好中球対リンパ球の比率が上昇している血管手術患者は、好中球補体RNA発現が下方制御されている

待機的血管手術 (EVS) を受ける患者の好中球対リンパ球比 (NLR) が上昇すると、周術期の手術結果とは関係なく死亡率が増加します。 NLR が高いと死亡率が高い理由を理解するために、EVS を受けている患者における好中球とリンパ球のトランスクリプトーム発現を調査しました。 NLR 計算のために、EVS を受けている患者および健康なドナーから血液サンプルを収集しました。 RNA サンプルは患者の好中球とリンパ球から分離され、NLR_Low (<3) and NLR_High (≥3) groups (n = 6 each). Paired samples with the highest RNA integrity number (mean = 9.8 ± 0.4) were sequenced and analyzed for differential expression. Normalized data were inputted for downstream analysis using iPathwayGuide (AdvaitaBio) and gene set enrichment analysis using GenePattern and MSigDB (Broad Institute). There was no clinical difference between the patient groups about clinical diagnosis, age, sex, history of hypertension, lipid abnormalities, diabetes mellitus, smoking, or statin use. The mean NLR was 4.37 ± 0.27 SEM in the NLR_High and 1.88 ± 0.16 for the NLR_Low groups. Significantly differentially expressed gene sets identified in the RNA sequence data were enriched highly (P = 1E-24) in the humoral immunity and complement systems. Neutrophils from NLR_High patients downregulated complement genes (C1QA, C1QB, C1QC, C1S, C2, CR2, C3AR1, C3, C8G, and C9 and complement regulatory genes CD59, SERPING1, C4BPA, CFH, and CFI). Downregulation of gene expressions of humoral immunity and complement within the neutrophils are associated with elevated NLR. It remains to be determined whether and how these changes contribute to increased late mortality previously observed in patients undergoing EVS.

男性の免疫システムを強化するシスタンシュの利点

導入

心血管疾患（CVD）は世界中で主な死因となっています。 これは主に、個人の遺伝学や食生活に加えて、炎症や免疫機構によって媒介されるアテローム形成とアテローム性動脈硬化が原因です。1-3 最近、白血球数（好中球とリンパ球）の差が注目されています。心血管（CV）の転帰を予測します。 好中球対リンパ球の絶対数（NLR）の比は、急性冠動脈インターベンション、高血圧、7、8、心不全に関する複数の小規模研究において総死亡率の予測因子として認識されています。9

表 1. RNA-seq によって検査された待機的血管手術患者の臨床的特徴

これまでの研究では、NLR が末梢血管疾患患者の長期転帰の予測因子であることも示されています。10-13 血管手術の患者集団に関する我々の遡及研究は、この結論を裏付けています。 待機的血管内腹部大動脈瘤修復術を受けた患者 108 名を対象としたある研究では、NLR と NLR の間で術後死亡率に差はありませんでした。{4}}<4 and an NLR of >4 (P = .507). However, the 1-year, 3-year, and 5-year mortality between the groups were 4.2% vs 28.1%, 15.1% vs 64.9%, and 24% vs 90%, respectively.14 In a second study of 290 asymptomatic patients undergoing prophylactic carotid endarterectomy, the risk for stroke was noted to be significantly higher (P < .0001) in patients with an NLR of >NLRが次の患者よりも3（患者n=116人、脳卒中リスク42.6%）<3 (n = 174 patients, 9.3% stroke risk).15 In a third study with 488 patients who underwent percutaneous interventions of femoropopliteal arteries, the 30-day mortality rates increased significantly (P = .005) with increasing NLR (1.4%, 4.3%, and 7.0% for low [<3], mid [3-4], and high [>16 術前 NLR が低い患者は、4- 年の追跡調査で有意に長い無切断生存率を達成しました（低 NLR 65.5%、中 NLR 37.5%、高 NLR 17.6 % [P < .0001]).16

この研究では、NLR 上昇の潜在的なメカニズムを決定するために、待機的血管手術 (EVS) 修復の資格のある患者から採取した好中球とリンパ球の RNA シーケンス (RNA-seq) を実行しました。 研究では、NLR の上昇に分子的根拠があるかどうかが調べられました。 我々の調査により、EVS修復を行ったNLRが上昇した患者は、好中球の免疫グロブリンおよび補体遺伝子の非常に有意な下方制御によって区別されることが明らかになった。

カンクサの利点 - 免疫システムの強化

メソッド

患者

Blood samples were collected from candidate patients for EVS procedures and healthy volunteers for NLR calculation and RNA sequence studies of neutrophils and lymphocytes. In screening patients for participation, any individual with an active local or systemic infection or obvious inflammatory disease was excluded from participation. Peripheral blood collection was approved by the institutional review board of University Hospitals Cleveland Medical Center (#01-06-02). Informed consent was obtained from each patient and healthy volunteer. All patients for EVS seen in the outpatient department were eligible. Patients in the study were characterized for the type of vascular surgery, age, sex, hypertension (blood pressure >130/80 mm Hg), diabetes mellitus (fasting blood glucose >100 mg/dL）、喫煙状況、スタチン治療、慢性閉塞性肺疾患、がん、慢性腎疾患、冠動脈疾患（CAD）、末梢動脈疾患、脳血管疾患、慢性心不全の病歴。 すべての患者は、白血球数の差を含む完全な血球計算を行っていました。 患者は低 NLR (NLR_低 [<3]) and high NLR (NLR_High [≥3]) groups (n = 6 each) and healthy volunteers aged 18 to 71 years (n = 6). Eleven of 12 patients' blood was drawn before surgery. One patient had blood drawn 4 months after surgery. 

血液分離

全血 (患者あたり 20 mL) を EDTA で抗凝固処理した 10 mL バキュテナー チューブに採取し、採取後 1 時間以内に血液を分離しました。 メーカーのプロトコールに従って、EasySep 直接ヒト細胞分離キット (STEMCELL Technologies、カナダ、バンクーバー) および Big Easy EasySep 磁石 (STEMCELL Technologies、カナダ、バンクーバー) を使用して、好中球およびリンパ球の細胞集団をそれぞれ 8 mL の血液から分離しました。 磁石は事前に氷上で冷却され、血球と試薬はピペッティングではなくチューブを反転させることによって穏やかに混合されました。 試薬比も、回収を最適化するために次の方法で調整しました。最初の分離の前に、400 mL の抗体混合物、400 mL の磁気ビーズ、および 4 mL のリン酸緩衝生理食塩水を血液に添加し、続いて 200 mL の抗体を添加しました。 2 回目の分離の前に混合物と 400 mL のビーズを加え、3 回目の最後の分離の前に 200 mL のビーズを加えます。 細胞計数とスライドの準備のために、最終回収量から 200 mL の少量を採取しました。 回収量の残りを毎分1000回転で7分間遠心分離し、細胞をペレット化した。

図1. NLR、高NLR（NLR_High）、低NLR（NLR_Low）、または対照（NLR_Control）の患者から採取した好中球およびリンパ球のRNAの全トランスクリプトーム。 サンプル名の「N」または「L」文字コードは、好中球またはリンパ球のいずれかが RNA の供給源であることを意味します。 各カテゴリーには 6 人の患者が含まれていました。 青=発現レベルが低下しました。 赤=の高レベルの表現。

細胞計数とスライドの準備

リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した細胞をさらに等分し、トリパンブルーと混合し、血球計を使用して手動で計数しました。 通常、サンプルごとに 9 × 106 ～ 15 × 106 個の好中球と 3 × 106 ～ 10 × 106 個のリンパ球が単離されました。 細胞遠心分離機を使用して単離された細胞のスライドを調製し、毎分600回転で3分間回転させた後、ライトギムザ染色で染色しました。 各細胞集団の純度は手動計数によって決定され、スライドあたり少なくとも 1000 個の細胞が識別されました。 細胞計数による好中球およびリンパ球の分離の平均純度は、それぞれ98.3%および96.2%でした。 好中球とリンパ球の 1 つのサンプル対に対してフローサイトメトリーを実行したところ、それぞれ 90.6% と 92.2% の純度が示されました。 好中球調製物中の他の細胞は、リンパ球 (4%)、単球 (2%)、好酸球 (2.3%)、および好塩基球 (0.3%) に分解されました。 リンパ球調製物では、他の細胞は好中球 (1.2%)、単球 (1.4%)、好酸球 (1.2%)、および好塩基球 (1.8%) でした。 すべての個々のサンプルからのバルク RNA-seq データを使用して、NLR_High サンプルまたは NLR_Low サンプルの好中球またはリンパ球が CD14 を大幅に増加させたかどうかを判定することにより、細胞調製物中の単球汚染の程度を判定しました。 、CD68、CD83、または CD163。 独立して、RNA-seq データは、バルク遺伝子発現データにおける免疫細胞とがん細胞の割合を推定するために設計されたプログラムである免疫細胞とがん細胞の割合の推定 (EPIC) に入力されました。17 使用された参照プロファイルは、EPIC によって提供されました。血液循環免疫細胞であり、B 細胞、CD4 および CD8 T 細胞、単球、好中球、ナチュラル キラー細胞のプロファイルが含まれています。 報告される出力は、サンプルごとの細胞画分として示されます。

図 2. 好中球とリンパ球から有意に差次的に発現される遺伝子。 (A) 好中球 (青) とリンパ球 (オレンジ) で有意に差次的に発現された遺伝子の数。 (B) NLR_高 (丸) および NLR_ 低 (四角) における好中球 (緑と紫) およびリンパ球 (赤と青) で有意に差次的に発現された遺伝子の主成分分析プロット。 (C) NLR_High 対 NLR_Low 好中球 RNA から有意に差次的に発現された遺伝子のヒート マップ。 (D) NLR_High 対 NLR_Low リンパ球 RNA からの有意に差次的に発現された遺伝子のヒート マップ。

RNA-seq と統計解析

RNA 抽出および配列決定の詳細な方法は、補足方法に記載されています。 シーケンスリードの品質を評価し、TrimGalore! を使用してアダプターをトリミングしました。 (Babraham Institute)、FastQC および CutAdapt のラッパー スクリプト。 品質管理に合格したリードは、STAR アライナー ソフトウェアを使用してヒト参照ゲノム GRCh38 とアライメントされました。 GRCh38 の GENCODE 遺伝子アノテーションを使用した差次的発現解析のために、アライメントされたリードは Cufflinks バージョン 2.2.1 を使用して処理され、遺伝子レベルの発現データは、マッピングされた 100 万リードあたりのキロベース転写物あたりのフラグメントで報告されました。発見率カットオフ P 値<.05, after the Benjamini-Hochberg correction for multiple testing. Normalized fold-change and P values for all expressed genes were then used as input for downstream analysis using iPathwayGuide (AdvaitaBio) and gene set enrichment analysis (GSEA) using GenePattern and MSigDB (Broad Institute). Additional figures including heat maps and scatterplots were generated in R and ClustVis.

結果

患者の特徴

RNA 完全性数 (RIN) によって評価されるペア内の RNA の最高品質に基づいて、7 つの NLR_High と 9 つの NLR_Low から 6 組の患者サンプルが選択されました (表 1) ）。 8人の健康なドナーからの6人の対照も検査された。 研究に含まれた患者では、NLR_Highの平均±標準偏差NLRは4.37±0.66であったのに対し、NLR_Lowの場合は1.87±0でした。 39 (P < .0001)。 患者の年齢の平均±標準偏差は、NLR_高の場合は61.0±17.0歳、NLR_低の場合は64.5±7.5歳でした（P= .68）。 1 人を除くすべての患者は大動脈瘤疾患を患っており、9 人は胸部/胸腹部、2 人は腹部でした。 腹部大動脈瘤患者は両方とも NLR_ 低群に属していました。 12人の患者のうち11人には高血圧の既往歴があった。 NLR_高グループまたは NLR_低グループの両方の患者 6 人中 4 人に脂質異常の病歴がありました。 NLR_高グループの患者 4 人、NLR_低グループの患者 3 人は元喫煙者でした。 NLR_低群の 1 人の患者は活動的な喫煙者でした。 NLR_高群の患者 5 名と NLR_低群の患者 4 名がスタチンを服用していました。 両方のグループで糖尿病患者はわずか 3 人でした。 各グループの患者 1 人には CAD の病歴があり、NLR{46}}Low グループの患者 2 人には末梢動脈疾患がありました。

図 3. この調査の RNA-seq データは、好中球およびリンパ球調製物中の他の細胞汚染を決定するための独立した手段として使用されました。 好中球からのデータのみが示されています。 EPIC 分析を実行して、バルク遺伝子発現データにおける免疫細胞と癌細胞の割合を推定しました。 この分析により、好中球調製物中の好中球、単球、B 細胞、CD4 T 細胞、CD8 T 細胞、ナチュラルキラー (NK) 細胞、およびその他の細胞の割合が得られました。

全トランスクリプトーム

好中球とリンパ球の遺伝子発現プロファイルを比較すると、トランスクリプトーム全体で全体的な差異が観察されました (図 1)。 細胞型特異的な遺伝子発現は以前に異なるものとして特徴付けられていたため、この発見は驚くべきことではありませんでした。19 好中球のセクションでは、NLR_高、NLR_低、および NLR{{ 4}}対照群では、リンパ球セクションでは明らかに上方制御されていない遺伝子が多数上方制御されており、またその逆も同様です。 全体のトランスクリプトーム レベルでは、NLR や患者か対照かに関係なく、好中球とリンパ球の間の細胞特異的な違いは明確であり、支配的でした。 しかし、詳しく調べてみると、違いが現れ始めました。 主成分分析プロットは、好中球またはリンパ球のいずれかの NLR_ コントロールが、両方の細胞で NLR_ 高および NLR_ 低と重複していることを示しました (補足図 1)。 次に調査では、NLR_高グループと NLR_ 低グループの間で、有意に差次的に発現する遺伝子のさらなる差異を見つけることを目指しました。 NLR_高群と NLR_低群の好中球では、900 (74.5%) の有意に差次的に発現された遺伝子が観察された (図 2A)。 比較すると、リンパ球にはわずか 190 (15.7%) の有意に差次的に発現された遺伝子がありました。 好中球およびリンパ球における NLR_High 遺伝子 vs NLR_Low 遺伝子の主成分分析プロットにより、NLR_High 対 NLR_Low 遺伝子のグループが、好中球は 2 つの異なる領域に分離されていましたが、NLR_High および NLR_Low リンパ球遺伝子は重複していました (図 2B)。 繰り返しになりますが、トランスクリプトーム データ全体と同様に、NLR_コントロールは、好中球とリンパ球の両方で有意に差次的に発現される遺伝子をNRL_高およびNLR_低とオーバーラップしました（補足図2）。 好中球のNLR_Highで有意に発現差があった遺伝子のほとんどは、NLR_Lowから下方制御されていました（図2C）。 同様ではあるがはるかに少ない数の遺伝子が、好中球よりもリンパ球の NLR_High で下方制御されていました (図 2D)。 これらのデータは、NLR レベルが好中球における遺伝子発現の変化と主に関連していることを示唆しました。 さらに、前者のグループは NLR_高ではあるが NLR_対照ではなく、NLR 対照ではなく、その疾患グループ NLR_低の患者と比較する必要がありました (図 2B; 補足図 2)。

カンクサ-免疫システムを改善する

遺伝子の差次的発現および遺伝子セットの濃縮を調査する前に、追加の研究で好中球調製物中の単球汚染の程度を特徴付けました。 RNA-seq データを使用して、NLR_High と NLR_Low の好中球またはリンパ球調製物における単球マーカー CD14、CD68、CD83、CD163 の発現に有意な差がないことが観察されました。 好中球 RNA-seq データの EPIC 分析により、非免疫細胞 (「その他の細胞」) と CD4 T 細胞が好中球調製物の主要な汚染物質であることが示されました (図 3)。 NLR{{10}}低 CD4 T 細胞と B 細胞を除き、他の汚染細胞はいずれも NLR で有意な差はありませんでした_低好中球と NLR_高好中球。 好中球調製物では、EPIC 分析による単球の混入は、NLR ではわずか {{1​​6}}.17% ± 0.05% でした。_Low に対して、NLR では 0.1% ± 0.033% でした。 NLR_高度な準備 (P=.12)。 この値は、RNA-seq データ分析とフローサイトメトリーで測定した場合、単球の混入が 1 桁低いことを示しています。

図 4. NLR_High と NLR_Low の間の生物学的プロセスに関する有意に発現された GO 遺伝子セットのカテゴリーの散布バブルプロット。 横軸の k:K の比は、カテゴリー内の遺伝子の総数 (K) と比較して、有意に差次的に発現している遺伝子の数 (k) です。 縦軸は、対数（P 値）として表される濃縮の有意性です。 (A) NLR_High と NLR_Low を比較した好中球 RNA 配列に由来する GO 遺伝子セット。 (B) リンパ球 RNA 配列に由来する GO 遺伝子セット。 両方のプロットの左下隅にある遺伝子セットは最も重要性が低いです。 両方のプロットの右上隅にある遺伝子セットが最も重要です。

図 4 (続き)

差次的に発現される遺伝子の性質を調べるために、NLR{0}}High と NLR_Low の間で有意に差次的に発現される遺伝子セットを使用して、生物学的プロセスのジーン オントロジー (GO) カテゴリで GSEA を実行しました。 結果は散布バブルプロットに示されています (図 4)。 各プロットの右上への遺伝子セットの分離は、(1) 遺伝子セット内の遺伝子の高いパーセンテージが大きく変化していること、および (2) 遺伝子セットの濃縮に対する高度な重要性を示しています。 私たちのサンプルでは、​​散乱バブルプロットは、好中球とリンパ球の両方について、補体と体液性反応の GO カテゴリの両方が独立して濃縮されていることを示しました。 好中球では、補体活性化、タンパク質活性化カスケードの制御、および循環免疫グロブリンによって媒介される体液性免疫応答の古典的経路の遺伝子セットが最も重要であり、遺伝子セットメンバーの最も高い割合が有意に変化しました（図4A）。 独立して、リンパ球内の同一の遺伝子セットも、好中球の研究と同様に、有意に変化した遺伝子の割合が高く、有意性の程度が高いことが観察されました (図 4B)。

表 2. 好中球とリンパ球の免疫遺伝子セット

表 2 に、好中球 (表 2、パネル A) およびリンパ球 (表 2、パネル B) で最も大きく変化した免疫遺伝子セットを示します。 この研究では、NLR_高サンプルと NLR_低サンプルの間で好中球またはリンパ球の遺伝子発現を比較しました。 健康な NLR_対照サンプルは、トランスクリプトーム全体と有意に差次的に発現する遺伝子セットの両方において、発現レベルが NLR_高および NLR_低の患者サンプルと重複していたため、比較されませんでした。 さらに、健康な NLR_ 対照サンプルは、年齢、疾患、手術状態が一致しませんでした (補足図 1 および 2)。 好中球 (表 2) とリンパ球 (表 2) の両方において、データは、NLR_ 高と NLR_ 低を比較した場合、免疫系に関連する遺伝子セットの発現が非常に有意に異なることを示しました。 。 RNA 配列では、各細胞タイプで他の細胞タイプと同じ結果が得られます。 どちらのパネルでも、主要な遺伝子セットの有意水準は P < 1E-24 で最大になりました。 これらのデータは、好中球とリンパ球のどちらが検査されたかに関係なく、非常に重要でした。 この RNA-seq 研究の非常に重要な内容領域に焦点を当てるために、有意に差次的に発現された免疫グロブリン遺伝子発現を調べました。 まず、好中球遺伝子の主成分分析プロットは、NLR_High と NLR_Low の場合、有意に差次的に発現された免疫グロブリン遺伝子が 2 つのグループに分離されていることを示しました (補足図 3A)。 あるいは、NLR_High と NLR_Low のリンパ球遺伝子は重複していました (補足図 3A)。 次に、好中球とリンパ球におけるNLR_HighとNLR_Lowの間の免疫関連遺伝子発現の複合ヒートマップを比較しました(図5)。 全体として、ヒートマップ全体を調べると、好中球 NLR_高グループでは、NLR_低グループと比較して、免疫グロブリン遺伝子の遺伝子ファミリー全体の明らかなダウンレギュレーションが見られます。 ほとんどの遺伝子 (69/156、44%) は免疫グロブリン関連でした。 補体関連遺伝子は 156 個中 12 個 (7.7%) のみでした: C1QA、C1QB、Serping1、C2、C2R、C4BPA、C3AR1、CR1、CR1L、CFH、CFD、CD59。 リンパ球グループでは、NLR_高カテゴリーの主に免疫グロブリン遺伝子の下方制御も見られました。

好中球とリンパ球の補体遺伝子セットの詳細を表 3 に示します。好中球 (表 3) とリンパ球 (表 3) の両方で、補体系に関連する 3 つの遺伝子セットの遺伝子発現は非常に有意に異なりました (P < 1E{{ 5}}）NLR_High サンプルが NLR_Low サンプルと比較された場合。 この観察は、好中球由来の RNA とリンパ球由来の RNA の間の比較であっても同じでした。 3 つの遺伝子セットには、補体活性化、補体活性化古典経路、および補体活性化の制御が含まれます。 好中球遺伝子の主成分分析プロットでは、NLR_High と NLR_Low の場合、有意に差次的に発現された補体遺伝子が 2 つのグループに分離されていることが再び示されました (補足図 3B)。 あるいは、NLR_High と NLR_Low のリンパ球遺伝子は重複しています (補足図 3B)。

図 5. 好中球 (左) とリンパ球 (右) で免疫グロブリン遺伝子セットにおいて有意に差次的に発現される遺伝子のヒート マップ。 各ヒート マップの右側にリストされている遺伝子は、免疫グロブリンのメンバーです。

NLR_HighとNLR_Lowを比較した補体関連遺伝子セットの好中球およびリンパ球発現のヒートマップを図6に示します。好中球では、膨大な数の遺伝子が下方制御されていました。 NLR_人口が多い。 この遺伝子セットでは、免疫グロブリン遺伝子セットと同様に、ほとんどの遺伝子 (69/86、80%) が免疫グロブリン関連でした。 86 のうち、補体成分および調節遺伝子 (C1QA、C1QB、SERPING1、C2、CR2、C4BPA、C3AR1、CR1、CR1L、CD59、CFH、および CFD) は 12 個 (14%) のみでした。 リンパ球グループ全体では補体遺伝子の発現が少なく、免疫グロブリン遺伝子はNLR_高グループでわずかに下方制御されていました。 補体系の遺伝子は免疫グロブリン系の遺伝子と比べてよく理解されているため、高NLRおよび低NLRに関連する標的遺伝子の潜在的候補として補体系に注目が集まった。 NLR_High と NLR_Low を比較する複合ヒート マップが作成され、好中球サンプルとリンパ球サンプルの両方における補体系および関連遺伝子の発現が示されました (図 7)。 ほとんどの場合、リンパ球は補体系の貯蔵細胞系ではありません。 ほとんどの補体遺伝子はリンパ球では上方制御されません。 C1S、CR2、C5、C8G、C5、CFB のみが存在し、NLR_High リンパ球と NLR_Low リンパ球の間で発現の違いが見られました (図 7)。 リンパ球の CD81 は B 細胞テトラスパニンです。 C1S と C8G の発現は、血漿プレカリクレインの遺伝子である KLKB1 と同様に、リンパ球 NLR の方が有意に高いようです_リンパ球 NLR の発現よりも高い_低い。

対照的に、好中球では、NLR_High は補体成分遺伝子 C1QA、C1QB、C1QC、SERPING1、C1R、C4BPA、C3、C3AR1 とその補体調節 (阻害) 遺伝子 CD59、CFB、CFI の下方制御を示しました。 。 NLR_高_N患者ではC2遺伝子とCFD遺伝子のみが上方制御されていました。 CD59 と C9 は、NLR_High_N と比較して、好中球 NLR_Low_N では比較的上方制御されています。 FGFR4 は成長因子受容体です。 CFH は存在しましたが、好中球 NLR_ 高または NLR_ 低の影響を受けていないようでした。 リンパ球ではより高度に発現されます。

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議論

白血球分画数の NLR は、CVD、固形腫瘍、全身性エリテマトーデスや全身性硬化症などの炎症性疾患など、幅広い疾患における潜在的な有害な転帰を認識するために広く使用されているシンプルなマーカーとなっています。 アテローム性動脈硬化性CVD患者に関する我々自身の遡及的研究では、NLRが高い患者は待機的大動脈瘤修復後の晩期死亡率が高く、予防的頸動脈内膜切除術後の晩期脳卒中/死亡率が高く、術後の無切断生存率が低いことを観察した。 NLR が上昇している場合は、選択的大腿膝窩血行再建術。14-16 今回の研究は、NLR が高くなるメカニズムの根拠を見つけるために開始されました。 リンパ腫、多発性固形腫瘍、全身性エリテマトーデスや全身性硬化症などの炎症性疾患などです。 アテローム性動脈硬化性CVD患者に関する我々自身の遡及的研究では、NLRが高い患者は待機的大動脈瘤修復後の晩期死亡率が高く、予防的頸動脈内膜切除術後の晩期脳卒中/死亡率が高く、術後の無切断生存率が低いことを観察した。 NLR が上昇している場合は、選択的大腿膝窩血行再建術が行われます。14-16 今回の研究は、NLR が高くなるメカニズムの根拠を見つけるために開始されました。

表 3. 好中球とリンパ球の補体遺伝子セット

CV 結果に対する NLR の異なる影響のメカニズムに関する公平なアプローチを開発するために、同じ患者の好中球とリンパ球の両方に対して RNA-seq を実行しました。 この研究では、大動脈疾患を有するすべての患者が前向きに収集され、その結果に基づいて NLR カテゴリに分類されました。 2 つの細胞タイプのそれぞれの最後の 6 つのサンプルは、性別、年齢、以前の病状に関係なく、好中球とリンパ球のペアのサンプルの調製された RNA の RIN の最高レベルによって選択されました。 表 1 からわかるように、NLR_高グループと NLR_ 低グループの患者は非常に似ており、NLR によってのみ区別されます。

この研究で使用された RNA の品質は、RIN と、収集されたすべての患者グループ (高 NLR、低 NLR、および対照) における好中球とリンパ球間の遺伝子発現パターンの完全な分離によって示されます (図 1)。 主成分分析プロットは、患者の NLR が患者の好中球およびリンパ球集団の NLR_高および NLR_ 低と重複しているため、NLR_対照データはこの調査には無関係であることを示しています。 GSEA 分析は、どの遺伝子セットが生物学的プロセスの GO 遺伝子セットに豊富に含まれているかについて優れた洞察を提供しました。散布バブルプロットは、対数有意性と遺伝子の総数に対する変化した遺伝子の数の比率をプロットすることにより、これを明確に示しました。遺伝子セットの中で。 レビューしたところ、公平な発見アプローチにおける比率と統計的有意性に基づいて、リスト全体から分離された遺伝子セットは、体液性（免疫グロブリン）免疫および補体系の遺伝子セットでした（表2および表3）。

関与する体液性免疫免疫グロブリン遺伝子は多数あり、これらの遺伝子間の重要な違いがよく知られていないため、これらの遺伝子を扱うのは困難です。 あるいは、補体系についてはさらに多くのことが知られており、免疫グロブリンによって活性化される古典的な補体系に焦点が当てられており、免疫グロブリンに関連する炎症および疾患の認識可能な標的となっている。 我々のデータは、古典的補体成分遺伝子 C1QA、C1QB、C1R、CR1、C1S、SERPING1、C2、C4BPA、C3 C3AR1、C8G、C9、およびいくつかの調節遺伝子 (CD59、CFB CFI、CFH) が患者の好中球でダウンレギュレートされていることを示唆しています。 NLR が高くなります (図 7)。 これらの発見は 3 つの理由から驚くべきものです。 まず、関与する遺伝子は主に古典的補体経路の遺伝子です。 第二に、高NLR患者では、これらの補体遺伝子の大部分が、低NLR患者の補体遺伝子と比較して下方制御されている。 最後に、NLR_High の好中球では、NLR_Low のサンプルよりも多くの F12 が発現しています。 F12 のタンパク質産物（第 XII 因子 [FXII]）の酵素的形態は、補体と好中球の古典的経路を活性化します。20 対照的に、プラスミノーゲンおよび FXII の活性化因子の遺伝子である PLG は、NLR 内の患者のリンパ球と好中球で下方制御されています。{ {21}}高い。FXII 活性化自体が補体活性化の調節因子である可能性を示唆しています。

さらに、古典的な補体系がCVDの促進に関与していることが示されています。 補体成分 1q (C1q) は補体経路の最初の因子であり、自然免疫系と獲得免疫系の両方で重要な役割を果たしています 21。 C1q は、アテローム性動脈硬化症に対してプラスとマイナスの二重の役割を果たしていることが示されています 22。補体経路である C1q は、補体非依存性経路を介してマクロファージ分子シグナルを調節し、アテローム生成性リポタンパク質の取り込みを調節し、アポトーシス細胞を媒介し、細胞残骸を除去することにより、初期段階のアテローム性動脈硬化症を保護する役割を果たします。23、24 Jia による最近の研究ら 23 は、血清 C1q の低下が CAD と関連していることを示しています。 Guo らによる別の研究 24 では、C1q 活性の増加が CAD と関連していることが示されています。 最後に、最近の研究では、C1q が低下した糖尿病患者は生存期間が短いことが示されています 25。これらのデータは、補体系の検査が炎症を介した CVD の病因を理解する上で重要である可能性があることを示しています。

図 6. 好中球 (左) とリンパ球 (右) の補体遺伝子セット内で有意に差次的に発現される遺伝子のヒート マップ。 各ヒート マップの右側にリストされている遺伝子は、補体遺伝子セットのメンバーです。 RNA は、NLR が高い (NLR_High) または低い (NLR_ Low) 患者から採取された好中球またはリンパ球に由来します。 NLR_High からの 6 つの個別サンプルを、好中球とリンパ球の両方からの NLR_Low からの 6 つの個別サンプルと比較します。

図 7. 好中球またはリンパ球の補体および関連遺伝子の複合ヒートマップ NLR_High または NLR_Low。 各カテゴリーにおいて、各細胞タイプからの 6 つの個別の RNA-seq サンプルから複合ヒート マップが作成されました。

Recently, a retrospective investigation of the data from the CANTOS, JUPITER, SPIRE-1, SPIRE-2, and CIRT trials on 60 087 patients was conducted to determine whether NLR predicts major adverse CV events and is modified by anti-inflammatory therapy.26 NLR modestly correlated (ie, r 2 ≤ 0.26) with interleukin 6, C-reactive protein, and fibrinogen levels but minimally with lipids.25 In all 5 trials, NLR predicted incident CV events and death in patients with NLR >3.08.26 脂質低下は NLR に影響を及ぼさなかったが、インターロイキン 1 阻害剤であるカナキヌマブによる抗炎症療法は NLR を低下させた (P < .0001)。26 これらのデータは、NLR が脂質や血液疾患とは独立した CVD のマーカーである可能性を示唆しています。スタチンの影響。 複数の前向きランダム化試験のこの特別な分析は、NLR が CVD における死亡の独立した危険因子である可能性を示唆しています。

この研究にはいくつかの制限があります。 フローサイトメトリーによると、好中球調製物にはリンパ球が 4%、単球が 2% 混入していました。 好中球が免疫グロブリンを合成することは知られていないため、好中球免疫グロブリン遺伝子の変化はB細胞の混入によるものである可能性があります。 EPIC 分析では、NLR-Low サンプルの B 細胞汚染が大幅に増加しました。 この観察は、NLR_低好中球サンプルにおける免疫グロブリン遺伝子レベルの増加が B 細胞の汚染によって生じている可能性があることを示唆しています。 したがって、NLR_High サンプルにおける免疫グロブリン遺伝子の減少は、NLR_Low サンプルにおける B 細胞の増加によるものである可能性があり、NLR_High サンプルにおける免疫グロブリン遺伝子レベルの低下は必ずしもそうではありません。 同様に、好中球が補体産生細胞であることは知られていません。 単球の 2% の混入が補体遺伝子の供給源である可能性があります。 しかし、RNA 配列データを使用すると、NLR_Low と NLR_High の間で好中球調製物の単球汚染に有意な差がないことが観察されました。 さらに、RNA-seq データの EPIC 解析を実行すると、単球の汚染が判明しました。<0.1% (<1:1000) of the neutrophil preparations, indicating that the RNA-seq was unlikely influenced by contaminating monocytes (Figure 3). The contaminating B cells in the NLR_Low samples do not influence the complement data observed. Finally, even now, it is not known that the changes we observed in complement and immunoglobulin genes are specific to vascular surgery patients with high NLR or older patients in general. NLR and genetic studies need to be performed on healthy age- and sex-matched patients without CVD.

男性の免疫システムを強化するシスタンシュの利点

要約すると、この研究での重要な発見は、NLR が高い状態では、多くの補体成分遺伝子とその制御因子の一部が好中球で下方制御されているということです。 同定された下方制御された補体遺伝子の全体的な意味および活性化状態については不明である。 補体遺伝子セットが著しく減少しているため、NLR_が高く、術後生存期間が短い個体は、補体系によって提供される主要な CV 保護機構が失われていると推測されます。 この評価は、この結果の根本的なメカニズムについて臨床研究で前向きに検討する必要があります。

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