RNA M6 リーダー YTHDF2 が NK 細胞の抗腫瘍および抗ウイルス免疫を制御するパート 6

転移性黒色腫モデルと MCMV チャレンジ

B16F10 細胞 (105 個) をマウスに静脈注射しました。 注射の 14 日後、死後分析のためにマウスを安楽死させました。 肺内の転移性結節を肉眼的に分析し、計数した。 B16F10 細胞株は、Hua Yu (City ofHope、ロサンゼルス、カリフォルニア州) から提供されました。 Ythdf2ΔNK および Ythdf2WT マウスを、American Type Culture Collection (VR-1399) から購入したスミス株 MCMV (2.5 × 104 PFU) の腹腔内注射で感染させました。 末梢血サンプルは、感染後 0、4、および 7 日目に顎下穿刺によって採取されました。

肺転移結節とは、他の部位からの悪性腫瘍細胞が血液またはリンパ系を通って肺に移動して形成される結節を指します。 多くの患者にとって、これは肺がんの一般的な症状です。

しかし、肺転移結節は患者の身体的健康を脅かしますが、それと記憶の間に直接の関係はありません。 したがって、私たちは肺がんや肺転移結節という課題に積極的に直面し、否定的な感情や不安が心身の健康に影響を与えないようにする必要があります。

同時に、いくつかのポジティブな方法を通じて記憶力を維持し、向上させることができます。 たとえば、数学的な計算、読書、音楽を聴く、ゲームなどの記憶力トレーニングを実行します。さらに、定期的な運動、十分な睡眠、健康的な食事などの良い生活習慣を守ることも効果的です。私たちの記憶力を向上させます。

最も重要なことは、ポジティブな姿勢を保つことです。 どのような困難に直面しても、自分の強さと神経系の柔軟性を信じなければなりません。前向きな調整と対応を通じて、最終的には困難をうまく克服できるでしょう。

つまり、肺の転移性結節は身体の健康に脅威を与えますが、記憶には直接関係しません。 私たちはそれを前向きに捉え、生活習慣を調整し、良い姿勢を保つことで記憶力を維持し、向上させる必要があります。 私たちは記憶力を向上させる必要があることがわかります。カンクサにはアセチルコリンや成長因子のレベルを高めるなど、神経伝達物質のバランスも調節できるため、記憶力を大幅に向上させることができます。 これらの物質は記憶と学習にとって非常に重要です。 さらに、カンクサは血流を改善し、酸素の供給を促進するため、脳に十分な栄養素とエネルギーが確実に供給され、脳の活力と持久力が向上します。 私たちは記憶力を向上させる必要があることがわかります。カンクサにはアセチルコリンや成長因子のレベルを高めるなど、神経伝達物質のバランスも調節できるため、記憶力を大幅に向上させることができます。 これらの物質は記憶と学習にとって非常に重要です。 さらに、カンクサは血流を改善し、酸素の供給を促進するため、脳に十分な栄養素とエネルギーが確実に供給され、脳の活力と持久力が向上します。

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末梢血、脾臓、肝臓のウイルス量を測定するため、qPCR 分析用の QIAGEN DNeasy Blood and Tissue Kit を使用して DNA を単離しました。 次のプライマーを使用しました: MCMV-IE1、59-AGCCACCAACATTGACCACGCAC-39 (順方向) および MCMVIE1、59-GCCCCAACCAGGACACACAACTC-39 (逆方向)。

IL による in vivo マウス治療-15

IL-15によるin vivoマウス治療のために、Ythdf2ΔNKおよびYthdf2WTマウスに2μgの組換えヒトIL-15（カタログ番号745101; National Cancer Institute）を5日間腹腔内注射した。 次いで、処理マウスと対照マウスをフローサイトメトリー分析のために安楽死させた。

フローサイトメトリー

以前に記載されているように（Wang et al.、2018b）、Ythdf2ΔNKおよびYthdf2WTマウスのBM、血液、脾臓、肝臓、および肺から単細胞懸濁液を調製しました。 フローサイトメトリー分析とセルソーティングは、それぞれ LSRFortessa X-20 と FACSAriaFusion フローサイトメーター (BD Biosciences) で実行されました。

データはNovoExpressソフトウェア(Agilent Technologies)を使用して分析した。

BD Biosciences、BioLegend、Invitrogen、または Cell Signaling Technology の次の蛍光色素標識抗体が使用されました: CD3ε (145-2C11)、CD19 (1D3)、Gr-1 (RB6-8C5) )、TER-119 (TER-119)、CD11c (N418)、CD4 (GK1.5)、CD8 (53-6.7)、CD122 (5H4)、CD132 (TUGm2)、 NK1.1 (PK136)、CD11b (M1/70)、CD27 (LG.3A10)、CD117 (2B8)、CD127 (SB/199)、CD135 (A2F10.1)、KLRG1 (2F1)、CD45 ({{46 }}F11)、CD45.1 (A20)、CD45.2 (104)、IFN- (XMG1.2)、2B4 (m2B4)、グランザイム B (QA16A02)、パーフォリン (S16009A)、Ly49H (3D10)、Ly49D ( 4e5)、CD69 (H1.2F3)、CD226(TX42.1)、NKG2D (CX5)、NKG2A (16A11)、NKp46 (29A1.4)、TIGIT(1G9)、PD-1 (J43)、アネキシンV、Ki67 (b56)、Tbet (4b10)、および Eomes(WD1928)、ホスホ-p44/42 Erk1/2 (Thr202/Tyr204、#9101)、ホスホ-Akt (Ser473、#5315)、ホスホ-S6 リボソームタンパク質、phospho-Stat3 (Tyr705、#9145)、および phospho-Stat5 (Tyr694、#9539)。

NK細胞の増殖を評価するために、細胞をレシピエントマウスに移す前に、製造業者のプロトコールに従って5μM CTV(Invitrogen)で細胞を標識した。 Ki67、Tbet、および Eomes の細胞内染色は、Foxp3/転写因子染色キット (eBioscience) を使用して固定および透過処理することによって実行されました。

リン酸化タンパク質の検出のため、精製した脾臓 NK 細胞を組換えヒト IL-15 (50 ng/ml) で 1 時間前処理し、その後 Phosflow Fix Buffer I で固定し、続いて Phosflow Perm Buffer III (BD Biosciences) で透過処理し、抗体。

養子細胞移植

NK 細胞成熟に対する Ythdf2 欠損の影響を評価するために、CD45.1 または Ythdf2ΔNK CD45.2 マウスからの 5 × 106 BM 細胞の 1:1 の混合物を Rag2-/-Il2rg-/- マウスに同時移植しました。 移植から 8 週間後に、レシピエントの再構成をフローサイトメトリーによって評価しました。

リンパ球減少症誘発恒常性増殖実験では、CD45.1 または Ythdf2ΔNK CD45.2 マウスからの同数の精製脾臓 NK 細胞を Rag2-/-Il2rg-/- マウスに同時導入し、続いて脾臓に導入された WT NK 細胞と Ythdf2ΔNK NK 細胞の相対パーセンテージを評価しました。示された時点でのフローサイトメトリーによるRag2-/-Il2rg-/-レシピエントの。

転移性黒色腫モデルの場合、Ythdf2ΔNKまたはYthdf2WTマウスからの106μL-2拡張NK細胞をRag2-/-Il2rg-/-マウスに静脈内注射した。 1日後、B16F10細胞(105個)をマウスに静脈内注射した。 注射の14日後、死後分析のためにマウスを安楽死させた。 いくつかの実験では、細胞を CTV (5 μM、Invitrogen) で標識して、移入前に細胞増殖を追跡しました。

インビボ輸送アッセイ

BMから末梢血へのNK細胞輸送を検出するために、1μgのAPC標識抗CD45抗体をC57BL/6マウスに静脈注射した。 抗体注射の 2 分後、マウスを直ちに安楽死させ、細胞を CD3 および NK1.1 抗体で染色した後、フローサイトメトリーのために BM 細胞を収集しました。 実質NK細胞はCD45染色の欠如によって同定されたが、類洞NK細胞はCD45標識の存在によって同定された。 したがって、正洞領域の NK 細胞 (CD45+) と実質領域の NK 細胞 (CD45-) の比率は、定常状態での BM 上部末梢血からの NK 細胞輸送を示します。

リアルタイム RT-qPCR および免疫ブロッティング

ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してＲＮＡを単離し、次いで、製造業者の指示に従って、ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒを備えたＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。 mRNA 発現レベルは、SYBRGreen PCR Master Mix および QuantStudio 12K Flex Real-TimePCR System (どちらも Thermo Fisher Scientific 製) を使用して分析しました。 プライマー配列を表 S1 に示します。

免疫ブロッティングは、以前に記載されているように（Denget al., 2015; Yu et al., 2006）、標準的な手順に従って実行されました。 以下の抗体を使用しました:METTL3 (カタログ番号 15073-1-AP; Proteintech)、METTL14 (カタログ番号 26158-1-AP; Proteintech)、YTHDF1 (カタログ番号 17479-1-AP) ; Proteintech)、YTHDF2 (カタログ番号 RN123PW; MBL)、YTHDF3 (カタログ番号 25537-1-AP; Proteintech)、ALKBH5 (カタログ番号 ab195377; アブカム)、FTO (カタログ番号 ab124892;アブカム)、MDM2 (カタログ番号 33-7100、Invitrogen)、TDP-43 (カタログ番号 PA5-29949、Invitrogen)、および -actin(カタログ番号 {{20 }}Ig; プロテインテック）。

siRNAノックダウンアッセイ

IL-2–expanded NK cells were transfected with Accell mouse Tardbp siRNA (cat. no. E-040078-00-0005; Dharmacon) or Mdm2 siRNA (cat. no. E-041098-00-0005; Dharmacon) using Accell delivery media (Dharmacon) according to the manufacturer's instructions in the presence of IL-15 (50 ng/ml). The Accell eGFP control pool was used as siRNA control. The transfection efficiency was >フローサイトメトリーで測定すると90%。 Geneknockdown 効率は、qPCR およびイムノブロッティングによって測定されました。 トランスフェクションの３日後、細胞のアポトーシスおよび増殖を、上記のようにフローサイトメトリーによって分析した。

ルシフェラーゼレポーターアッセイ

TSS の -2,000 bp から +100 bp の範囲の Ythdf2 プロモーター領域をマウス NK 細胞から増幅し、apGL4-Basic Luciferase Reporter Vector (Promega) にクローニングして apGL を生成しました{ {5}}Ythdf2 レポーター プラスミド。 ATCC から購入した HEK293T 細胞を、トランスフェクション効率の正規化のために、pGL{8}}Ythdf2 レポーター プラスミド、STAT5a または STAT5b 過剰発現プラスミドまたは空のベクターで、pRL-TK Renilla レポーター プラスミド (Promega) とともに同時トランスフェクトしました。 トランスフェクションの24時間後に細胞を溶解のために回収し、Dual-Luciferase System (Promega)を用いてルシフェラーゼ活性を蛍光定量的に定量した。 Ythdf2プロモーターおよびSTAT5aおよびSTAT5b過剰発現プラスミドをクローニングするためのプライマー配列を表S1に示します。

ChIP アッセイ

ChIPアッセイは、Pierce Magnetic ChIP Kit(カタログ番号26157; Thermo Fisher Scientific)を製造者の指示に従って使用して実施した。 簡単に説明すると、等量の抗抗リン酸 Stat5 (Tyr694、カタログ番号 9351; Cell Signaling Technologies) または対応する対照正常ウサギ IgG を個別に使用して、5 × 由来の架橋 DNA-タンパク質複合体を沈殿させました。 IL-15 (50 ng/ml) で 1 時間前処理した 106 個の精製マウス初代 NK 細胞。 架橋の逆転に続い​​て、示された抗体によって免疫沈降された DNA を qPCR によってテストしました。 すべてのプライマーの配列を表 S1 に示します。

Ex vivo 細胞毒性アッセイ

NK 細胞の Ex vivo 細胞毒性は、標準的な 51Crrelease アッセイによって評価されました。 Andre´Veillet (マギル大学、モントリオール、カナダ) から寄贈されたマウスリンパ腫細胞株 RMA-S (MHC クラス Ideficient) および RMA (MHC class I fully) 細胞をターゲット細胞として使用しました。 マウスを、ポリイノシン酸:ポリシチジル酸[ポリ(I:C); 200 μg/マウス] 18 時間。 ポリ(I:C)活性化NK細胞は、EasySepMouse NK Cell Isolation Kit (STEMCELL Technologies)を使用して脾臓から単離されました。 精製したNK細胞を、IL-2 (50 U/ml)の存在下で5:1、2.5:1、および1.25:1の比率で標的細胞と共培養しました。

m6A-seq(エムシックスキュー)

精製した脾臓 NK 細胞を、IL-2 (1,000 U/ml、カタログ番号 Bulk Ro 23-6019; National Cancer Institute) によってインビトロで 7 日間増殖させました。 総 RNA は、TRIzol 試薬 (Thermo FisherScientific) によって 5,000 万個の IL-2 で増殖した NK 細胞から単離されました。 Dynabeads mRNA Purification Kit (Invitrogen) を使用して、ポリアデニル化 RNA を全 RNA からさらに濃縮しました。 mRNAサンプルは、RNA断片化試薬(Invitrogen)を用いて100-nt長の断片に断片化されました。

断片化されたｍＲＮＡ（５μｇｍＲＮＡ）を、Ｍａｇｎａ ＭｅＲＩＰ ｍ６Ａキット（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の標準プロトコールに従って、ｍ６Ａ抗体（２０２００３；Ｓｙｎａｐｔｉｃ）を使用するｍ６Ａ免疫沈降に使用した。 KAPA RNA HyperPrep Kit(Roche)を使用したライブラリー生成のために、RNA Clean & Concentrator-5 (Zymo Research)を通じてRNAを濃縮しました。 シークエンシングは、City of Hope のゲノミクス施設で Illumina HiSeq 2500 マシンを使用し、シングルリード 50- bp モードで実行されました。 シーケンシングリードは、HISAT2 v101 ソフトウェアを使用してマウスゲノムにマッピングされました (Kim et al., 2015)。

免疫沈降およびインプットライブラリーのマップされたリードは、R パッケージ exomePeak を使用して提供されました (Meng et al., 2014)。 m6Apeaks は、Integrative Genomics Viewer ソフトウェア (http://www.igv.org) を使用して視覚化されました。 m6A 結合モチーフは MEME (https://meme-suite.org) および HOMER (http://homer.ucsd.edu/homer/motif) によって解析されました。 コールされたピークには、Rpackage ChIPseeker を使用して遺伝子構造との交差によって注釈が付けられました (Yu et al., 2015)。

StringTie was used to assess expression levels for mRNAs from input libraries by calculating the total exon fragments/mapped reads in millions × exon length in kb (Pertea et al., 2015). The differentially expressed mRNAs were selected with log2(fold change) >1 orlog2(倍数変化)<−1 and P < 0.05 using the R package edgeR (Robinson et al., 2010).

YTHDF2 RIP シーケンス

50 百万 IL-2 の増殖した NK 細胞を収集し、冷 PBS で 2 回洗浄し、細胞ペレットを 2 容量の溶解バッファー (10 mM Hepes、pH 7.6、150) で溶解しました。 mM KCl、2 mM EDTA、0.5% NP-40、0.5 mM ジチオスレイトール、1:100 プロテアーゼ阻害剤カクテル [Thermo Fisher Scientific]、および 400 U/ml SUPERase-In RNase Inhibitor [Thermo Fisher Scientific])。

溶解物を氷上で５分間インキュベートし、１５分間遠心分離して溶解物を除去した。 細胞溶解物の 10 分の 1 の量を入力として保存しました。 残りの細胞溶解物を、プロテイン A 磁気ビーズ (カタログ番号 10001D; Invitrogen) と結合した 5 μg の抗 YTHDF2 (カタログ番号 RN123PW; MBL) とインキュベートしました。 4 度で 2 時間、穏やかに回転させます。 その後、ビーズを1 mlの氷冷洗浄緩衝液(50 mM HEPES、pH 7.6、200 mM NaCl、2 mM EDTA、0.05% NP-40、0.5 mM ジチオスレイトール、および200 U/ml RNase)で5回洗浄した。阻害剤）。

免疫沈降したサンプルを、1% SDS および 2 mg/ml プロテイナーゼ K (ThermoFisher Scientific) を追加した洗浄バッファー中でプロテイナーゼ K 消化に供し、1,200 rpm、55 度で振盪しながら 1 時間インキュベートしました。 5容量のTRIzol試薬を添加し、続いてDirect-zol RNA Miniprep (Zymo Research)を添加することにより、インプットRNAと免疫沈降したRNAの両方から全RNAを抽出した。

cDNAライブラリーはKAPA RNA HyperPrep Kit (Roche)を用いて生成され、Illumina HiSeq 2500プラットフォーム上で配列決定された。 免疫沈降およびインプットライブラリーによるピークコール結果は、R パッケージ RIPSeeker によって生成されました (Li et al., 2013)。 HOMERは、ピーク領域のデータ分布のモチーフを見つけるために使用されました。ChIPpeakAnnoを使用して、コールされたピークに遺伝子と転写構造との交差によって注釈が付けられました（Zhu et al.、2010）。

mRNA安定性アッセイ

Ythdf2ΔNKおよびYthdf2WTマウスから精製した脾臓NK細胞をIL-15(50ng/ml)とともに培養した。 培養３日後、細胞をアクチノマイシンＤ（５μｇ／ｍｌ、カタログ番号Ａ９４１５；Ｓｉｇｍａ）で指定の時間処理した。 処理なしの細胞を0時間で使用した。細胞を指定の時間に収集し、qPCRのために細胞から全RNAを抽出した。 mRNA の半減期は、Weng et al.(2018) によって以前に記載された方法を使用して計算されました。 プライマー配列を表 S1 に示します。

オンラインデータベース分析

オンライン リソース BioGPS (http://biogps.org) を使用して、Ythdf2 の組織特異的発現を分析しました。 RNA-seqdata セットは、GEO からアクセッション番号 2 で取得されました。 GSE106138、GSE113214、および GSE25672。 RNA-seq 解析からの正規化されたデータがエクスポートされ、gplots Rlibrary 内の Heatmap.2 機能を使用して遺伝子発現の Z スコアが視覚化されました。

統計

対応のないスチューデントの t 検定 (両側) は、GraphPad Prism ソフトウェアを使用して実行されました。 3つ以上の独立したグループを比較する場合、一元配置または二元配置ANOVAを実行しました。 P 値は、Holm-Sˇ´ıdak 手順を使用して多重比較用に調整されました。 P < 0.05 は有意であると考えられました。 *、P < {{10}}.05; **、P < 0.01; および ***、P < 0.001。

オンライン補足資料

図S1は、IL-15刺激、MCMV感染、腫瘍進行に応答したNK細胞を含む免疫細胞におけるYTHDF2のタンパク質レベルを示しています。 NK細胞特異的にYthdf2を欠失したマウスの作製。 図S2は、MCMVに感染したマウスの脾臓および肝臓におけるウイルス力価、ならびにMCMVに感染したマウスにおけるLy49H+および/またはLy49D+NK細胞のパーセンテージおよび絶対数を示す。 図S3は、Ythdf2WTおよびYthdf2ΔNKマウスからのNK細胞の増殖、生存、成熟、および活性化受容体および阻害受容体の発現を示しています。 図S4は、Ythdf2WTおよびYthdf2ΔNKのNK細胞におけるIL-15-STAT5シグナル伝達によるYTHDF2発現の制御と、IL-15受容体の成分、PI3K-AKT経路、およびMEK-ERK経路の発現を示しています。ネズミ。 図S5は、NK細胞におけるトランスクリプトームワイドのRNA-seq、m6A-seq、およびRIP-seqアッセイを示しています。 表 S1 に、研究で使用したプライマーを示します。

データの可用性

RNA-seq、m6A-seq、および RIP-seq データは、受託番号 2 で国立バイオテクノロジー情報センター GEO に寄託されました。 GSE174027。 この研究の結果を裏付ける残りのデータは、要求に応じて対応著者から入手できます。

謝辞

この研究は、国立衛生研究所(NS106170、AI129582、CA247550、CA163205、CA223400、CA068458、CA210087)、白血病・リンパ腫協会(1364-19)、カリフォルニア再生医療研究所(DISC2COVID{{ 9}}）、および Breast Cancer Alliance 2021 Exceptional ProjectAward を受賞しました。 この研究は USDAaward (USDA/NIFA 2020-67017-30843) によって部分的に支援されました。

著者の貢献: S. Ma、J. Yu、MA Caligiuri がプロジェクトを考案し、設計しました。 S. Ma、J. Yan、J. Zhang、J. Yu は実験やデータ分析を行いました。 Z. Chen、L.-S.Wang、JC Sun、および J. Chen が試薬と材料サポートに貢献しました。 S. Ma、J. Yu、J. Chen、および MA Caligiuri がこの論文を執筆、レビュー、および/または改訂しました。 著者全員が結果について議論し、原稿についてコメントしました。

開示: J. Chen は Genovel BiotechCorp から「その他」を報告しました。 提出された研究以外では、Genovel Biotech Corp. の科学的創設者であり、人種腫瘍学の科学顧問でもあります。その他の開示は報告されていません。

参考文献

1.Arase、H.、ES Mocarski、AE Campbell、AB Hill、LL Lanier。 2002.NK細胞受容体の活性化および抑制によるサイトメガロウイルスの直接認識。 科学。 296:1323–1326。

2.アヤラ、YM、T.ミステリ、FEバラレ。 2008. TDP-43 は、サイクリン依存性キナーゼ 6 発現の抑制を通じて網膜芽細胞腫タンパク質のリン酸化を制御します。 手順 国立 アカド。 科学。 アメリカ合衆国。 105:3785–3789。

3. Barbieri、I.、K. Tzelepis、L. Pandolfini、J. Shi、G. Millan-Zambrano、SC Robson、´D. Aspris、V. Migliori、AJ Bannister、N. Han、他 2017. プロモーター結合METTL3は、m6A依存性の翻訳制御により骨髄性白血病を維持する。 自然。 552:126–131。

4.Becknell、B.、および MA Caligiuri。 2005。インターロイキン-2、インターロイキン-15、およびヒトのナチュラルキラー細胞におけるそれらの役割。 上級 イムノール。 86:209–239。

5.ベルトーリ、C.、JMスコトハイム、RAデ・ブルーイン。 2013. G1 期および S 期における細胞周期転写の制御。 ナット。 モル牧師。 セルバイオル。 14:518–528。

6.ベズマン、NA、CCキム、JCサン、G.ミンウー、DWヘンドリックス、Y.カミムラ、JAベスト、AWゴールドラス、LLラニアー。 免疫ゲノムプロジェクトコンソーシアム。 2012. ナチュラルキラー細胞の正体と活性化の分子定義。 ナット。 イムノール。 13:1000–1009。

7.カーソン、WE、JG ギリ、MJ リンデマン、ML リネット、M. アーディー、R. パクストン、D. アンダーソン、J. アイゼンマン、K. グラブスタイン、および MA カリギウリ。 1994. インターロイキン (IL) 15 は、IL-2 受容体の成分を介してヒトのナチュラルキラー細胞を活性化する新規サイトカインです。 J.Exp. 医学。 180:1395–1403。

8.カーソン、WE、TA フェニガー、S. ハルダー、K. エッカート、MJ リンデマン、CF ライ、CM クローチェ、H. バウマン、MA カリギウリ。 1997. ヒトナチュラルキラー細胞生存の調節におけるインターロイキン-15の潜在的な役割。J. クリン。 投資する。 99:937–943。

9.チャン、CJ、MJスミス、L.マーティネット。 2014. 細胞ストレスに応答したナチュラルキラー細胞活性化の分子機構。 細胞死は異なります。 21:5–14。

10.Chen, X.、J. Han、J. Chu、L. Zhang、J. Zhang、C. Chen、L. Chen、Y. Wang、H. Wang、L. Yi、他。 2016. 乳がん脳転移に対するEGFR-CAR NK細胞と腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス1の併用療法。オンコターゲット。 7:27764–27777。

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