ΔCysPc-Flagでトランスフェクトしました。 トランスフェクションの 24 時間後、細胞を溶解し、Myc 抗体で IP 分析しました。 d HEK293細胞をECSIT-Myc、TRAF6-HA、WT-ユビキチン-Hisとカルパイン2a-Flag、カルパイン2a-ΔCysPc-Flagまたは空のベクターで同時トランスフェクトしました。 トランスフェクションの 24 時間後、細胞を溶解し、Ni-NTA アガロースで精製しました。 e HEK293 細胞を BECN1-Flag、TRAF6-Myc、または空のベクターでトランスフェクトしました。 トランスフェクションの 24 時間後、細胞を溶解し、Myc 抗体で IP 分析しました。 f HEK293細胞を、カルパイン2a-Flag、カルパイン2a-ΔCysPc-Flagまたは空のベクターとともにBECN1-HA、TRAF6-Myc、WT-ユビキチン-Hisで同時トランスフェクトしました。 トランスフェクションの 24 時間後、細胞を溶解し、Ni-NTA アガロースで精製しました。 免疫沈降し、抗 Myc、抗 Flag、抗 HA、および抗チューブリン Abs をインプットします。 すべての実験は少なくとも 3 つの独立した実験で実行されました。
私たちは、カルパイン 2a がカルシウム依存性プロテアーゼ ファミリーの 1 つとして加水分解酵素活性を持っていることに気づきました。 m-カルパイン (カルパイン-2) は、HepG2 肝細胞の NF-κB シグナル伝達経路において正の制御役割を果たします。 26 s プロテアソーム アプローチとは独立して、カルパイン 2a は IkB を加水分解して転写因子 NF-κB を放出します。 カルパインタンパク質の特異的阻害剤は、IkB 56 の分解を防ぎます。しかし、カルパインについては、魚の自然免疫応答に関する研究はほとんどありません。 MKC 細胞では、カルパイン 2a の過剰発現により、LPS によって誘導される NF-κB 下流の炎症誘発性サイトカインが阻害されました。 この現象は、HepG2 肝細胞での結果とは反対でした。 カルパインタンパク質ファミリーの種特異性が異なる効果を引き起こした可能性があります。 同様に、カルパインタンパク質 E-64 の特異的阻害剤を使用して、カルパイン 2a による TRAF6 の加水分解を防止しました。 ヒドロラーゼ活性を欠く変異カルパイン2aは、タンパク質レベルに影響を与えることなく、TRAF6ユビキチンリガーゼ活性を阻害します。 カルパイン2aの酵素活性部位は見つかりませんでした。 哺乳類におけるこれまでの研究によれば、その 3 つの部位は、システイン (C105A)、ヒスチジン (H262A)、およびアスパラギン残基 (N286A) です。 しかし、私たちの実験では、ミユイニベカルパイン2aの3つの活性部位はTRAF6タンパク質レベルの発現に影響を及ぼさないが、加水分解酵素ドメインを欠く変異体カルパイン2aは影響を与えることが確認された。 したがって、酵素活性化構造ドメイン全体を変異させることを選択しました。 タンパク質カルパイン 2a は哺乳類および下等脊椎動物で比較的保存されていますが、特定の酵素活性部位はさらなる研究に値します。
カンサス植物の免疫システムを高める
要約すると、本発明者らは、カルパイン２ａが、ＬＰＳ誘導性のＮＦ－κＢシグナル伝達およびウイルス誘導性のＩＦＮ活性化の負の調節因子であることを同定した（図９ｅ）。 質量分析では、カルパイン 2a が TRAF6 と相互作用する可能性があり、我々は内因性共免疫沈降実験によってこの現象を実証しました。 私たちは、カルパイン 2a が LPS 誘導性 NF-κB シグナル伝達経路の調節に関与していることを発見しました。 さらに、TRAF6 は抗ウイルスシグナル伝達経路でも重要な役割を果たします。 私たちは、SCRV と Ploy(I:C) を使用して IFN シグナル伝達経路を刺激し、カルパイン 2a がタンパク質レベルと TRAF6 の自己ユビキチン化を調節することによって IFN シグナル伝達も阻害する可能性があることを発見しました。 TLR3 はウイルス感染によって生成される二本鎖 RNA (dsRNA) 構造を認識できるためです。 私たちは、TRAF6-媒介IFNシグナル伝達経路のカルパイン2a制御を解明することにさらに興味を持っていますが、カルパイン2aとTLR3シグナル伝達経路の間の潜在的な関係を排除するものではありません。 カルパイン2aは加水分解的にTRAF6の分解を促進し、TRAF6と相互作用して二量体の形成と自己ユビキチン化を阻害した。 この阻害により、TRAF6 と ECSIT の相互作用、および TRAF6 から ECSIT、BECN1、IRF3、および IRF7 へのユビキチン化転移プロセスが妨げられました。 我々の今回の結果は、自然免疫応答におけるTRAF6を標的とすることにより、負の制御機構の理解に貢献するであろう。 さらに、この研究は、魚の自然免疫応答の過程におけるTRAF6のホモオリゴマー化と自己ユビキチン化の重要な役割を示しています。 同時に、カルパイン 2a は、TRAF6 の免疫応答を阻害し、正常かつ秩序あるシグナル経路を妨げる制御機構タンパク質として提案されています。 この洞察は、脊椎動物の免疫学と脊椎動物の免疫系の進化を理解するのに役立ちます。
図 8 カルパイン 2a は、SCRV またはポリ(I:C) 誘導性の IFN 活性化を阻害します。 ab EPC 細胞を、IFN-1、ISRE、および IRF3- プロ ルシフェラーゼ レポーターとともに、さまざまな濃度のカルパイン 2a-Flag または空のベクターでトランスフェクトしました。 トランスフェクションの 24 時間後、細胞を疑似感染するか、SCRV または Poly(I:C) で 12 時間感染させました (グループあたり n=3)。 ウェスタンブロット分析を使用して、一過性にトランスフェクトされたカルパイン2a-Flagの発現を測定しました。 チューブリンの発現をローディングコントロールとして使用しました。 c、d si-カルパイン2a #1またはsi-ctrl（コントロールベクター）で安定に形質導入され、生理食塩水（0）で処理されるか、SCRVまたはPoly（I：C）でチャレンジされたMKC内のViperin、Mx1、ISG15 mRNA 24時間。 相対的な mRNA レベルは、各サンプルのアクチンをコードする遺伝子の発現に対して正規化されました (グループあたり n=3)。 e、f MKC細胞にsi-ctrlまたはsi-calpain2a #1のいずれかをトランスフェクトしました。 トランスフェクションの 24 時間後、細胞を SCRV で 24 時間刺激し、その後細胞生存率アッセイと細胞増殖アッセイを測定しました (グループあたり n=3)。 スケールバー、100 μm。 g MKC細胞にカルパイン2a-FlagまたはpcDNA3.1をトランスフェクトし、次にSCRVを24時間感染させた(グループあたりn=3)。 細胞内および上清の SCRV RNA 発現について qRT-PCR 分析を実施しました。 すべての実験は少なくとも 3 つの独立した実験で実行されました。 データは、一元配置分散分析 (a、b)、二元配置分散分析 (c、d、e、f)、または両側スチューデント t 検定 (g) によって分析されました。 *p < 0.05、**p < 0.01。
メソッド
細胞培養。
ヒト胎児腎臓 (HEK) 293 細胞株および丘疹上皮腫キプリニ (EPC) 細胞株は、American Type Culture Collection から購入し、私たちの研究室に保管しました。 Miiuy croaker (M. miiuy) 腎臓細胞株 (MKC) および Miiuy croaker 腸細胞株 (MIC) は、miiuy croaker の腎臓および腸組織から培養されました 57,58。 Miiuy croaker 腎臓細胞株と Miiuy croaker 腸細胞株を、15% FBS (Gibco) を補充した L-15 培地 (HyClone、米国) で 0.5% CO2 を含む加湿インキュベーター内で 26 度で培養しました。 、米国）、100 U/ml ペニシリン（Gibco、米国）、100 ug/ml ストレプトマイシン（Gibco、米国）、および 20 U/ml ヘパリン（Solarbio、中国）。 丘疹上皮腫細胞は、10% FBS、2 mM L-グルタミン、100 U/ml ペニシリン、および 100 mg/ml ストレプトマイシンを補充した培地 199 (Hyclone) 中で 5% CO2 を含む加湿インキュベーター内で 26 度で増殖させました。 ヒト胎児腎臓 293 細胞を、10% FBS、2 mM L-グルタミン、100 U/ml ペニシリン、および 100 mg を添加したダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) (Invitrogen) 中で 5% CO2 を含む加湿インキュベーター内で 37 度で増殖させました。 /mlストレプトマイシン。
図 9 カルパイン 2a は、TRAF6- を介した IRF7 および IRF3 のユビキチン化を阻害します。 b HEK293細胞を、カルパイン2a-Flag、カルパイン2a-ΔCysPcとともに、IRF3-Myc、TRAF6-HA、およびWTubiquitin-HisまたはK63O-ユビキチン-His（リジン63のみが保持される）で同時トランスフェクトしました。 -フラグまたは空のベクトル。 トランスフェクションの 24 時間後、細胞を溶解し、Ni-NTA アガロースで精製しました。 c、d HEK293細胞を、IRF7-Myc、TRAF6-HA、およびWT-ユビキチンHisまたはK63O-ユビキチン-His（リジン63のみが保持される）とカルパイン2a-Flag、カルパイン2aで同時トランスフェクトしました。 -ΔCysPc-Flag または空のベクトル。 トランスフェクションの 24 時間後、細胞を溶解し、Ni-NTA アガロースで精製しました。 すべての免疫沈降と抗 Myc、抗 Flag、抗 HA、および抗チューブリン Abs のインプット。 すべての実験は少なくとも 3 つの独立した実験で実行されました。 e TRAF6-媒介シグナル伝達経路におけるカルパイン2aの役割を詳述するモデル。 LPS とウイルスにより、TRAF6 が活性化され、ホモオリゴマー化と自己ユビキチン化が行われる可能性があります。 BECN1、ECSIT、IRF7、および IRF3 は TRAF6 によってユビキチン化され、下流シグナルの活性化を引き起こします。 負の制御因子としてのカルパイン2aはTRAF6を標的とし、TRAF6-媒介シグナル伝達経路を阻害します。
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