タイワンシスハヤタマツの針から得られる抗炎症原理とその潜在的な抗老化効果のインシリコ研究
Apr 18, 2023
概要：マツニードルティーは、日本、ロシア、韓国、中国などの東洋諸国で非常に人気があります。 松葉茶には重要な効果があると主張されていますアンチエイジング効果、しかし、これを裏付ける明確な証拠は今のところありません。 本研究では、15 個の未記載の化合物 (1–5) および 72 の既知の化合物が精製され、メタノール抽出物の生物活性画分から特性評価されました。P.タイワネンシス針。
分離株のほとんどは、抗炎症性生物活性細胞好中球モデルと6つの化合物による(45, 47, 48, 49, 50、 と51）を出品しましたスーパーオキシドアニオンの生成を大幅に抑制3.3 の範囲の IC50 値でエラスターゼを放出± 0.9 ～ 8.3± 0.8 µM. これら抗炎症成分代謝の調節に重要な役割を果たすグレリン受容体に対する結合親和性を評価するためにドッキングコンピューティングを行った。アンチエイジング効果。 化合物49, 50、 と51 水素結合やさまざまな種類の相互作用を介して、グレリン受容体と安定した複合体を形成しました。
1. はじめに
マツ属 (マツ科) は 100 種以上からなり、主に北半球に分布し、一般に常緑樹ですが、一部は低木です。1]。 パイン材は軽くて家具などによく使われます。 しかし、松の新芽に対する針のさまざまな薬理効果は、伝統的な中国医学の古い本に記録されています。 「神聖な夫のハーブ財団の典拠」では、松葉は髪の成長を促進し、寿命を延ばし、喉の渇きを潤します。 『太平聖輝方』には、松葉をアルコールで調理すると老化防止効果があることが記録されています。 現在、松葉はお茶として加工され、アジアで人気があります。 韓国では、その構成要素は、P.デンシフローラニードルティーとその抗酸化物質と抗菌物質の生物活性が広範囲に調査されました [2,3]。 前世紀初頭以来、700 を超える化合物が、マツの葉。 報告された文献のほとんどは、P.デンシフルフローラ[4,5], P.ハレペンシス[6,7], P.ニグラ[4,8]、 とP.シルベストリス[4,9]。 特徴的な成分は、マツ針状物質は主にベンゼノイド、ジテルペノイド、フラボノイド、リグナン、モノテルペノイド、セスキテルペノイドです。10]。 の針P.デンシフローラとP. モリソニコラ抗酸化生物活性が報告されている [11–14]。 また、針葉樹の酢酸エチル抽出物は、P. モリソニコラNOのタンパク質とmRNAの発現を阻害し、iLPS 誘導 RAW 264.7 マクロファージの NOS、顕著な抗炎症性生物活性を示す [13]。 超臨界流体抽出物P.デンシフローラ針は、iNOS、IL-6 および IL-1 の発現の減少 LPS によって誘導されるマクロファージの STAT1 および STAT3 タンパク質の活性化 [15]。 エタノール抽出物は、P. ツンベルギ針はマクロファージにおいて顕著な抗炎症効果を示し、アラキドン酸誘発性の耳浮腫を抑制し、ミエロペルオキシダーゼの酵素活性を阻害しました。16]。 また、発酵したものは、P. モリソニコラ針は NF-κB シグナル伝達経路 [17].
グレリンは 28 個のアミノ酸からなるペプチド ホルモンで、もともと胃で発見されました。18,19]。 これは、成長ホルモン分泌促進物質 (GHSR) の内因性リガンドであり、 - クラス A GPCR (G タンパク質共役受容体) の分岐 [18,19]。 グレリンは、食欲を促進するために空腹感を引き起こす唯一のペプチドホルモンです [20]。 多くの研究は、グレリンが人体の代謝、エネルギーバランス、記憶、心臓血管、胃腸の機能の調節に重要な役割を果たしていると示唆しています。21–23]。 グレリンは老化など人体のさまざまな生理学的および病態生理学的メカニズムにも関与しています。24,25]、そしてそれは抗炎症活性に関連している可能性があります [26,27]。 2014 年に、テグレリンと名付けられたユニークなアシル化フラボノイド テトラ グリコシドが、私たちのグループによって初めてチンシン ウーロン茶から同定され、成長ホルモン (GH) 放出の促進活性が実証されました。28]。 他の 2 つの同様の化合物が Shy-jih-chuen ウーロン茶で精製され、グレリン受容体に対するそれらの生物活性も検証されました。29]。 4 つのテグレリンは、グレリンと同じ調節経路を通じて空腹感を誘発しました。 茶に限らず、テグレリンと同様の構造や生理活性を持つ化合物が研究されています。タデ(ハウウー) [30], イチョウ[31], アルバ[32]、 とカンクイ [33]。 これらの結果は、抗炎症作用を持つ茶グレリン様化合物をスクリーニングすることにより、自然な老化防止原理の探索を支援するものです。 細胞モデルで成長ホルモン放出の促進活性を直接実行することに加えて、いくつかの潜在的な化合物の分子モデリングは、可能性のある候補を探索する上でより効率的です。34]。 計算手法は、薬理学的仮説の開発と評価に適用されています。 分子ドッキングは最も一般的に利用される技術の 1 つであり、活性ポケットに結合するリガンドの立体構造と親和性を高精度で予測します。35,36]。 ドッキング手法は、可能性のある相互作用を高次元空間で効果的に検索し、候補を適切にランク付けするスコアリング関数を使用します。37].
2018年に、3つの化合物が針から精製されました。P. モリソニコラそして、顕著な血管弛緩作用を示し、これらの成分のうち、1つは茶グレリン様構造を持つことが報告されています[38]。 台湾では、P.タイワネンシス針葉樹は、その有名な生物活性のため、通常、乾燥させて焼いた後、お茶として加工されます。P.タイワネンシスハヤタは台湾の在来種および固有種の一つです。 タイワンアカマツ、黄山松とも呼ばれます。 長さ8～11cmのやや硬くまっすぐな束状に2本の針があり、低地から高地まで島全域に生育し、しばしば純林を形成する。39]。 予備検査では、メタノールの酢酸エチル層から次の物質が抽出されました。P.タイワネンシス針は、ICによるスーパーオキシドアニオン生成とエラスターゼ放出の有意な阻害を示しました。50 0.8 の値± {{0}.2 および 1.0± 0.1 µそれぞれ g/mL (表 S1)。 したがって、本研究では、P.タイワネンシス針が調査され、精製された化合物の抗炎症作用が評価されました。 細胞好中球モデルにおける生物活性。 さらに、からの分離物は、P.タイワネンシス抗炎症性生物活性を持つ針をドッキングコンピューティングに供し、グレリン受容体との相互作用が研究されました。
2。材料と方法
2.1. 一般的な実験手順
紫外線（UV）スペクトルは、Hitachi U-2001 UV/V は分光計によって取得されました。 の赤外（IR）スペクトルは、Jasco FT/IR-4100 分光光度計で検査されました。1H-, 13C-, および 2D 核磁気共鳴 (NMR) スペクトルは Bruker AV-400 で記録されました。NMR分光計。 化学シフトは次のように表示されます。δ テトラメチルシランによる値 (ppm)内部標準として。 のδH とδC 値はシグナルの化学シフトのもので、それぞれ。 高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析 (HR-ESI-MS)JEOL JMS-700 分光計 (マイナスイオン モードで動作) を使用して実施されました。
2.2. 植物材料
の針P.タイワネンシス台湾の南投県埔里で採取され、身元が確認されたSheng-Yang Wang 教授（国立中興大学林学部）台湾、台中）。 引換券標本（PCKuo_2016003）はハーブバーに預けられました台湾、台南の国立成功大学薬学部卒業。
2.3. 抽出と分離
2.4. 1 ～ 5 のスペクトルおよび物理データ
2.4.2. 1-[(70 R,80 S)-70 ,90 -ジヒドロキシ-70 -(4-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル)プロパン-80 -イルオキシ]-2-ヒドロキシ安息香酸 (2)無色のシロップ。 [ ]25 D プラス5.3(c 0.1、MeOH); UV(メタノール)λ最大（ログε) 284 (3.59), 253(3.80)nm; ECD (c 3.51 × 10−4 M、メタノール)λ最大(∆ε) 248 (プラス 1.33)、224 (プラス 1.03)、214(プラス1.10)nm; IR（きちんと）ν最大3425、2927、1541、1384、1271cm−1;1手1313C NMR; フレシムズm/z 349.0936 ([M − H]− C の計算17H17O8, 349.0923).
2.4.3. (13E,12R)-12-ヒドロキシアガタン酸 (3)
無色の粉末。 mp: 263◦C（12月）; [ ]25 D プラス 30.8 (c 0.1、MeOH); UV(メタノール)λ最大（ログε) 225 (sh) (3.83) nm。 IR（きちんと）ν最大3450、2937、1648、1252cm−1;1H-NMR (CD3OD、400MHz) δ 0.63 (3H、s、CH3-20)、1.09 (1H、ddd、J = 13.6、13.6、3.6 Hz、H-3a)、1.21 (3H、s、CH3-18), 1.21 (1H, m, H-1a), 1.42 (1H, m, H-5), 1.51 (1H, m, H-2a), 1.59 (2H, m, H-11),1.79 (1H, m, H-1b), 1.91 (1H, m, H-2b), 1.91 (1H, m, H-6a), 1.98 (1H, m, H-7a), 2.01 (1H, m,H-6b)、2.08 (3H、s、CH3-16), 2.12 (1H, m, H-9), 2.14 (1H, m, H-3b), 2.43 (1H, m, H-7b), 4.03 (1H、dd、J = 9.2、2.8 Hz、H-12)、4.53 (1H、s、H-17a)、4.91 (1H、s、H-17b)、5.88 (1H, br s, H-14);13C-NMR (CD3OD、100MHz）δ 13.5 (CH3-20)、14.9 (CH3-16), 21.2 (C-2), 27.6 (C-6), 29.6 (CH3-18), 31.5 (C-11), 39.4 (C-3), 40.0 (C-7), 40.3 (C-1), 41.2 (C-10), 45.3 (C-4), 53.1 (C-9), 57.6 (C-5), 75.5 (C-12), 106.9 (C-17), 117.8 (C-14), 150.2 (C-8), 159.5 (C-13), 167.2 (C-15), 181.5 (C-19); フレシムズm/z 349.2024 ([M − H]− C の計算20H29O5, 349.2015).
2.4.4. 5-イソプロピル-3-オキソシクロヘクス-1-エン-1-カルボン酸 (4)
無色の板状結晶。 mp: 235◦C（12月）; [ ]25 D プラス28.6(c 0.3、MeOH); UV(メタノール)λ最大（ログε) 237 (sh) (3.40) nm; IR（きちんと）ν最大3456、2925、1635、1395cm-1;1H-NMR (CD3OD、400 MHz) 0.88 (3H、d、J = 6.8 Hz、チャンネル3-9), 0.98 (3H, d, J = 6.8 Hz、チャンネル3-10), 1.84 (1H, m, H-4a)、2.02 (1H、m、H-4b)、2.09 (1H、m、H-5)、2.31 (1H、hept、J = 6.8 Hz、H-8)、2.50 (1H、dddd、J = 19.2、9.2、4.8、2.4 Hz、H-6a)、2.70 (1H、dddd、J = 19.2、5.2、5.2、1.2 Hz、H-6b)、6.32 (1H、dd、J = 2.4、1.2 Hz、H-2);13C-NMR (CD3OD、100MHz）δ 19.0 (C-9), 20.9 (C-10), 24.3 (C-4), 27.0 (C-6)、27.1 (C-8)、53.7 (C-5)、128.7 (C-2)、160.6 (C-1)、174.8 (C-7)、205.7 (C-3); フレシムズm/z 181.0855 ([M − H]− C の計算10H13O3, 181.0865).
2.4.5. スチラキシノール酸 (5)
無色のシロップ。 UV(メタノール)λ最大（ログε) 308 (2.89)、237 (sh) (3.37)、222 (sh) (3.70) nm。IR（きちんと）ν最大3421、2926、1572、1395、1268cm-1;1H-NMR (CD3OD、400MHz) 1.82 (2H、tt、J {{0}.0、6.8 Hz、H-8)、2.61 (2H、t、J {{0}}.0 Hz、H-7)、3.56 (2H、t、J = 6.8 Hz、H-9)、3.83 (3H、s、OCH3-3), 6.86 (1H, d, J = 2.4 Hz、H-4)、7.31 (1H、d、J = 2.4 Hz、H-6);13C-NMR (CD3OD、100MHz）δ 32.7 (C-7)、35.6 (C-8)、56.6 (OCH3-3), 62.3 (C-9), 116.3 (C-4), 120.1 (C-1), 122.8 (C-6)、131.9 (C-5)、149.2 (C-3)、150.7 (C-2)、176.2 (C-10); フレシムズm/z 225.0767 ([M − H]−C の計算11H13O5, 225.0763).
2.5. 抗炎症生理活性検査
2.5.1. ヒト好中球の調製
この研究は、長庚記念病院の治験審査委員会の承認を得て実施されました（治験審査委員会番号 201800369A3）。 血液サンプルは健康な人間のドナー (20 ～ 30 歳) から採取され、前述のプロトコールに従って好中球が分離および精製されました。40].
2.5.2. スーパーオキシドアニオンの生成
測定 スーパーオキシドアニオンの生成を測定するアッセイは、SOD によって阻害されるフェリシトクロムの還元に基づいていました。c 前述したように [40].
2.5.3. エラスターゼ放出アッセイ
アズール親和性顆粒の脱顆粒は、前述のようにエラスターゼの放出を測定することによって決定されました。40].
2.5.4. 統計分析 結果は平均値として表されます± 平均値の標準誤差 (SEM)。 50パーセント阻害濃度（IC）の計算50) PHARM/PCS v.4.2 ソフトウェアを使用して実行されました。 統計的比較は、学生の統計を使用してグループ間で行われました。t-テスト。 の値p < 0.05 were considered to be statistically significant.
2.6. 分子ドッキング研究
のインシリコ評価は AutoDock Vina ソフトウェアで実施されました [41]。 グレリン受容体の結晶構造は特徴づけられています。42]、および 。 PDB ファイルは Protein Databank (PDB ID: 6KO5) からダウンロードされました。 リガンドの 3D 構造は Chem3D プログラムで構築されました。 水素の補給、タンパク質原子のガスタイガー電荷測定、配位子の柔軟なねじれの選択を実施 AutodockTools (ADT バージョン 1.5.6) による。 グリッドのサイズは 18.5 Å で設計されました。× 18.5 Å × 18.5 Å、寸法 (それぞれ x、y、z) でのグリッド中心: 9.7、-19.2、14.6 が決定されました。 結合親和性エネルギーはドッキング スコアとして提供され、kcal/mol で示されました。 最高のインタラクションは、最高得点のポーズのみとみなされます。 最適なドッキング インタラクションの視覚化は、Biovia Discovery Studio クライアント 2020 で分析されました [43].
