概要： ポリフェノールは、食物性抗酸化物質として知られています。 これらは最近、太陽の紫外線照射による皮膚の老化や色素沈着過剰を防ぐ用途に大きな関心を集めています。 Prunus persica (L.) の葉は副産物と考えられており、ポリフェノールの含有量が高いため、顕著な抗酸化活性があることが報告されています。 この研究は、皮膚への送達を高めるために固体脂質ナノ粒子（SLN）にロードされたサクランボ（L.）のエタノール葉抽出物（PPEE）を使用した、化粧品用アンチエイジングおよび皮膚美白クリーム製剤の開発を目的としました。 PPEE の化学調査では、顕著な抗酸化活性を備えたフェノールおよびフラボノイドの総含有量が著しく高いことが示されました (DPPH、ABTS、およびβカロテンのアッセイ)。 珍しい構造を持つユニークなアシル化ケンフェロール配糖体、ケンフェロール 3-O- -4C1-(600 -O-3、4-ジヒドロキシフェニルアセチル グルコピラノシド) ( KDPAG) が初めて単離され、その構造が完全に解明されました。 これは、フラボノイド化学における 3,{{10}} ジヒドロキシ フェニル酢酸によるアシル化の最初の例を表します。 ヒトケラチノサイト細胞株に対するインビトロ細胞毒性研究により、PPEE および PPEE-SLN の無毒性が明らかになりました。 さらに、PPEE、PPEE-SLN、および KDPAG は、N (メトキシスクシニル)-Ala-Ala-Pro-Val-クロロメチル ケトンに匹敵する良好な抗エラスターゼ活性を示しました。 さらに、PPEE-SLN と KDPAG は、それぞれ EDTA とコウジ酸と比較して、有意に高い (p < 0.001) 抗コラゲナーゼ活性と抗チロシナーゼ活性を示しました。 さまざまな PPEE-SLN クリーム配合 (2 パーセントおよび 5 パーセント) が、しわスコアリング法を使用して、マウス モデルにおける UV 誘発光老化に対する抗しわ活性について評価され、証拠どおり、UV に対して非常に顕著な保護効果を提供することが示されました。組織バイオマーカー (SOD) および組織病理学的研究による。 したがって、今回の研究は、サクラの葉の副産物が天然の化粧品成分として興味深い貴重な資源を提供することを実証しています。 これは、皮膚浸透特性が強化された局所アンチエイジング化粧品配合物における PPEE-SLN の安全な使用の可能性をさらに研究するための関連データを提供します。

関連する研究によると、カンクン「寿命を延ばす奇跡のハーブ」として知られる一般的なハーブです。 その主成分は、シスタノシドなど様々な効果があります。抗酸化物質, 抗炎症薬、 と免疫機能の促進。 シスタンシュとのメカニズム美白抗酸化作用にありますシスタンケ配糖体。 人間の皮膚のメラニンは、次の物質によって触媒されるチロシンの酸化によって生成されます。チロシナーゼ、酸化反応には酸素の関与が必要なため、体内の酸素フリーラジカルはメラニン生成に影響を与える重要な要素になります。 シスタンケには抗酸化物質であるシスタノシドが含まれており、体内のフリーラジカルの生成を減らすことができます。メラニンの生成を抑制します。

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1. はじめに

皮膚の老化は、皮膚と結合組織の物理的変化を触媒する複雑な多因子の進行性プロセスです [1]。 老化は内因性老化と外因性老化に分類されます。

外因性皮膚老化は、主に汚染物質、喫煙、生活ストレスなどの環境要因、または主に紫外線への繰り返しの曝露（光老化）によって生じます[2]。

紫外線への過度の曝露は、活性酸素種 (ROS) の過剰生成を刺激し、その結果、皮膚組織に内因性酸化ストレスが生じ、細胞外マトリックス (ECM) 成分の分解につながります。 ECM の分解は皮膚の老化に直接関係しており、皮膚の老化に関与するコラゲナーゼ、エラスターゼ、チロシナーゼなどの特定の酵素の活性増加の原因となります。 これらの真皮酵素の活性化はエラスチンとコラーゲンのレベルの低下を引き起こし、皮膚の弾力性と強度の喪失、しわの出現につながります[3]。 また、過剰なメラニン生成と皮膚の日焼けの誘発により、皮膚の色素沈着過剰が生じます。

したがって、皮膚の老化はフリーラジカル消去活性を持つ抗酸化物質によって防ぐことができ、これは ROS が関与する加齢関連疾患の防御と治療において大きな重要性を持つ可能性があります [4]。 老化を遅らせるもう 1 つの方法は、エラスターゼ、コラゲナーゼ、チロシナーゼ阻害剤を使用することです。これらは、皮膚の弾力性の維持を裏付ける抗シワおよび美白作用の非常に強力な候補であり、色素沈着疾患に対処する一般的なアプローチとなりえます [5]。

植物から単離された天然抗酸化物質は、in vitro および in vivo の両方で UV 照射によって引き起こされる光老化のリスクを軽減することが報告されており [6]、コストと副作用の点で合成抗酸化物質よりも化粧品成分として好ましいです。 さらに、多くの in vitro および in vivo 研究では、フェノール酸、フラボノイド、タンニンなどのフェノール化合物がフリーラジカルを除去し、エラスターゼ、コラゲナーゼ、チロシナーゼ酵素を阻害する可能性があることが示されています [7]。

外的要因によって引き起こされる酸化ストレスから皮膚を保護するために、局所製剤に天然の抗酸化物質を使用することが報告されています[8]。 しかし、抗酸化分子の大部分は本質的に不安定であり、作用部位に到達する前に容易に酸化して不活性化合物を形成する可能性があるため、適切で安定した化粧品に配合することが困難になります。 これらの発見は、これらの抗酸化製剤を強化するための独自の送達システムの必要性を証明しています[9]。

局所的に塗布されたポリフェノールの浸透性に影響を与える要因がいくつかあります。 フェノールのサブクラス、その構造、その分子サイズ、グリコシドまたはアグリコンの形態、およびその他の配合成分。 しかし、物理的および化学的方法を組み合わせた皮膚成分との相互作用は、角質層のバリア構造の可逆的な破壊を通じて透過性を改善する可能性があります。 カプセル化アプローチは、保存中にポリフェノールを簡単に安定化し、抗酸化効果、皮膚吸収、化粧品や局所療法における浸透を高めるために最も一般的に使用される浸透性を高める方法の 1 つです。 新しく開発されたカプセル化技術には、ナノエマルジョン、トランスフェラーゼ、固体脂質ナノ粒子、ナノ結晶、およびリボソームが含まれます[10]。

固体脂質ナノ粒子 (SLN) は、皮膚製品の安定した送達システムです。 SLN は、その光安定性、制御放出特性、吸蔵性、臭気マスキング効果、および皮膚刺激の兆候がなく水分補給を高めることによる皮膚を介した有効成分の浸透の促進により、その簡便さに加えて、局所製剤用の有望な薬剤担体であると考えられています。生産性、低毒性、物理的安定性が優れています [9,11]。

世界的には、約 2000 の桃の品種があります [12]。 サクラ属 (バラ科) は、フェノールが豊富な種を含む有名な植物属です [13-15]。 この属のいくつかの種は、食用の果実または観賞用としてエジプトで栽培されている[16]。

Prunus persica (L.) Batch (PP) は、無毛の小枝と短い幹、広がった丸い冠を持つ小さな木であり [12]、西アジア、ヨーロッパ、インド、北アフリカで一般的に栽培されています [17]。 伝統的に、その葉は利尿剤、下剤、駆虫剤、殺虫剤、鎮静剤、百日咳、白皮症の治療、解熱剤として使用されてきました[17]。 さらに、葉の薬理学的研究では、生体内での抗糖尿病、けいれん誘発作用、抗炎症作用、抗凝固作用、肝保護作用、抗マラリア作用、抗喘息作用、および顕著な抗酸化活性を伴うインビトロ細胞傷害作用、抗菌作用、一酸化窒素阻害作用が特徴付けられています。 [18-22]。

PP フォロワー、果物、種子のフェノールプロファイル、抗酸化活性、薬理学的および栄養価を調査するために多くの研究が行われています [13、14、23、24]。 しかし、葉に関するデータは非常に乏しかった。 現在までに、エタノール葉抽出物から 5 種類のフラボノール配糖体を単離した報告が 1 件あります [25]。 さらに、フラボノールをすべての決定された化合物の中で主要な物質として HPLC-MS 分析を使用して、フェノール酸とフラボノイドを含むフェノール化合物が特性決定されています [20,26]。

さらに、PP の種子、果実、フォロワー、およびその他の種は、UV 誘発性の光老化に対する生体内保護活性と、試験管内抗シワおよび皮膚美白活性を有することが報告されている [15、23、27-32]。 PP 葉抽出物についてはこれまで報告されていません。

大量の PP 葉は、桃の木の栽培や果物の缶詰産業に由来する副産物です [33]。 PP の種子、果物、その他の葉の品種の副産物は、化粧品や価値向上の可能性を秘めたダイエット食品として評価されています [32、34、35]。 しかし、我々の知る限りでは、PP var.の葉の副産物は、 フロリダプリンスはこれまで調査されたことがなく、植物化学物質の興味深い供給源である可能性があります。 他の業界と比較して、化粧品市場はよりアクセスしやすく拡大しており、副産物の価値を高める源となる可能性があります[15]。 スキンケアおよび皮膚老化製品は、美容上最も重要な可能性のあるものの一部です。

エジプトの食用植物のポリフェノールに関する我々の研究 [36] の継続で、PP の葉は副産物と考えられており、主にフラボノール含量が高いために顕著な抗酸化活性があると報告されているため、この研究は PPEE を広範な植物化学物質にさらすことを目的としています。 PPEE のフェノール プロファイルを分析し、独自の皮膚送達システムとして装填された SLN に PPEE を組み込みます。 さらに、PPEE、PPEE-SLN、および単離された成分の in vitro 抗酸化活性を調査するとともに、皮膚関連酵素に対するそれらの阻害効果を評価することにより、老化防止および美白化粧品の可能性を評価しました。 PPEE-SLN を局所化粧品アンチエイジング クリームに組み込み、製品の安全性をテストするだけでなく、紫外線による光老化に対する PPEE-SLN クリーム製剤の生体内抗しわ活性の評価も行います。マウスモデル。 これは、皮膚透過性を高めた局所製剤における PPEE-SLN 葉の使用の可能性をさらに研究するためのデータを提供する可能性があります。

2. 材料と方法

2.1. 全般的

2.2. 植物素材

2.3. 植物抽出物の調製 

2.4. 総ポリフェノール含有量 (TPC) の測定 

Li et al. [37] によって記載されている Folin-Ciocalteu 試薬を使用して、PPEE 中の総フェノール含有量を推定し、mg 等価没食子酸 / g 乾燥抽出物として表されました。

2.5. 総フラボノイド含有量 (TFC) の測定

Bahromun et al. [38] によって記載されている塩化アルミニウム比色法を使用して、総フラボノイド含有量を推定しました。 結果は、ケルセチンのmg当量/乾燥抽出物のgとして表示されます。

2.6. PPEE の分別と化合物 1 の単離

2.7. ケンフェロール3-O- -4C1-(6"-O-3,4-ジヒドロキシフェニルアセチルグルコピラノシド)の同定 (1)

2.8. 体外研究

ヒトケラチノサイト細胞株は、VACSERA CO. (エジプト、ギザのワクチン、血清、および医薬品の生産を行うエジプト会社) から入手しました。 MTT アッセイは、Mostafa et al. の方法に従って、PPEE および PPEE-SLN に対して行われました。 [36]。

DPPH アッセイは、Yardpiroon et al. の方法を使用して実行されました。 [39]、ビタミン C を陽性対照として使用しました。 ABTS アッセイは Re et al. [40] の方法に従い、ビタミン C を標準として使用しました。 β-カロテン漂白アッセイは、ポジティブコントロール BHT の存在下で Soulef et al. [14] によって記載された方法を使用しました。 各試験サンプルの値は、50 パーセントまたは IC50 での阻害曲線として表されました。

老化防止および美白活性は、Mostafa らによって報告された方法に従って評価されました。 [41]。 抗エラスターゼアッセイでは、1 μg/mL のヒト白血球エラスターゼを、HEPES 緩衝液 pH 7.5 および試験した各抽出物または 1.4 mg/mL N-メトキシスクシニル-Ala-Ala-Pro-クロロメチルケトン (標準阻害剤) とともにインキュベートしました。 96- ウェルプレートを室温で 20 分間静置した後、基質として 1 mM N-メトキシスクシニル-Ala-Ala-Pro-Val-p-ニトロアニリド 100 μL を添加します。 40分間のインキュベーション後、抽出物/阻害剤を含まないウェルをブランクとして使用して、405 nmで吸光度を測定しました。 試験サンプルは 25 ～ 300 µg/mL の濃度範囲で使用されました。

2.9. PPEE-SLN の配合と特性評価

配合はChoubeyらの方法に従って行った。 [11]。 まず、モノステアリン酸グリセリルをクロロホルムとメタノールの混合物 (1:1) に溶解し、次にエタノール抽出物をその溶液に分散させます。 その後、ロトバップを使用して有機溶媒を除去し、溶液を加熱した。 次いで、Ｔｗｅｅｎ ８０を添加し、混合物を３０００ｒｐｍで３０分間撹拌し、次いで、濾過して乾燥する前に４時間均質化した。 PPEE-SLN の特性評価は、形状と表面形態、粒子サイズ、多分散指数 (PDI)、ゼータ電位分析、捕捉効率パーセント (PEE)、およびフーリエ変換赤外 (FT-IR) 分光研究を推定することによって調べられました。

2.10. PPEE 局所クリーム製剤の調製

クリームの２つの配合物（２パーセントおよび５パーセントのＰＰＥＥ－ＳＬＮ）を、表１に示すように、Ｍａｈａｗａｒらの方法に従って調製した。 [42]。

官能特性、クリームの pH、展延性研究、粘度試験、均一性試験、パッチ テスト (バーチャード テスト)、インビトロ皮膚透過試験、および安定性研究 (ICH ガイドライン) を Matangi et al. に従って評価しました。 [43]。 Sekar et al. に従って微生物限界試験を実施しました。 [44]。

2.11。 PPEE-SLN クリームの生体内抗シワ研究

50 匹の雄ヘアレスマウス (HR{0}) (4- 週齢)、17 ～ 24 g を VACSERA から入手しました。 実験は、10月現代科学芸術大学（MSA）の倫理委員会の承認後に実施され、プロトコル番号（PG1/EC1/2020PD）のサンプルサイズは（G. Power）ソフトウェアに従って決定されました。 in vivo 抗しわ研究の 1 週間前に、マウスに餌と水を自由に摂取させ、空調の効いた部屋 (23 ± 2 °C) に順応させました。 表 2 に示すように、マウス (50 匹) をランダムに 5 つのグループ (n=10) に分けました。治療は 40 日間にわたって週 3 回、0.5 g の PPEE-SLN クリームまたはその他の治療法で行われ、適用されました。マウスの背側皮膚に塗布し、その後 UV (365 nm) に曝露しました。

局所治療の前後で、週に２回、マウスの背部の皮膚の写真を撮影した。 皮膚のしわの等級は、Bissett の視覚的しわスケールを使用して評価されました [45]。 評価スケールの基準は、しわ（細かいまたは粗い）および角化症の質感であり、悪化（-2）、わずかに悪化（-1）、変化なし（0）、わずかに改善（プラス 1)、および改善 (プラス 2)​​。

組織学的評価は、Elder et al.の方法に従って行った。 [46]。

2.11.4. スーパーオキシドジスムターゼ (SOD) 活性

SOD活性は受田らの方法に従って推定した。 [47]。

2.12. 統計分析

3. 結果

3.1. フェノールおよびフラボノイドの総含有量

TPC は、PPEE 中で分光光度法により 387.5 ± 4.28 mg GAE/g 抽出物として測定されました。 また、TFC は 241.7 ± 3.25 mg QE/g 抽出物と推定されました。 PPEE は、高濃度のフェノール化合物とフラボノイド化合物を示しました。 両方の結果は、PP 葉抽出物に関して以前に報告された値に従っており、フラボノイドが PP 葉の主な化学成分であることが確認されています [20]。

3.2. ケンペロールの単離と構造解明

3-O- - 4C1-(600 -O-3、4-ジヒドロキシフェニルアセチルグルコピラノシド)、化合物 1

その抽出物内のすべての既知の構造を分類した後、ユニークな潜在的に生物学的に活性な化合物の検索がより効率的になりました。 受け取った 2-DPC 分析データによると、PPEE のフェノール成分は、極性を減少させながら MeOH/H2O 混合物で溶出する MCI ゲルカラムで最もよく分画されることがわかりました。このプロセスにより、4 つの主要なカラム画分が得られます。 非晶質物質を、室温で一晩放置することにより、画分ＩＩＩの熱濃縮物（７０％ＭｅＯＨ水溶液によってカラムから脱着された）から分離した。 この物質を沸騰 EtOH から 2 回結晶化すると、クロマトグラフィー的に純粋な黄褐色の非晶質粉末 1 が得られました。これはクロマトグラフィー特性を示しました (UV 光下では PC 上で暗紫色のスポット、アンモニア蒸気で発煙するとレモンイエローに変わり、水性溶媒および有機溶媒中では適度に移行します) ) および呈色反応 (Naturstoff 試薬によるレモンイエロー色) から、遊離の 40 個のヒドロキシル基と O-置換された 3-O-位を持つケンフェロール誘導体が示唆されました。 MeOH 中の 1 の UV スペクトル (268 nm、316 nm、360 nm) および診断用シフト試薬 [48] の添加後の UV スペクトルは、3- O-グリコシル化ケンフェロールの典型的なものでした (NaOAc による正のシフト、安定したシフト) NaOMeを使用)。 1 の常酸加水分解 (2 N HCl 水溶液、3 時間、100 °C) により、グルコース (比較ペーパークロマトグラフィー、Co-PC)、ケンフェロール、および 3,4- ジヒドロキシフェニル酢酸 (UV) が得られました。加水分解物の酢酸エチル抽出物の分取ペーパークロマトグラムによって分離された個々のサンプルの吸収および 1H-NMR スペクトル）。 したがって、1 はケンペロール 3-O-(3,4- ジヒドロキシ フェニル アセチル グルコシド) です。 化合物は、α-グルコシダーゼ酵素とともに24時間インキュベートした後も変化せずに回収され、グルコシル部分がアシル化されていることを証明しています。 1 の分子式は、m/z=597.5302 で [MH]- イオンを示すネガティブ HRESI 質量スペクトルから C29H26O14 であると結論付けられました (C29H25O14 の計算値、597.5015)。 ESI-MS 実験 (マイナスイオン モード) では、m/z: 597 で準分子イオン ピーク [MH]- が得られ、1 の分子量が 598 であることを示しました。ESI-MS-MS スペクトルのさらなるフラグメント イオン ピークは、 m/z: [MH]-: 447、167、および 285 で観察され、親化合物 1 からの酢酸ジヒドロキシフェニルの損失に対応しますが、m/z 285 および m/z 167 でのフラグメントイオンはケンペロールおよびそれぞれジヒドロキシフェニル酢酸部分。 1 の分子内のすべての部分の結合部位を決定し、すべての炭素およびプロトン共鳴の完全な帰属を可能にするために、1D- 1H および 13C、および 2D-HSQC および HMBC を含む 1 の NMR 分光分析が行われます。 、その後実施されました。 δ ppm 62.25 ～ 76.9 の糖領域の 5 つのシグナルと 99.13 ppm に位置するアノマー炭素シグナルから、この C-3 炭素シグナルはケンフェロールの 3 位に結合している必要があることが証明されました。はアップフィールドにシフトされ、対応するオルトおよびパラカーボン信号はダウンフィールドにシフトされました（実験を参照）。 同様の変化は、Nawwar らの研究からよく知られています。 [48]。 これは、HMBC スペクトルで認識される 3J 長距離相関によってさらに確認され、δ 5.42 でのアノマー グルコース プロトン H-100 シグナルとフラボノール C-3 炭素との相関を示す 1 つの交差シグナルが見つかりました。 δ 133.5 のシグナル。 グルコース部分の立体配置は、99.13 ppm の C-100 化学シフトから導かれました。 糖炭素の化学シフト値により、この部分のピラノース型が確認されました [48]。 1 の 1H-NMR スペクトルも提案された構造によるものでした。 δ 5.42 ppm (d, J=8 Hz) でのアノマー プロトン シグナルの化学シフトは、アノマー炭素が C-3 (δppm 133.5) でケンフェロール部分に結合していることと、決定された結合定数を示しました。 8 Hz、グルコース部分の立体配置を証明します。 糖部分の立体構造は 4C1 であり、その後に上で論じた立体配置が続きます。

また、3,4-ジヒドロキシフェニル酢酸部分のC-600メチレングルコピラノース部分への結合は、13C-NMRスペクトルにおけるこの炭素のシグナルのδppm 62.25への低磁場シフトに続いた。 これは、HMBC スペクトルのクロス ピークによってさらに確認され、δ 4.04 (H-600 a) およびδ 4.2 ppm (H-600 b) のメチレン性グルコース プロトン シグナルと、 3、δ 176.26 ppm の 4- ジクロキシフェニル酢酸部分。 これらと上記のデータにより、化合物 1 の構造が新しいケンフェロール 3-O- - 4C1-(600 -O-3,{ {24}}ジヒドロキシフェニルアセチルグルコピラノシド) (KDPAG) は、フラボノイド化学に関連した 3,4- ヒドロキシフェニル酢酸による最初のアシル化を表すため、自然界で初めて報告されました (図 1)。

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