タイワンシスハヤタの針に由来する抗炎症原理とその潜在的な抗老化効果のインシリコ研究Ⅱ

松葉をメタノールで抽出し、ヘキサン、エチルで分配した。酢酸塩と水を加えて、それぞれ3つの可溶層を取得します。 の抗炎症薬分数、酢酸エチル層、従来の連続クロマトにかけたグラフィック技術の組み合わせ、および 5 つの未記載の化合物の特徴付け2 つの新しいリグナンを含む、1-[(70 R,80 S)-70 ,90 -ジヒドロキシ-70 -(4-ヒドロキシフェニル)プロパン-80 -イルオキシ]安息香酸 (1), 1-[(70 R,80 S)-70 ,90 -ジヒドロキシ-70 -(4-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル)-プロパン-80 -イルオキシ]-2-ヒドロキシ安息香酸 (2)、1 つの新しいジテルペノイド、(13E,12R)-12 -ヒドロキシアガタリック酸（3）、モノテルペノイド 1 個、5-イソプロピル-3-オキソシクロヘキサ-1-エン-1-カルボン酸（4)、そして 1 つフェニルプロパン、スチラキシノール酸（5）。 これらの新しい化合物の化学構造NMRスペクトル解明とMSスペクトルの支援を受けて構築されましたメトリクス分析。 さらに、1 つのステロイドを含む 72 の既知の化合物、 -シトステロール (6); セスキテルペノイド 1 個、(-)-オプロパン 1 個-4-1 個-10- -O- -D-グルコシド (7); 一クマリン、ウンベリフェロン（8); 一アルカロイド、インドール-3-アルデヒド（9); 4つのジテルペノイド、

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3-メトキシフェニル）-1-プロパノン（64)、3-ヒドロキシ-1-(4-ヒドロキシフェニル)-1-プロパノン(65),2-(4-ヒドロキシフェニル)酢酸(66)、フェニル酢酸(67)、バニリン酸 (68)、安息香酸酸（69)、バニリン(70), p-ヒドロキシアセトフェノン (71)、サリチル酸ナトリウム(72)、バニリン酸4-O- -L-ラムノシド (73), トランス-フェルラ酸 (74)、ナトリウムp-クマレート (75), p-クーマリン酸（76), トランス-メチルp-クマレート (77) はそれぞれ、以下の検査によって特定されました。それらの物理的データと分光学的データを、以前に公開されたデータ (既知の文献の参照) と照合します。化合物は補足資料付録 B) に記載されています。

3.1. 化合物1～5の構造解明

コンパウンド1 光学活性な無色のシロップとして単離され、分子式は C として割り当てられました16H16O6 HR-ESI-MS 分析による ([M− H]−, m/z 303.0855、計算値。Cの場合16H15O6、303.0869、図S1）。 IR スペクトルはヒドロキシル基の存在を示します。(3412cm−1 ) および共役カルボニル基 (1598 cm−1 ）。 の1H-NMR データ (図 S2)二人分の信号を示したパラ-置換された芳香族部分 [δH 6.72 (2H, d, J = 8.4 Hz、H-30 , -50 ), 6.86 (2H, d, J = 8.8 Hz、H-2、-6)、7.24 (2H、d、J = 8.4 Hz、H-20 , -60 )、および 7.83(2H, d, J = 8.8 Hz、H-3、-5)]、2 つの酸素化メチン [δH 4.48 (1H, m, H-80 )、4.85(1H, d, J = 5.6 Hz、H-70 )]、および 2 つのメチン [δH 3.81 (1H、dd、J {{0}}.0、4.0 Hz、H-90 a), および 3.86 (1H、dd、J {{0}.0、5.6 Hz、H-90 b)]。 の13C および DEPT NMR スペクトル (図 S3)の1 16 個の炭素が表示され、1 つのメチレン基と 2 つの酸素化された基に対応します。炭素、12 個の芳香族炭素、および 1 個の共役カルボニル (表1）。 の2 J- と3 J- H-2、-6からC-1および4までのHMBC相関。 H-3、5からC-1、7まで。 H-2から0, 60 にC-40 そして70 ; H-7から0 C-8へ0 そして90 ; そしてHから-80 から C-1 までがそれぞれ観察されました。HMBCスペクトル1 (図S4)。 さらに、H-7 間の大きな結合定数0 そしてH-80 (J = 5.6 Hz) の相対構成をサポートしました1 C-7で0 /C-80 として三人[44]. C-7 の絶対構成0 そしてC-80 の1 電子回覧により決定された二色性 (ECD) 分析。 230 nm での正のコットン効果 (∆ε プラス 0.17) は 8 を明らかにしましたS の構成1, 出版された文献によると[37,38]したがって70 R もあった決定。 他の 2D スペクトル (図 S5–S7) は、陽子とカーボンシグナル。 したがって、の構造は、1 1-[(70 R,80 S)-70 ,90 -ジヒドロキシ-7 0 -(4-ヒドロキシフェニル)プロパン-80 図に示すように、[-イルオキシ]安息香酸1. 

の分子式は、2 Cとして割り当てられました17H18O8 HR-ESI-MSに基づく分析データ（m/z 349.0936 [M − H]−、図S8）。 IRスペクトルの吸収(3425cmと1541cm−1 ) ヒドロキシルおよび共役カルボニル官能基を示しました。それぞれ。 NMRスペクトルを比較すると、1 と2、それは彼らが異なる芳香部分を持っていました。 2 セットの ABX 結合芳香環と 1 つの芳香環メトキシ基が検出される可能性があります。1H- (図 S9) および1333 C-NMR (図 S10) データの2 （テーブル1)、そしてそれはその化合物を示唆しました2 ではなく 2 つの三置換体を持っていましたパラ-二置換された芳香族部分。 有意な HMBC 相関関係 (図 S11)H-3 から C-1、C-5、C-7 へ。 H-6からC-4まで; OCHから3-30 C-3へ0 ; H-6から0 C-4へ0 とC-70; H-7から0 C-1へ0 , C-20 , C-80 そして90 ; H-8から0 から C-1 まで、それぞれ次のことを確立しました。の構造2 ネオリグナン骨格もあった。 大型カップリングの組み合わせにより絶え間ない （J7,8 = 5.2 Hz) および 230 nm での正のコットン効果 (∆ε プラス 1.14)、絶対値の構成2 として割り当てられました三つ- そして (70 R,80 S)-形式、と同じ1 [44,45]。 他の2D スペクトル (図 S12–S14) により、プロトンと炭素のシグナルの完全な割り当てが得られました。これらの発見により、次の構造が結論付けられました。2 1-[(70 R,80 S)-70 ,90 -ジヒドロキシ-70 -(4-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル)プロパン-80 -イルオキシ]-2-ヒドロキシ安息香酸（図1). 

コンパウンド3 無色の粉末として得られ、その分子式はCとして割り当てられる20H30O5 HR-ESI-MS 分析データに基づく (m/z 349.2024 [M − H]−, 図S15)。 コンパウンド3 3450 (OH) および 1648 (カルボン酸) に吸収ピークを示しました。酸）cm−1 IRスペクトルで。 それは、によって証明されました13C-NMR スペクトル (図 S16)どの 2 つのカルボキシル官能基が観察されたかδC 167.2 (C-15) および 181.5 (C-19)。 のこれは1H-NMR (図 S17)、での共鳴δH 4.03 (1H、dd、J = 9.2、2.8 Hz、H-12) およびδC 75.5 (C-12) は、第二級アルコール基の存在を示しました。 末端メチレンの陽子共鳴によりグループが確立される可能性があります。δH 4.53 (1H、s、H-17a) および4.91 (1H, s, H-17b)、および炭素シグナルδC それぞれ106.9 (C-17)と150.2 (C-8)。2 つのメチル基δH 0.63 (3H、s、CH3-20) および 1.21 (3H、s、CH3-18) に接続されましたHMBC 相関によって証明された第 4 級炭素 (C-10 および C-4) (図 S18)。C-4 のカルボキシル基の遮蔽効果により、CH の高磁場シフトが発生しました3-20 (δH 0.63)、それを示唆しています-構成 [46]。 さらに、H-17a の化学シフト (δH 4.53) は高磁場領域に現れ、12 を示唆しています。R 構成 [47]。 そのHMBCではスペクトル、H-12 から C-9、C-14、C-16 までの相関。 H-17からC-7およびC-9まで。CHから3-16 から C-12 および C-14 へ。 CHから3-18 から C-3、C-4、C-19 へ。 CHから3-20 から C-1、C-5、C-9 と C-10 はそれぞれ、次の平面構造を構築しました。3 以前に報告されたように12-ヒドロキシアガタ酸の場合 [46]。 ただし、C-13 構成は3 決定されましたとしてE NOESY 分析データ (図 S19) によると、以下の NOE 効果が示されています。H-5/H-9、H-5/H-18、H-12/H-14。 さらに、H-14 と CH 間の NOE3-16, これは12-ヒドロキシアガタ酸[46]では検出されませんでした。3。 他の2D スペクトル (図S20–S21) は、陽子と炭素の信号の完全な割り当てを提供しました。結論的に言えば、その構造は、3 として設立されました (13E,12R)-12-ヒドロキシアガタ酸としてを示します（図1).

HR-ESI-MS スペクトル4 [M]を出品しました− H]− イオンピークm/z 181.0855 (図S22)、C の擬似分子式と一致10H13O3。 吸収ピークは 3456 cm と 1635 cm-1 IRスペクトルではヒドロキシルと共役カルボニルが表示されましたそれぞれのグループ。 2 つのメチン プロトンδH 2.09 (1H, m, H-5) および 6.32 (1H, dd,J = 2.4, 1.2 Hz、H-2)、2 つのメチレン基δH 1.84 (1H, m, H-4a), 2.02 (1H, m, H-4b), 2.50 (1H、dddd、J = 19.2、9.2、4.8、2.4 Hz、H-6a) および 2.70 (1H、dddd、J = 19.2、5.2、5.2、1.2 Hz、H-6b)、および 1 セットのイソプロピル プロトンδH 0.88 (3H, d, J = 6.8 Hz、CH3-9), 0.98 (3H, d, J = 6.8 Hz、CH3-10) および 2.31 (1H、hept、J = 6.8 Hz、H-8）が、11H-NMRスペクトルの4 (図S23)。 さらに、1 つの共役カルボニル炭素は、δC 174.8 (C-7)、および 1カルボキシル炭素δC 205.7 (C-3) は、13C-およびDEPT NMRスペクトル(図S24)。 H-2 から C-7 までの観察された HMBC 相関 (図 S25)。 H-4からC-3; H-6 から C-1、C-2、C-5 まで。 CHから3-9 から C-5、および CH3-10; CHから3-10からC-8、それぞれの構造を構築しました4 5-イソプロピル-3-オキソシクロヘクス-1-エン-1-カルボン酸として酸（図1）。 他の 2D スペクトル (図 S26–S28) は、陽子の完全な帰属を示しました。そしてカーボンシグナル。 ただし、C-5 の立体化学は未決定のままでした。

コンパウンド5 分子式Cを持っていました11H14O5 脱プロトン化されたものから決定されるネガティブモードHR-ESI-MS分析における分子イオンピーク(m/z 225.0767 [M − H]−、 形S29）。 IR スペクトルでは、ヒドロキシル (3421 cm−1 ) およびカルボキシル (1572センチメートル−1 ) 機能が検出される可能性があります。 の1H-NMR スペクトル (図 S30) により、2 つの長距離スペクトルが明らかになりました。芳香族プロトンを結合させるδH 6.86 (1H, d, J = 2.4 Hz、H-4) および 7.31 (1H、d、J = 2.4 Hz、H-6)、1 つのメトキシ基δH 3.56 (2H, t, J = 6.8 Hz、H-9)、および 1 セットプロパノールプロトンδH 1.82 (2H、tt、J {{0}.0、6.8 Hz、H-8)、2.61 (2H、t、J {{0}.0 Hz、H-7) および 3.56(2H, t, J = 6.8 Hz、H-9）。 さらに、1 つのカルボキシル基は次の位置にありました。δC 176.2 (C-10) でこれは1313 C-NMR スペクトル (図 S31)。 の平面構造5 重要な人物によって設立されましたOCHのHMBC相関（図S32）3-3 から C-3 へ; H-6からC-2、C-4、C-7、およびC-10。 ひ-7C-4、C-5、C-8 へ。 それぞれ H-9 から C-7、C-8 です。 その他の 2D スペクトル (図 S33–S35)陽子と炭素の信号の完全な割り当てを提供しました。 上記の証拠が示唆するのは、の構造5 2-ヒドロキシ-5-(3-ヒドロキシプロピル)-3-メトキシ安息香酸として (図1), これは以前の合成文献でスチラキシノール酸としてすでに報告されていました [48]. それにもかかわらず、本研究は、5 天然源から。

3.2. 抗炎症活性

炎症は細菌によって刺激される主要な自己防衛メカニズムの 1 つです。ウイルス、傷、その他さまざまな環境要因。 それは免疫の最初の反応です感染症や刺激に対するシステム。 好中球は豊富な種類に属しますマクロファージの一部であり、炎症において主要な役割を果たし、通常は最初のリンパ球です。細胞が感染領域に到達する [49]。 好中球は、次のような一連の細胞毒素を分泌します。免疫系の活性化に応答したスーパーオキシドアニオンとエラスターゼ [50]。 の近年、人間のさまざまな病気が好中球に関連していることが証明されています。過剰発現 [51–55]。 炎症とがんの関係は確立されている、そして著者らは、がん細胞の形成が直接関係していると指摘しました。炎症 [49]。 したがって、新しい抗炎症化合物は、がん治療に関するさらなる研究。 43 の単離された化合物が評価されました。ヒト好中球によるスーパーオキシドアニオン生成とエラスターゼ放出の阻害fMLF/CB への応答 [56]（補足資料、表S2を参照）。 重要な点抑制性の結果（表2) のみを実証しました45, 47, 48, 49、 と50 （形2）が表示されるICによるスーパーオキシドアニオン生成の大幅な阻害50 ～の範囲の値3.3 ± 0.9 に7.7 ± 0.9 µM 陽性対照 LY294002 との比較 (IC50 1.1 ± 0.3 µM). さらに、48, 50、 と51 （形2）エラスターゼ放出の有意な阻害が明らかになったIC付き50 5.3 からの範囲の値± 0.2 ～ 8.3± 0.8 µMとポジティブを比較コントロールLY294002(IC50 3.2 ± 1.0 µM) (テーブル2）。 化合物48 と50 両方表示されましたスーパーオキシドアニオンの生成とエラスターゼの放出を阻害し、それらの複数の作用を示します。抗炎症性生物活性。 の針P. モリソニコラあると報告されているRAW 264.7 マクロファージの抗炎症作用 [13]。 著者らは次のように提案したエピカテキンとp-クマリン酸は以下で確認されましたP. モリソニコラ有効成分かもしれません。現在の研究では、すべての活性化合物に同様のフラボン骨格が含まれていました。エピカテキンとp-クマロイル部分は以下でも観察できます49, 50、 と51。 これは、フラボノイドとp-クマロイル官能基が寄与する可能性がある本研究における抗炎症性生物活性。 これらのバイオアッセイ結果は、次のことを示唆しています。フラボノイドは重要な役割を果たしますマツ抗炎症生物活性のための種。

表 2.スーパーオキシドアニオン生成とエラスターゼ放出に対する精製化合物の阻害効果fMLF/CBに応答したヒト好中球による。

図2.抗炎症原理の構造45, 47, 48, 49, 50、 と51. 

3.3. 分子ドッキング研究

加齢に伴うGHレベルの低下は神経内分泌の症状であると考えられています老化 [57]。 この現象は、人間や家畜などのいくつかの哺乳類種に存在します。犬、実験用げっ歯類 [57]。 ヒトでは、血漿中のGHレベルが減少し始める身体的に完全に成熟した後も年齢とともに変化し、人生の数十年にわたって継続します。57]. グレリンは、GHSR の内因性リガンドとして同定されており、GHSR の主要な調節因子です。GH分泌 [18,19]。 グレリンはさまざまな生理学的および病態生理学的に関与しています老化などの人間のメカニズム [24,25]。 さらに、グレリンは次のように考えられます。抗炎症作用に関係していると考えられます。 免疫細胞の活性化はグレリンによって制限されるNF-の阻害による治療κB の活性化とそれに続く MCP-1 の分泌 [26]. 合成グレリン類似体成長ホルモン放出ペプチド-2 (GHRP-2) が報告されました関節炎のラットの炎症因子を減少させ、免疫細胞の活性化をサポートします。グレリン受容体の活性化によって媒介される [27]。 ネベスら。 も提案されましたアンチエイジング介入としての炎症の制御 [58]。 したがって、によれば、抗炎症バイオアッセイ実験データ、45, 47, 48, 49, 50、 と51 （形2)が示した顕著な阻害効果があり、それらの結合能力を決定するために選択されました。グレリン受容体。 ドッキングシミュレーションの前に、6KO5 に含まれるネイティブリガンド (8QX)PDB ファイルが検証のために再ドッキングされました。 8QX と 6KO5 の間の相互作用と計算結果のベストポーズはネイティブデータとの高い類似性と再現性を示しました(データは示されていません)。 結果は既存のシミュレーションシステムの精度の高さを示していますそしてさらなるコンピューティングをサポートしました。

各リガンドの最も低い結合エネルギーが最良の立体構造であると考えられました。 の結合親和性を表に示します。3。 成長ホルモン放出ペプチド 6 (GHRP-6) は私たちの場合のように、グレリン受容体の結合ポケットにドッキングするためのポジティブコントロールとして使用されます。前回のレポート。 AutoDock Vina はペプチド間のドッキング用に構築されていませんが、およびタンパク質に関して、いくつかの成功した結果が以前のレポートで発表されています [59–61]. したがって、この研究では、最初に GHRP-6 を計算して、現在のドッキング モデルと結果はよく一致しました (図3A)。 GHRP-6と比較すると、結合エネルギー49, 50、 と51 よりも低かった−10.3 kcal/mol (表3）。 これということを示唆している49, 50、 と51 グレリン受容体のポケットにドッキングする可能性があります。GHRP-6よりもさらに優れています。 ために49、間に水素結合が観察される可能性があります。2 つのカルボニル基 (C-4 とp-クマロイル) および Arg283、C-5 ヒドロキシルおよび Gln120、C-7 ヒドロキシルとTyr313、およびC-40 それぞれヒドロキシルとCys304。 Arg199 が形成した従来のカルボニル基との水素結合p-クマロイル。 加えて、49 だったの Arg283、Arg102、Asp99、Phe279、Phe312、Leu181、および Pro200 残基に結合などのさまざまな効果を介してグレリン受容体に作用します。π-カチオン、π-アニオン、π–π T字型と、π-アルキル相互作用。 これらの許可された化合物49 タンパク質と安定な複合体を形成する（形3B). 50 Asp99、Arg102、Gln120、Arg283、Leu103、Asn305、およびと結合しました。Arg199 はさまざまな水素結合を介して、その他の相互作用 (π–カチオン、π-アニオン、π–π T字型と、π-アルキル) は、Asp99、Arg102、Arg283、Phe279、Phe312、Leu181 および Leu210 (図3C). 51 水素または炭素-水素結合も確立されるTyr313、Ser123、Arg283、Arg102、Asn305 と他の相互作用 (π-カチオン、π-アニオン、π-シグマ、π–π T字型と、π-アルキル) と結合し、Asp99、Arg283、Arg102、Leu181、グレリン受容体の Phe312 および Pro200 残基を検出できました (図3D)。 に比べ化合物45, 47、 と48 と49, 50、 と51、前者のグループはフラボノイドを持っていました。後者のグループは糖とクマロイル部分を持っていますが、骨格のみです。 と報告されました糖に結合したクマロイル基はグレリンへの結合親和性にとって重要でした受容体 [34]。 グレリンのアシル酸部分と相互作用するGHSRのギャップ構造その結果、グレリン受容体が活性構造に変換されました [43]. さらに、GHSR の結合ポケットは Glu124 間の塩橋によって分岐しています。および Arg283 であり、この領域には疎水性アミノ酸が豊富に含まれています [43]。 弊社によるとデータ、ドッキングスコア49, 50、 と51 のものよりも高かった45, 47、 と48、 どれのより優れた結合能力を示唆しました。 主な構造上の特徴は、糖部分ではなくクマロイル基が存在しており、これは次のことからさらに証明される可能性があります。クマロイル官能基を有するより多くの化合物の試験。 この研究では、有効成分49, 50、 と51 抗炎症生理活性だけでなく、グレリン受容体結合能。 これは、主張されているアンチエイジング効果が証明されたことを示しています。松葉茶もこれらの茶グレリン様化合物に基づいている可能性があります。

4. 結論

15 の未記載の化合物を含む合計 77 の分離株が精製されました。のメタノール抽出物から検証P.タイワネンシス針。 それらの構造は特徴づけられました分光学的および分光分析による。 43 の精製化合物が得られました。彼らのために検査された抗炎症剤 アクティビティによってスーパーオキシドアニオン生成の抑制と好中球モデルにおけるエラスターゼ放出。 結果は次のことを示唆しています45, 47, 48, 49, 50、 と51 大切なものを持っている抗炎症作用の可能性。 さらなる分子ドッキングサポートされる計算結果49, 50、 と51 活性物質に対して結合親和性を示すグレリン受容体のポケット。 したがって、粗抽出物および精製された成分は、P.タイワネンシス新しい抗炎症リード薬として開発される可能性がある、または食品成分。

補足資料:以下はオンラインで入手可能です、付録 A: 完全な抽出および分離手順、付録 B: 参考資料既知の化合物の表 S1: 針の予備生物活性スクリーニングP.タイワネンシススーパーオキシドについてfMLF/CBに応答したヒト好中球によるアニオン生成とエラスターゼ放出、表S2: 精製化合物のスーパーオキシドアニオン生成とエラスターゼに対する阻害効果fMLF/CB に応答したヒト好中球による放出、図 S1–S35: HRMS および NMR スペクトル新しい化合物

1–5. 著者の寄稿:概念化、P.-CK および JTCT。 方法論、P.-CK および T.-LH。調査、Y.-CL、AMK、M.-LY。 リソース、S.-YW; データキュレーション、Y.-CL および G.-HY。執筆 - 原案の準備、P.-CK および Y.-CL。 執筆 - レビューと編集、P.-CK すべて著者は原稿の出版版を読んで同意しました。

資金提供:この研究は台湾科学技術省 (MOST) の援助により行われました。 の研究は、教育省の高等教育スプラウトプロジェクトによって部分的に支援されました。国立成功大学 (NCKU) の大学進学本部。

治験審査委員会の声明:この研究は機関の承認を得て実施されました。長庚記念病院審査委員会（治験審査委員会番号 201800369A3）。インフォームド・コンセントの声明:声明はリクエストに応じて提供できます。

データの可用性に関する声明:ご要望に応じて、対応する著者からオリジナルデータを入手できます。

謝辞:著者らはまた、長庚記念病院 (CMRPD1B0281~3,CMRPF1D0442~3、CMRPF 1F0011~3、CMRPF1F0061~3、および BMRP450 が T.-LH に授与されました)。本研究の一部の財政的支援。 著者らは、NMR の使用に感謝の意を表します。国立成功大学の機器センターに属する機器。

利益相反:著者は利益相反がないことを宣言します。

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