トレッドミル運動は、海馬と前頭前野の構造的シナプス可塑性の強化を通じて、3×Tg-AD マウスの空間学習と記憶の低下を防ぐパート 2
Jul 23, 2024
2.5.ウェスタンブロット
マウスをイソフルラン吸入により麻酔し、断頭した。海馬または前頭前皮質の組織を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Roche、インディアナ州インディアナポリス、米国）を添加した冷RIPA溶解バッファー（Thermo ScientificPierce、米国マサチューセッツ州ウォルサム）中で溶解しました。
溶解バッファーを使用すると、生物学研究室の研究者は実験条件をより適切に制御できるため、学術や医学研究で重要な役割を果たす細胞の増殖と変化をより適切に研究できます。
溶解バッファーは研究に役立つだけでなく、人間の記憶力の向上にもプラスの影響を与える可能性があります。最新の研究によると、溶解バッファーに豊富に含まれる化学成分は神経細胞の成長と発達を促進し、それによって脳の記憶力を高める可能性があります。
ある研究では、溶解バッファー中の特定の成分が特定の神経細胞間の信号伝達を促進し、それによって脳の学習能力と記憶能力を強化できることが判明しました。さらに、これらの成分は神経細胞の成長を刺激し、脳が新しい環境や新しい学習に適応するのを助けます。これらの効果の結果、人々は新しい知識をよりよく理解し、それをより長く記憶できるようになります。
もちろん、溶解バッファー自体がすべてのメモリ問題を魔法のように解決できるわけではありません。科学者は、これらの発見を人間の記憶力を高めるためにどのように活用するかについて、さらに研究を行う必要があります。しかし、この発見の積極的な重要性はすでに非常に明らかです。溶解バッファーは人間の記憶力を高めるための良いスタートとなり、将来の科学研究活動により多くの可能性をもたらします。私たちは記憶力を改善する必要があることが分かります。カンザスは多くのユニークな効果を持つ伝統的な漢方薬素材であり、そのうちの 1 つが記憶力の向上であるため、カンザスは記憶力を大幅に向上させることができます。シスタンケの効果は、タンニン酸、多糖類、フラボノイド配糖体など、含まれるさまざまな有効成分によってもたらされます。これらの成分は、さまざまな方法で脳の健康を促進します。
総タンパク質はBCAアッセイ(Thermo Scientific Pierce、米国)を使用して測定した。サンプルを 100 °C で 15 分間加熱しました。ウェスタンブロットでは、等量のタンパク質を12%ゲルにロードしました(20μg/ウェル)。電気泳動し、PVDF 膜 (Millipore、IPVH00010、Burlington、MA、USA) に転写した後、ブロッキング緩衝液 (5% BSA 緩衝液) とともに室温で 1 時間インキュベートしました。
PVDF 膜を一次抗体 (GAPDH、1:10、000、Abcam、ボストン、マサチューセッツ州、米国; PSD95、1:500、Abcam、米国; Syn、1:500、Abcam、米国) と一晩インキュベートしました。 。
次に、それらをTBST緩衝液で5分間隔で3回洗浄し、HRP結合ヤギ抗ウサギまたはHRP結合ヤギ抗マウス二次抗体(1:15、000、Proteintech Group、Rosemont)とともに1時間インキュベートした。 、イリノイ州、米国）、続いて 5 分間隔で TBST 洗浄を行います。
タンパク質レベルは化学発光試薬 (ThermoScientific Pierce、米国マサチューセッツ州ウォルサム) で検出し、バンドは Image J ソフトウェアを使用して測定しました。
2.6.電子顕微鏡検査
マウスを抱水クロラールで深く麻酔し、ＰＢＳで経心臓的に灌流した後、｛｝｝｝．１Ｍリン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒドおよび２．５％グルタルアルデヒド溶液で２０分間灌流した。
脳を取り出し、同じ固定液に一晩浸漬した。海馬と前頭前皮質を 1% 四酸化オスミウムで染色し、段階的な一連のアセトンで脱水しました。
組織を極薄切片に切断し、酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色し、Hitachi H-7100 電子顕微鏡で検査しました。これらの標本のランダムな位置の写真を倍率 30 倍、000 (22 μm2) で撮影しました。
丸い小胞、非対称シナプス、および単一の大きなシナプス接触を持つシナプスは興奮性シナプスであると推定され、一方、多形性の平坦な小胞と対称シナプスを有するシナプス前末端は抑制性シナプスであると推定された[48]。
各マウスの海馬と前頭前野にあると推定される興奮性シナプスの数（各画像フィールドあたり 22 μm2、図 2）を分析し、同じグループの 6 つの画像フィールド（4 匹のマウスからの 6 つの画像フィールド）のシナプスの数を平均しました。各グループにあります）。
ランダムに選択された 12 ～ 15 個のシナプスのシナプス活性領域の長さ、シナプス間隙の幅、シナプス界面の曲率、およびシナプス後密度の厚さを、1 グループあたり 4 匹のマウスから定量化して比較しました (図 3)。
活動領域の長さとシナプス後密度の厚さは、Güldner [49]に従って測定されました。シナプス間隙は、シナプス前膜とシナプス後膜の間の最も明るい領域として定義されました[50]。
シナプス曲率は次の式を使用して決定されました: R=a/2 + b2/8a、ここで b はシナプス後肥厚の両端を結ぶ線、a はシナプス後膜から b までの垂直距離です [51] 、52] (図 3A を参照)。
図 2. トレッドミル運動により、3×Tg-AD マウスの海馬と前頭前皮質のシナプス数が増加します。 (A) 非 Tg コントロール、非 Tg 運動、3×Tg-AD コントロール、および 3×Tg-AD 運動マウスにおける海馬および前頭前皮質の代表的な電子顕微鏡画像。
青い矢印はシナプスを示しています。赤いボックスは拡大されたシナプスを表します。前頭前皮質のシナプスの拡大高倍率図が、下部の赤い四角ボックスに示されています。 (B、C) 海馬 (B) および前頭前野 (C) のシナプス数は、非 Tg 対照群と比較して 3×Tg-AD 対照群で有意に減少しました (*** p < 0 .001,n=6 画像セクション）、この減少は海馬 (B) と前頭前野 (C) の両方でトレッドミル運動の前処理によってブロックされました (*** p < 0.001, n {{ 9}} 画像セクション）。
トレッドミル運動の前処理により、非 Tg マウスの海馬 (B) と前頭前野 (C) のシナプス数が増加しました (** p < 0.01、n=6 画像セクション)。各データセットは 4 匹のマウスから得られました。
図 3. トレッドミル運動により、3×Tg-AD マウスの海馬および前頭前皮質のシナプス構造パラメータが改善されました。 (A) シナプス構造パラメーターの代表的な測定値。
式 R=a/2 + b2/8a (b はシナプス後肥厚の両端を結ぶ線、a はシナプス後膜から b までの垂直距離) を使用してシナプス曲率を決定しました。
(B、C) 海馬 (B) および前頭前皮質 (C) のシナプス活動領域の長さは、非 Tg 対照群と比較して 3×Tg-AD 対照群で有意に減少しました (*** p < {{ 3}}.001, n=12–15 シナプス）、この減少は海馬と前頭前野の両方でトレッドミル運動の前処理によってブロックされました（*** p < { {18}}.001, n=12–15)。 (D、E) 海馬 (D) および前頭前野 (E) のシナプス間隙の幅は、非 Tg 対照群と比較して 3×Tg-AD 対照群で有意に増加しました (*** p < {{ 30}}。001, n=12–15 シナプス）、この増加は両方の海馬でトレッドミル運動の前処理によってブロックされました（D;**） * p < 0.001、n=12–15 シナプス）および前頭前野（E; ** p < 0.01、n=12–15）。 (F、G) 海馬のシナプス曲率 (F; *** p < 0.001、n=12-15) および前頭前皮質 (G; ** p < 0.01、n=12-15) ) は非 Tg 対照群と比較して 3×Tg-AD 対照群で有意に減少し、この減少は両方の海馬でトレッドミル運動の前処理によってブロックされました (F; ** p < 0.01、n=12- 15）および前頭前皮質（G; *** p < 0.001、n=12–15）。 (H、I) 海馬 (H) および前頭前皮質 (I) のシナプス後密度の厚さは、非 Tg 対照群と比較して 3×Tg-AD 対照群で有意に減少しました (*** p < 0.001、n {{ 50}}-15)、この減少は海馬 (H; ** p < 0.01,n=12-15) と前頭前野 (I; *** p < 0.001, n=12–15)。
各データセットは、各グループの 4 匹のマウスからの 12 個および 15 個のシナプスで構成されていました。
2.7.統計
データ分析では、マウスの遺伝子型と治療歴については考慮されていませんでした。データは平均値±SEMとして表されます。データセットは、二元配置分散分析とそれに続く Tukey の事後分析で比較されました。ポストホック分析は、ANOVA によって有意な主効果または 2 つの因子間の有意な相互作用が得られた場合にのみ実行されました。結果は、p < 0.05 で有意であると考えられました。
3. 結果
3.1.トレッドミル運動は3×Tg-ADマウスの空間学習と記憶の低下を防止した
我々はまず、生後6か月の3×Tg-ADマウスが空間学習および記憶障害を示しているかどうか、またトレッドミル運動の前処理が生後6か月の3×Tg-ADマウスの空間学習および記憶の低下を防止するかどうかを判定しようとした。
非Tg対照マウスおよび3×Tg-ADマウスは、生後3か月から始めて12週間のトレッドミル運動または非運動対照治療を受けた(2×2要因計画:遺伝子型対運動)。
12- 週間のトレーニングの後、8 アーム放射状迷路テストを使用して、マウスの空間学習と記憶を調査しました。作業記憶 (比較的短い期間記憶する能力) と参照記憶 (時間の経過とともに一定に保持される情報の記憶) の両方が測定されました (作業記憶と参照記憶の違いについては、セクション 2、図 1A で説明されています)。
二元配置分散分析により、遺伝子型とトレッドミル運動が 5 日目の作業記憶エラーの割合に有意な影響を及ぼしたことが示されました (遺伝子型: F1,39=8.6, p=0.006; トレッドミル運動: F1,{{ 8}}.5、p=0.024; 遺伝子型 × トレッドミル運動の相互作用: F1、39=4.2、p=0.047; 6 日目 (遺伝子型: F1) ,39=6.1, p=0.019; トレッドミル演習: F1,39=6.4, p=0.016; }}.6、p=0.039; 図 1B) の取得セッション。
Tukey の事後テストでは、作業記憶エラーの割合が、非 Tg 対照群と比較して 3×Tg-AD 対照群で有意に増加していることが示されました (5 日目と 6 日目の両方: p < 0.01;図 1B) ）。
作業記憶エラーの割合の増加は、トレッドミル運動の前処理によって防止されました (5 日目と 6 日目の両方: p < 0.01; 図 1B)。しかし、二元配置分散分析により、遺伝子型とトレッドミル運動は参照記憶エラーの割合に有意な影響を及ぼさないことがわかりました（例、10日目、遺伝子型: F1,39=0.2, p=0.6; トレッドミル）運動: F1,39=0.04, p=0.8; 遺伝子型 × トレッドミル運動の相互作用: F1,39=0.873,p=0.4; 図 1C)取得セッションの 10 日間すべて。
まとめると、これらの結果は、生後6か月の3×Tg-ADマウスは空間作業記憶の障害を示したが、参照記憶は示さなかったこと、そしてトレッドミル運動が3×Tg-ADマウスの空間作業記憶の低下を防ぐことを示唆している。
3.2.トレッドミル運動により、3×Tg-AD マウスの海馬および前頭前皮質のシナプス数が増加し、シナプス構造パラメーターが改善されました
トレッドミル運動による空間学習と記憶の減少が構造的なシナプス可塑性と関連しているかどうかを調べるために、学習と記憶に関連する情報の伝達に重要な海馬と前頭前野のシナプス数とシナプス構造パラメーターを定量化しました（図2A）。
二元配置分散分析により、遺伝子型とトレッドミル運動が海馬の両方のシナプス数に大きな影響を与えることが明らかになりました (遺伝子型: F1,23=59.3、p < 0。0{{9}) }1; トレッドミル運動: F1,23=51.{{20}}、p < 0.001; p=0.027、図 2B) および前頭前皮質 (遺伝子型: F1、23=48.6、p < 0.001、トレッドミル運動: F1、23=59.8、p < 0.001、遺伝子型 ×トレッドミル運動の相互作用: F1,23=8.5,p=0.009; 図 2C)。 Tukey の事後テストでは、海馬および前頭前皮質のシナプス数が、非 Tg 対照群と比較して 3×Tg-AD 対照群で有意に減少していることが示されました (p < 0.001; 図 2B、C)。
トレッドミル運動の前処理は、3×Tg-AD マウスの海馬と前頭前野の両方でシナプス数の減少をブロックしました (p < 0.001; 図 2B、C)。
一方、トレッドミル運動により、非 Tg マウスの海馬および前頭前皮質のシナプス数が増加しました (p < 0.01; 図 2B、C)。
シナプス伝達の効率をさらに評価するために、シナプス活性領域の長さ、シナプス間隙の幅、シナプス曲率、シナプス後密度の厚さなどの超微細構造パラメーターを電子顕微鏡（EM）で測定および分析しました。海馬と前頭前皮質 (図 3A)。
以前の研究では、シナプス活性ゾーンが大きいほどシナプス後ニューロンを興奮させるのに効果的であり、活性ゾーンの短縮はシナプス伝達効率の低下を反映している可能性があることが明らかになっている[36]。
二元配置分散分析により、遺伝子型とトレッドミル運動が海馬の両方のシナプス活動領域の長さに大きな影響を与えることが示されました (遺伝子型: F1,53=10.6, p=0.0{{ 20}}2; トレッドミル運動:F1,53=5.0, p=0.03; 遺伝子型 × トレッドミル運動の相互作用: F1,53=9.2, p { {14}}.004、図 3B) および前頭前皮質 (遺伝子型: F1、56=17.4、p < 0.001、トレッドミル運動: F1、56=5.0、p=0)。 03;遺伝子型 × トレッドミル運動の相互作用: F1、56=6.8、p=0.012; 図 3C)。
Tukey の事後テストでは、海馬と前頭前皮質のシナプス活動領域の長さが、非 Tg 対照群と比較して 3×Tg-AD 対照群で有意に減少していることが示されました (p < 0.001; 図 3B、 C)。
トレッドミル運動の前処理により、3×Tg-AD マウスの海馬 (p < 0.001、図 3B) と前頭前皮質 (p=0.001、図 3C) の両方でシナプス活性領域の長さが延長されました。シナプス間隙は、シナプス前ニューロンの軸索末端とシナプス後ニューロンの膜との間の約 20 nm の狭い空間です。
シナプス間隙の最適な短縮は、放出される神経伝達物質の有効濃度を高め、有効な間隙抵抗を低下させることによってシナプス強度を最適化する適応機能を有する可能性がある[37,38]。
二元配置分散分析により、遺伝子型とトレッドミル運動が両方の海馬のシナプス間隙の幅に有意な影響を与えることが示されました (遺伝子型:F1,55=21.5、p < 0.0{) {24}}1; トレッドミル運動: F1、55=15.1、p < 0.001; 遺伝子型 × トレッドミル運動の相互作用: F1、55=5.4、p=0.025;および前頭前皮質 (遺伝子型:F1,53=10.6, p=0.002; トレッドミル運動: F1,53=5.0, p=0.03; 遺伝子型 × トレッドミル演習インタラクション: F1、53=9.2、p=0.004; 図 3E)。
Tukey の事後テストでは、海馬と前頭前皮質のシナプス間隙の幅が、非 Tg 対照群と比較して 3×Tg-AD 対照群で有意に増加していることが示されました (p < 0.001;図 3D、 E)。
トレッドミル運動の前処理により、3×Tg-AD マウスの海馬 (p < 0.001; 図 3D) と前頭前皮質 (p=0.001; 図 3E) の両方でシナプス間隙の幅が減少しました。
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