ショウガの熱帯生姜セスキテルペンであるゼルンボーンは、B16F10細胞におけるMSH誘発メラニン形成を軽減する パート1
Apr 25, 2023
概要：ショウガ科の有効成分であるゼルンボーン (ZER) は、抗炎症、抗アレルギー、抗菌、抗がんなどのいくつかの生物学的活性を示すことが示されています。 ただし、抗メラニン生成特性については研究されていません。 本研究では、ZER とショウガは、メラノサイト刺激ホルモン (-MSH) で刺激されたマウスメラニン生成 B16F10 細胞におけるメラニン蓄積を有意に軽減する公式 (ZO) 抽出物であることを実証します。 さらに、ZERがメラニンの蓄積を抑制する分子機構を解明するために、メラニン形成関連転写因子である小眼球症関連転写因子（MITF）とその標的遺伝子であるチロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質1（ -MSH によって刺激される B16F10 細胞内の TYRP1)、およびチロシナーゼ関連タンパク質 2 (TYRP2)。 今回、我々は、ZERが-MSH刺激時にMITFを介したメラニン生成遺伝子の発現を阻害することを発見した。 さらに、異なる濃度のゼルンボーンとZOで処理した細胞は、MITFの分解機構に関与する細胞外シグナル調節キナーゼ1および2（ERK1/2）のリン酸化の増加を示した。 U0126を用いたERK1/2の薬理学的阻害は、ZERの抗メラニン形成効果を十分に逆転させ、その抗メラニン形成活性にはERK1/2のリン酸化の増加が必要であることを示唆している。 総合すると、これらの結果は、ZER 抽出物と ZO 抽出物が抗メラニン生成効果により、美白化粧品の有効成分として使用できることを示唆しています。
関連する研究によると、カンサスは「寿命を延ばす奇跡のハーブ」として知られる一般的なハーブです。 その主成分は、シスタノシドなど様々な効果があります。抗酸化物質,抗炎症薬、免疫機能の促進。 間のメカニズムカンクンと美白カンクサの抗酸化作用にあり配糖体。 人間の皮膚のメラニンは、次の物質によって触媒されるチロシンの酸化によって生成されます。チロシナーゼ、酸化反応には酸素の関与が必要なため、体内の酸素フリーラジカルはメラニン生成に影響を与える重要な要素になります。 シスタンケには抗酸化物質であるシスタノシドが含まれており、体内のフリーラジカルの生成を減らすことができます。メラニンの生成を抑制する.
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キーワード:ゼルンボーン。 ジンギバー公式ロスコー。 メラニン生成; MITF; ERK1/2
1. はじめに
表皮メラノサイトによるメラニンの生成であるメラニン形成は、紫外線 (UV) 放射線に曝露されるとケラチノサイトから分泌されるメラノサイト刺激ホルモン (-MSH) によって刺激されます [1、2]。 幹細胞因子 (SCF) は、出生後の皮膚メラニン生成を維持するためにメラノサイトの遊走、増殖、分化を厳密に制御するもう 1 つのメラニン生成因子です [3]。 メラニン形成性転写因子である小眼球症関連転写因子（MITF）は、メラノコルチン 1 受容体を介した -MSH 刺激により、cAMP-PKA-CREB（環状アデノシン一リン酸プロテインキナーゼ A-cAMP 応答エレメント結合タンパク質）シグナル伝達経路を通じて活性化されます。 (MC1R) 表皮メラノサイトの細胞膜に存在します [4]。 フォルスコリンやIBMX (3-イソブチル-1-メチルキサンチン)などのいくつかの化学物質は、cAMP-PKA-CREBシグナル伝達経路を活性化し、メラニン生成の誘導につながることが知られています[5]。 いくつかの研究により、発癌の分子機構に関与する細胞外調節キナーゼ 1 および 2 (ERK1/2) の持続的な活性化が、MITF の Ser73 リン酸化とその後のユビキチン依存性タンパク質分解による分解を促進することが明らかになりました [6,7] ]。 実際、選択的 ERK1/2 経路阻害剤である U0126 は、MITF 発現とチロシナーゼ活性を増加させ、メラニン生成を引き起こすことが報告されています [6]。 安定化および活性化された MITF は、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質 1 (TYRP1)、チロシナーゼ関連タンパク質 2 (TYRP2) などのメラニン生成遺伝子の発現を増加させます。 メラニン生成の最初のステップであるチロシンの 3,4- ジヒドロキシフェニルアラニン (L-DOPA) への変換は、チロシナーゼによって触媒されます。 チロシナーゼ関連タンパク質 (TRP) は、さらなる酸化および互変異性化反応を触媒します [8]。 メラニン合成後、成熟メラニンは表皮メラノサイトから基底ケラチノサイトの細胞質に輸送され、細胞を紫外線から保護します[2]。
メラニン生成の異常な増加は、皮膚がん、肝斑、そばかすなどの複数の種類の皮膚疾患を引き起こします[4]。 したがって、チロシナーゼの触媒活性、またはERK1/2やメラニン生成遺伝子のMITF媒介転写などのメラニン生成におけるシグナル伝達経路の調節因子のいずれかを標的とする小分子または天然産物が、化粧品で利用される有効成分として同定されている。業界。 コウジ酸、アルブチン、ナイアシンアミドなどのいくつかの小分子は、抗メラニン生成作用により化粧品成分として広く使用されています。 しかし、コウジ酸はその遺伝毒性活性により、細胞毒性、皮膚炎、皮膚がん、肝細胞がんなどの複数の副作用を引き起こすことが報告されています[9]。 クマコケモモ植物から単離されたアルブチンは色素沈着過剰症の治療に使用されてきましたが、最近ではいくつかの副作用のため化粧品成分としての使用が制限されています[9]。 ナイアシンアミドには抗メラニン生成活性があり、この活性はメラノサイトから周囲のケラチノサイトへのメラノソーム移動を阻害することによって行われることが報告されています[10]。 したがって、化粧品業界では美白化合物として一般的に使用されています。 いくつかの副作用を伴う既存の美白剤の限界を克服するには、天然源由来の安全な美白成分を開発することが重要です。 たとえば、-ツジャプリシン、リンデラノリド B、4- ブチル レゾルシノール、およびプルンバジンは、チロシナーゼ阻害効果により抗メラニン生成化合物として同定されています [4,11]。 ノビレチン、ウィザフェリン A、セサモール、およびチェトシンは、メラニン生成経路のシグナル伝達中間体を調節することによって抗メラニン生成特性を示します [11]。
ゼルンボーン（ZER）は、ショウガ科に属する植物（例えば、ショウガ科ゼルンベットスミスやショウガ科ロスコー）の揮発性エッセンシャルオイルから単離された天然物である[12]。 いくつかの研究では、ZER が抗菌、抗酸化、抗糖尿病、抗がん、抗炎症、抗アレルギー、抗血管新生などの幅広い生物学的活性を有することが示されています [12]。 興味深いことに、ZER は、核因子 E の活性化を介して活性酸素種 (ROS) を除去する能力により、皮膚ケラチノサイトにおける紫外線 A (UVA) 誘発酸化損傷に対して保護効果を発揮することが示されています{{8} }関連因子-2 (Nrf2) [1,13]。 このことは、ZER がスキンケア化粧品の機能性添加剤として使用できることを示唆しています。 ただし、ZER 作用の抗メラニン生成特性の詳細なメカニズムはまだ研究されていません。
本研究では、MSH 刺激によるメラニン生成に対する ZER およびショウガ (ZO) 抽出物の阻害効果とその根底にあるメカニズムを研究しました。 今回我々は、ZERがERK1/2のリン酸化を上方制御し、MITFを介したメラニン生成遺伝子の発現を阻害することにより、-MSH誘発性のメラニン生成を有意に抑制することを示す。
2. 結果
2.1. ゼルンボーン (ZER) は、B16F10 マウス黒色腫細胞における -MSH 誘発メラニン生成を抑制します
ゼルンボーン (ZER) の抗メラニン形成効果を研究するために、我々は最初に B16F10 細胞と HaCaT 細胞の両方におけるその細胞毒性を評価しました。 ZER の化学構造を図 1A に示します。 20 μM を超える濃度の ZER は強い細胞毒性効果を示しましたが、20 μM 未満の濃度では、ZER は両方の細胞株で細胞毒性を示さなかったことが観察されました (図 1B)。 次に、B16F10 細胞におけるメラノサイト刺激ホルモン (-MSH) 誘発メラニン蓄積および分泌に対する ZER の阻害効果を調べました。 ZER は、-MSH によって誘導されるメラニンの細胞内蓄積と培養培地へのその分泌を強力に抑制することが示されました (図 1C、D)。 さらに、ZER は、美白化粧品の有効成分としてよく知られている 1 mM アルブチンや 0.2 mM コウジ酸よりも効果的にメラニン生成を軽減することもわかりました (図 1D)。 ZER がヒト細胞のメラニン生成を抑制するのに十分であるかどうかを解明するために、メラニンを産生する G361 ヒト黒色腫細胞を使用しました。 図 1E に示すように、ZER は幹細胞因子 (SCF) によって誘導される細胞外および細胞内のメラニン含有量を大幅に減少させます。 これらの結果は、メラニン生成マウス B16F10 細胞およびヒト G361 細胞における ZER の抗メラニン生成活性を確認します。
2.2. ゼルンボーンは、G361 ヒト黒色腫細胞におけるメラニン形成転写因子、MITF およびその標的遺伝子の遺伝子発現を抑制します
エンドセリン-1とSCFシグナル伝達は、ヒトメラノサイトおよび黒色腫のいくつかのサブタイプにおけるメラニン形成において重要な役割を果たしていることが報告されています[3、14-16]。 この研究では、マウスB16F10およびヒトG361メラノーマ細胞において、ZERがメラニン生成刺激、-MSHおよびSCFによるメラニン生成を抑制することを発見しました（図1）。
したがって、我々は、G361 ヒト黒色腫細胞における SCF 刺激時のメラニン生成関連遺伝子およびタンパク質の発現レベルの変化を測定しました。 ZER は、SCF 刺激後 2 ～ 4 時間および 24 ～ 48 時間で、SCF 誘導性の MITF およびチロシナーゼタンパク質の発現をそれぞれ減衰させることがわかりました（図 2A）。 さらに、ZER 処理 G361 細胞では、MITF、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質 1 (TYRP1) などのメラニン生成関連遺伝子の遺伝子発現が抑制されました (図 2B、C)。 これらの結果は、SCF 刺激時のメラニン生成関連遺伝子の発現のピーク時間を明らかにしました。 最大の MITF mRNA 誘導は 1 ～ 2 時間以内に観察され、チロシナーゼと TYRP1 の mRNA レベルは SCF 刺激後 24 ～ 48 時間で最大に達することが観察されました。
2.3. ゼルンボーンはマウスB16F10細胞のメラニン生成遺伝子と酵素発現を抑制する
ZER がメラニン生成を抑制する分子機構を調べるために、メラニン生成転写因子 MITF とその標的遺伝子 (チロシナーゼ関連タンパク質 1 (TYRP1)、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質 2 (TYRP2) など) の遺伝子発現を測定しました。 ZERの有無にかかわらず。 SCF および -MSH 刺激時のメラニン生成関連遺伝子発現のピーク時間は、ヒト G361 (図 2) およびマウス B16F10 黒色腫細胞 [4] でそれぞれ知られているため、MITF、チロシナーゼ、TYRP1、および TYRP2 の発現をさらに測定しました。 -MSH との 2 時間または 48 時間のインキュベーション後の ZER 処理マウス B16F10 黒色腫細胞における結果。 図３Ａは、ＺＥＲが、Ｂ１６Ｆ１０細胞における−ＭＳＨ誘導性のＭＩＴＦ、ＴＹＲＰ１、ＴＹＲＰ２、およびチロシナーゼ発現を減弱させるのに十分であることを示す。 同様に、MITF、チロシナーゼ、TYRP2 タンパク質の発現レベルは ZER 処理により減少しました。 プロテインキナーゼ A (PKA) を介した CREB のリン酸化は、-MSH 刺激により転写レベルで MITF を増加させる主要なシグナル伝達経路です [4]。 したがって、ここでは、ZERによるCREBのリン酸化の減少がMITFの抑制を媒介できるかどうかを分析しました。 我々は、-MSH誘導性のCREBリン酸化がZER処理の影響を受けないことを発見し、ZERがPKA-CREBシグナル伝達経路軸とは独立して-MSH誘導性のMITF発現を抑制することを示唆しました（図3B）。 チロシナーゼはメラニン合成を調節する律速酵素であるため[2,4,11]、アルブチン、コウジ酸、ZER処理時の細胞内チロシナーゼタンパク質レベルとその酵素活性をさらに分析しました。 図 3C は、ZER が B16F10 細胞における -MSH 誘発チロシナーゼタンパク質レベルを十分に低下させることを示しています。 さらに、図 3D は、10 μM ZER がチロシナーゼ阻害剤、アルブチン、コウジ酸よりも効果的に L-DOPA 酸化を抑制することを示しており、ZER 処理細胞ではチロシナーゼの酵素活性による L-DOPA のドーパキノンへの酸化が抑制されていることを示唆しています。 。 これらの結果は、ZER がメラニン生成関連転写因子である MITF およびその標的遺伝子の遺伝子発現を抑制することにより、-MSH 媒介メラニン生成を減弱させることを示しています。
2.4. ゼルンボーンの抗メラニン形成効果はERK1/2のリン酸化による
成長因子またはメラニン生成刺激によるプロテインキナーゼ B (AKT) および細胞外シグナル制御キナーゼ (ERK1/2) の活性化は、MITF およびその標的遺伝子の発現低下を通じてメラニン生成を抑制することが知られています [11]。 ERK1/2 シグナル伝達経路に応答した MITF の Ser73 および Ser409 のリン酸化は、そのプロテアソーム依存性の分解を促進します [17、18]。 したがって、我々は、ZER が B16F10 マウスおよび G361 ヒト黒色腫細胞における ERK1/2 リン酸化を調節するかどうかを調査しました。 ZER 治療により、時間および用量依存的に ERK1/2 (p-ERK1/2) のリン酸化の増加が観察されましたが、総 ERK1/2 (T-ERK1/2) のリン酸化は観察されませんでした (図 4A、B)。 興味深いことに、マウス B16F10 およびヒト G361 黒色腫細胞では、ERK1/2 のリン酸化が ZER 処理後 10 ～ 30 分および 1 ～ 2 時間以内に急速に増加することが観察されました (図 4A)。 しかし、AKT および MEK のリン酸化は ZER 処理では観察されず、ZER 誘導性の ERK1/2 リン酸化が MITF を抑制する可能性があることが示唆されました (図 4B)。 ERK1/2 リン酸化は MITF のリン酸化とプロテアソーム分解を促進するため [17,18]、プロテアソーム阻害剤が ZER による MITF の減少を防ぐかどうかを調査しました。 MG132の存在下ではZERによるMITFの抑制は観察されず、ZERがプロテアソーム分解を通じてMITF発現を減少させることが確認された(図4C)。 次に、ZER が ERK1/2 の標的残基である Ser73 で MITF をリン酸化するかどうかを調べました。 リン酸化 MITF を検出するために、細胞を -MSH および MG132 に曝露しました。 ここで、リン酸化 MITF (Ser73) が、-MSH および MG132 の存在下で ZER によって大幅に増加することを発見しました (図 4D)。 選択的マイトジェン活性化プロテインキナーゼ (MAPK) 阻害剤である U0126 [19] は、ZER 誘導性の MITF リン酸化を無効にしました (図 4D)。 さらに、全細胞溶解物（WCL）中の総MITFタンパク質レベルは、MG132の存在下でZERおよびU0126によって変化しませんでした（図4D）。 これらの結果は、ERK1/2-媒介MITF (Ser73)リン酸化とプロテアソーム分解が、ZER媒介MITF抑制における重要な機構であることを示している。 さらに、図 4E は、U0126 が ZER 処理細胞の減少した MITF タンパク質レベルを有意に回復したことを示しています。 一貫して、ZER によって減少した細胞内メラニン含有量は、U0126 によって約 40 パーセントに回復しました (図 4F)。これは、ZER の抗メラニン形成効果には ERK1/2 の活性化が必要であることを示唆しています。
2.5. ショウガ（ZO）抽出物の抗メラニン形成効果
ZER は、ショウガ科のいくつかの植物種 (ショウガ ゼルンベットやショウガなど) に由来する植物化学物質です [12]。 したがって、我々は最初に、B16F10 細胞および HaCaT 細胞における ZO 抽出物の非存在下または存在下での細胞生存率を測定しました。 図 5A は、細胞生存率が ZO 抽出物処理によって変化しなかったことを示しています。 さらに、ショウガ抽出物（ZO）の抗メラニン生成効果を分析しました。 MITF およびその標的メラニン生成遺伝子の発現は、活性化された ERK1/2 シグナル伝達経路を介して ZER によって減少したため (図 2 および 3)、ZO 抽出物が B16F10 細胞における -MSH 誘発 MITF およびその標的メラニン生成タンパク質の発現を抑制するかどうかを確認しました。 ZER の抗メラニン形成効果と同様に、-MSH 誘発 MITF、チロシナーゼ、および TYRP2 は、ZO 抽出物によって用量依存的に有意に減少しました (図 5B)。 興味深いことに、ERK1/2 リン酸化も ZO 抽出物で処理した細胞で増加しました (図 5B)。 MITF およびチロシナーゼ、TYRP1、TYRP2 などのその標的遺伝子の発現は、5 μg/μL ZO 抽出物処理により大幅に減少しました (図 5C)。 さらに、細胞外および細胞内の両方のメラニン含有量は、5 μg/μL ZO 抽出物処理により約 40 パーセントに大幅に減少しました (図 5D)。 さらに、ZO 抽出物で処理した細胞ではチロシナーゼ活性の低下が観察されました (図 5E)。 これらの結果は、ショウガ(ZO)抽出物がMITF媒介メラニン生成遺伝子発現を減弱させることによりメラニン生成を抑制することを示唆しています。
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