チオアセトアミドによるラットの実験的に誘発された肝細胞癌における酸化ストレスおよびバーシカン/PDGF/PKCシグナル伝達経路の阻害を介したゲニステインの化学予防および肝保護効果
Mar 16, 2022
詳細については、plzにお問い合わせくださいtina.xiang@wecistanche.com
概要
目的：ゲニステインは、抗酸化作用、抗炎症作用、抗血管新生作用、および抗腫瘍作用を持つ大豆に存在する認識されたイソフラボンです。 この研究は、ゲニステインHCCのバーシカン/血小板由来成長因子（PDGF）軸の調節。
メソッド：HCCは、オスのSprague-Dawleyラットで実験的に誘発され、25または75 mg/kgのゲニステインで処理されました。 ゲニステインの抗酸化活性は、Nrf2の遺伝子発現と、マロンジアルデヒド（MDA）、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）、および還元型グルタチオンの肝臓レベルを測定することによって評価されました。 バーシカン、PDGF、プロテインキナーゼC（PKC）、およびERK -1タンパク質の発現は、ウエスタンブロッティングと免疫染色によって評価されました。
結果：HCCは、酸化ストレス、PDGF、バーシカン、PKC、およびERKタンパク質の発現レベルの上昇を誘発しました。 ゲニステインは、HCCによって誘発される酸化ストレスの増加を大幅に減少させました。 さらに、ゲニステインは、用量依存的に、HCCによって誘発されるPDGF、バーシカン、PKC、およびERKタンパク質の発現レベルの上昇を抑制しました。 さらに、ゲニステインは、特に高用量で、正常な肝細胞構造を維持し、線維性組織の沈着を減少させるのに役立ちました。
結論：ゲニステインは抗腫瘍を発揮し、酸化防止剤効果があり、したがって、PDGF /バーシカン双方向軸の阻害を介してHCCの発生を抑制し、ERK1とPKCの両方を下流の調節因子として抑制します。 したがって、ゲニステインは、HCC患者の転帰を改善するための潜在的な新規治療候補です。
キーワード：ERK; ゲニステイン; 肝細胞癌; Nrf2; 血小板由来成長因子; プロテインキナーゼC; バーシカン
序章
肝細胞癌（HCC）は、肝硬変患者の主な死因です。 HCCは5番目に多い肝疾患であり、予後不良を特徴とし、癌関連の死亡の2番目に多い原因です[1]。 HCCは、慢性C型肝炎またはB型肝炎ウイルス感染、高アルコール摂取、糖尿病など、さまざまな要因への曝露から生じる可能性があります[2]。 HCCは炎症性疾患であり、HCC患者の90％以上が慢性肝障害を発症しています[3,4]。 HCCの予後は、転移率が高く、疾患の再発率が高いために不良です[5]。 HCCの侵入の根底にある分子経路はとらえどころのないままであり、それは新しい治療法の発見を妨げます。 効果的な治療法がないため、何人かの患者がHCCに屈した。 したがって、HCCの結果を改善するためのより効果的な治療戦略を見つけることが重要です。
炎症性成長因子ファミリーのメンバーとしての血小板由来成長因子（PDGF）は、バーシカンの合成を調節する上で重要な役割を果たすことが以前に報告されています。 さらに、PDGFはバーシカンmRNA発現をアップレギュレートします。 PDGFの発現レベルはHCCのグレードおよび浸潤と強く相関しており、HCCの発症、進行、浸潤、および転移におけるPDGFの重要な役割を示しています[6]。 さらに、プロテインキナーゼC（PKC）の発現レベルはPDGFの発現レベルと強く相関しています。 したがって、PKC阻害剤は新規抗がん剤として使用できます[7]。 さらに、ERK / PDGFシグナル伝達経路は、HCCの発癌に寄与し、癌性疼痛治療の標的としての高リスク患者の検出に適した候補であると考えられています[8-10]。
ゲニステインは、血管新生阻害剤および植物エストロゲンとして機能する大豆イソフラボン製品です。 それは含む広範囲の重要な特性を示します抗炎症薬, 酸化防止剤、抗増殖作用、および抗血管新生作用。これらはすべて、ゲニステインの化学的予防の可能性をもたらします[11]。 さらに、ゲニステインは動物や人間のエストロゲン受容体に干渉し、アンドロゲン受容体に作用するだけでなく、エストロゲンと同様の効果を生み出すことが報告されています[13]。 ゲニステインはまた、ロタウイルス感染に対して抗ウイルス活性を示すことが確認されています[14]。
ゲニステインは、G2 / M停止とアポトーシスを誘発することにより、HCC細胞よりも健康な細胞への害が少ないと報告されています[15]。 しかし、私たちの知る限り、HCCにおけるゲニステインによるバーシカン/ PDGF/PKCシグナル伝達経路阻害の影響を調査したこれまでの研究はありません。 したがって、本研究の目的は、バーシカン/ PDGF / PKCおよびERKシグナル伝達経路に対するゲニステインの効果を調査することにより、HCCにおけるゲニステインの化学的予防および肝保護効果を評価することでした。 ラットにおけるHCCの誘発には、チオアセトアミドが使用された[3,4,16,17]。
材料および方法
動物実験。 合計で、50匹のオスの4週齢のSprague-Dawleyラット（体重、180-200 g）を本研究で使用しました。 実験プロトコルとすべての手順は、薬局、マンスーラ大学研究倫理委員会（エジプト、マンスーラ、承認番号2020-181）によって承認されました。 ラットを12時間の明期/12時間の暗期のサイクルで飼育した。ラットをランダムに5つのグループに分け、1グループあたり10匹の動物を飼育した。 研究の開始時に、動物をケージあたり5匹のラットとして飼育した。 5つのグループは次のとおりです：（i）コントロールグループ、ラットにPBS、10 mM、pH 7.4を腹腔内（ip）注射しました;（i）ゲニステイン処理コントロールグループ、ラットに75 mg / kgゲニステイン（Sigma-Aldrich; Merck KGaA）経口強制飼養により16週間毎日;（il）HCCグループ、ラットに200 mg / kgのチオアセトアミド（TAA; Tocris Bioscience）を投与し、週に2回16週間腹腔内注射;（iv）ゲニステインで治療したHCC、ラットに投与16週間毎日強制経口投与による25mg/kgゲニステイン; （v）ゲニステインで治療されたHCC、ラットは16週間毎日強制経口投与により75mg/kgのゲニステインを投与された。 初日から、ゲニステインで治療された両方のHCCグループの動物に、毎日の経口ゲニステイン治療とともに、200 mg / kgTAAipを週2回16週間注射しました。 ゲニステインの濃度と使用される投与方法は、ラットの癌を治療するための以前の研究で使用されたものに従って選択されました[18,19]。 さらに、癌治療における選択された用量の有効性を確実にするために予備研究が行われた。
サンプルコレクション血液サンプル（2 mlは、チオペンタールナトリウム（4 0 mg / kg、ip）で麻酔した各ラットの眼窩後神経叢から採取し、眼窩後神経叢に穿刺しました。ラットの血液は、 3000 rpmで5分間、その後血清を-80 Cで保存した後、肝機能分析を行いました。ラットの肝臓全体を新たに抽出し、通常の生理食塩水ですすぎ、2つの部分に解剖しました。1つの部分を10％緩衝液で固定しました。形態学的および組織病理学的調査のためのホルムアルデヒド。2つ目は、10-倍量の0.01 Mリン酸ナトリウム-カリウムバッファー、pH 7.4でホモジナイズし、生化学的分析のために-80Cで保存しました。
形態学的分析。 ホルマリン固定肝臓サンプルを5-μm切片に切断し、マッソンのトリクロームおよび過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色で染色しました。 セクションは匿名でコード化され、デジタルカメラ支援コンピュータシステム（NikonCorporation）を使用してマスクされた方法で検査されました。
免疫組織化学。 免疫組織化学的分析は、バーシカン、PDGF、PKC、およびERK -1（Abcam）のモノクローナル抗体と1：500希釈で4℃で一晩インキュベートした5-umパラフィン切片を使用して実施しました。 続いて切片をHRPに結合した二次抗体（Abcam）で処理しました。 次に、50 mM Tris-buffer、pH7.6中の2％DABを色原体として添加しました。 スライドをヘマトキシリンで対比染色し、デジタルカメラ支援コンピューターシステム（NikonCorporation）を使用してマスクされた方法で検査した[20]。
肝保護効果の評価。 アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST、アルカリホスファターゼ、γ-グルタミルトランスフェラーゼ（GGT）、およびアルブミン（BioDiagnostic Co.））の血清活性を分光光度法で定量化して、肝保護効果を評価しました。
抗酸化作用。 マロンジアルデヒド（MDA）、過酸化水素、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）、および還元型グルタチオン（GSH）の肝組織レベルは、BioDiagnosticCoから購入した市販のキットを使用して定量化されました。
EL / SA.a-フェトプロテイン（AFP）レベルは、市販のELISAキット（Wuhan USCN Business Co、Ltd.）を使用して分析しました。
定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）。 PCR分析は、私たちのグループによって以前に説明されたように実行されました[4]。 Nrf2の配列フォワードプライマー5'-GAGACGGCCATGACTGAT-3'およびリバースプライマー5'-GTGAGGGGATCGATGAGTAA-3'およびGAPDHの場合、フォワードプライマー5'-CCATCAACGACCCCTTCATT-3'およびリバースプライマー5'-CACGACATACTCAGCACCAGC-3'。
ウエスタンブロッティング。 肝臓サンプルにおけるPDGF、バーシカン、PKC、およびERKのタンパク質発現レベルは、以前に記載されたように決定された[21]。 簡単に説明すると、総タンパク質は、タンパク質アッセイ（Bio-Rad Laboratories、Inc.）を使用して定量化されました。 SDS-PAGEを使用して総タンパク質を分離し（20ug /レーン）、続いてニトロセルロースメンブレンに転写しました。 一次抗体（1：500）はSigma-Aldrich（Merck KGaA）から購入し、メンブレンと4℃で一晩インキュベートしました。 5％脱脂乳を含むPBST中、室温で1：2000 -アクチン（Sigma-Aldrich; Merck KGaA）で膜を再プローブしました。一次インキュベーション後、膜をHRP標識ヒツジ抗ウサギ二次抗体（ 1：5000）。 強化された化学発光を使用してタンパク質バンドを視覚化した。 これらのデータは、相対光学密度として表されます。
統計分析。 データは平均±SEMとして表されます。 コルモゴロフ-スミルノフ検定を使用して、標本分布の正規性を調べました。 カプランマイヤー法を使用して、ラットの生存を評価しました。 グループ間の差異を決定するために、一元配置分散分析とそれに続くボンフェローニ事後検定が使用されました。 統計分析は、SPSSバージョン20（IBM Corp.）を使用して実行されました。P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
結果
HCC誘発性に対する経口ゲニステイン治療の効果酸化ストレス。 HCCラットは、肝臓のMDAレベルと過酸化水素レベルのそれぞれ2.51倍と2倍の増加を示しました。 さらに、HCCラットは、対照群と比較して、肝臓のNrf2、GSH、およびSODレベルがそれぞれ57％、60％、および63％減少したことを示しました。 ただし、HCCラットをゲニステインで治療すると、HCCグループと比較して、MDAおよび過酸化水素レベルが用量依存的に減少し、GSH、SOD、およびNrf2レベルが用量依存的に増加しました（図1）。 これらの結果は、ゲニステインがHCCラットに抗酸化作用を及ぼす可能性があることを示しています。
HCC誘発死亡率およびAFP上昇に対するゲニステインの効果。 HCCラットの肝臓画像は、対照群と比較して結節の数が増加していることを示しました。 HCCラットをゲニスタインで治療すると、ラットの肝臓の結節数が用量依存的に減少します（図2）。さらに、HCCラットを25 mg / kgのゲニスタインで治療すると、ラットの生存率が30％から増加しました。 HCCグループを50パーセントにします。 さらに、75 mg / kgのゲニステインで治療されたHCCラットは、90％の生存率の増加を示しました。 実験の終わりに、対照ラットおよびゲニステイン75mg /kgで処置された対照ラットは100パーセントの生存を示した。 ラットの生存率は、対照群と比較してAFP血清レベルの有意な低下とも関連していました（図3）。 したがって、これらの結果は、ゲニステインが死亡率とAFP血清レベルを低下させることによってHCCに対する治療効果を生み出す可能性があることを示しています。
肝機能検査に対するゲニステインの効果。 図4に示すように、対照群と比較して、ALT、AST、アルカリホスファターゼ、およびGGTの血清レベルはHCC群で有意に上昇しましたが、血清アルブミンレベルは有意に低下しました。 HCCラットをゲニステインで治療すると、特に75 mg / kgのゲニステインで治療したグループでは、HCCグループと比較して、ALT、AST、アルカリホスファターゼ、GGTの血清レベルが大幅に低下し、血清アルブミンレベルが上昇しました。 これらの結果は、HCCラットに対するゲニステイン産生肝保護効果を示唆した。
HCC誘発形態変化に対するゲニステインの効果。 マッソントリクロームで染色された対照群からのラット肝臓サンプルの検査は、線維症がないことを明らかにした。 ただし、HCCグループの肝臓組織でキャプチャされた画像は、コントロールグループと比較して高度に染色された線維性中隔を示しました。 HCCラットをゲニステインで治療すると、特に75 mg / kgのゲニステインで治療した後、線維組織の沈着が減少しました（図5）。 さらに、図6に示すように、PASで染色されたサンプルは、コントロールグループで正常な外観を示しました。 PAS染色は、対照群と比較してHCC群で減少し、ゲニステインで治療されたHCCラットで有意に増加しました。 したがって、これらの結果は、ゲニステインが肝細胞構造を改善する可能性があることを示唆しました。
肝組織におけるHCC誘発性PDGFタンパク質発現レベル上昇に対するゲニステインの効果。 HCCラットは、対照群と比較してPDGFタンパク質発現レベルの有意な上昇を明らかにしました。 しかし、ゲニステインの経口投与は、用量依存的にPDGFタンパク質発現レベルの有意な減少をもたらしました。 さらに、HCC群の肝切片は、対照群と比較して、抗PDGF抗体で染色された領域の有意な増加を示しました。 しかし、高用量のゲニステインによるHCCラットの治療は、HCCと比較して陽性に染色された領域を有意に減少させ、正常な対照群で見られたものと同様のレベルになりました（図7）。 したがって、ゲニステインは、対照群に影響を与えることなく、PDGFのHCC誘発性発現をブロックしました。
HCCによって誘発されるバーシカンタンパク質の発現レベルに対するゲニステインの効果が増加します。 TAA注射は、対照群と比較してバーシカンタンパク質発現レベルの有意な上昇をもたらしました。 しかし、HCCラットをゲニステインで治療すると、用量依存的にバーシカンタンパク質の発現レベルが低下しました。 さらに、HCCグループの肝切片は、抗バーシカン抗体で染色された領域で有意な増加を示しました。 しかし、ゲニステインによる治療は、高用量のゲニステインで治療されたラットにおいて、陽性に染色された領域を正常な対照群と同様のレベルに有意に減少させました（図8）。
HCC誘発性PKCタンパク質発現レベルに対するゲニステインの効果が増加します。 HCCラットは、対照群と比較してPKCタンパク質発現レベルの有意な増加を示しました。 抗PKC抗体で染色された肝切片は、対照群と比較してHCC群で染色領域の増加を明らかにした。 ただし、HCCグループをゲニステインで治療すると、PKCタンパク質の発現レベルが用量依存的に低下しました。 75mg / kgのゲニステインで治療されたグループのPKCタンパク質発現レベルは、コントロールグループのそれと同様でした（図9）。
HCC誘発性ERK-1タンパク質発現レベルに対するゲニステインの効果が増加します。 HCCグループは、コントロールグループと比較してERK-1タンパク質発現レベルの有意な上昇を示しました。 さらに、HCCラットの肝切片は、対照群と比較して、抗ERK-1抗体で染色された領域の増加を示しました。 ただし、HCCグループをゲニステインで治療すると、ERK-1タンパク質の発現レベルが用量依存的に低下しました。 75 mg /kgのゲニステインで治療したグループのERK-1タンパク質の発現レベルは、コントロールグループのレベルと同様でした（図10）。
討論
HCCは原発性肝悪性腫瘍であると考えられており、世界中で癌関連の死亡率の主要な原因となっています[22]。 HCCは放射線療法および外科的切除切除療法に対して非常に耐性があります[23]。 肝臓の微小環境は、細胞外マトリックス（ECM）、免疫細胞、Kupffer細胞、内皮細胞、線維芽細胞、サイトカイン、およびさまざまな成長因子を含むいくつかのコンポーネントで構成されています。 de novo HCC腫瘍[24]。発癌性組織微小環境では、プロテオグリカンの発現が大幅に変化するため、プロテオグリカンはHCCの魅力的な治療標的と見なすことができます[6]。本研究では、HCCはバーシカンタンパク質の発現レベルを大幅に増加させました。これは、腫瘍細胞の生存、血管新生、および転移の変化につながり、腫瘍の進行を促進する可能性があります[25]。 腫瘍微小環境のプロテオグリカンの1つであるバーシカンを標的とすることは、癌に対する新しい治療アプローチを提供する可能性があります。 この研究の目的は、インビボでのHCC病原性に対するPDGF調節バーシカン発現の遮断の効果を調査することでした。
過去10年間で、天然資源から得られる潜在的な癌化学予防剤への関心が高まっています[20]。 大豆イソフラボンとしてのゲニステインは、癌を含む変性疾患に対する潜在的な有益な効果のために注目を集めています。 ある研究によると、ゲニステインは多くの重要な分子標的を標的にすることができます。 これらの研究はまた、ゲニステインがアポトーシス促進性、細胞周期停止、抗血管新生、抗転移性、抗増殖性、および抗炎症性の特性を持っていることを示しています[11]。 しかし、ゲニステインはinvitroでの肝臓がん抑制剤であると考えられています[26]。 最近、ゲニステインの化学防御効果は、AMP活性化プロテインキナーゼが関与するメカニズムを介したそのアポトーシス促進および抗炎症効果に起因する可能性があることが実証されました[27]。 腫瘍形成、増殖、浸潤、移動、および転移に関連する経路、したがって、それらは、癌治療のための新薬を特定するための集中的な研究の対象となっている[37]。
私たちの知る限りでは、本研究は、invivoでのHCCにおけるゲニステインの新規で有望な化学予防メカニズムを明らかにした最初の研究です。 本研究の結果は、受容体チロサインキナーゼの遮断薬としてのゲニステインが腫瘍細胞に影響を与えるだけでなく、腫瘍微小環境のCAFにも影響を与えることを示唆した。 ゲニステインはPDGFの放出を弱めることが実証されており、これによりバーシカンタンパク質の発現レベルがダウンレギュレーションされ、CAFからのPDGFの放出が減少した可能性があります。 したがって、PDGF /バーシカンの正のフィードバックループは、HCCの発生、浸潤、血管新生に対抗し、腫瘍治療抵抗性を克服するための有望な標的と見なすことができます。
Ras / Raf / MEK/ERKシグナル伝達ネットワークがHCCの進行に重要な役割を果たすことも報告されています[38]。 私たちの知る限り、本研究は、ゲニステイン投与が、MAPKシグナル伝達経路の構成要素としてのERK1の用量依存的なダウンレギュレーション、およびPKCタンパク質発現レベル、ならびにPDGFの有意な減少を達成したことを初めて示しました。 HCCグループと比較したバーシカンタンパク質の発現レベル。 以前の研究では、上流の成長因子としてのEGF、PDGF、およびVEGFの過剰発現が、RTKと組み合わされて、HCCのRas / Raf / MEK/ERKシグナル伝達ネットワークを活性化することが示されています。 さらに、ERKの活性化はEGFRリガンドの発現も促進し、腫瘍の成長に重要なオートクリン成長ループを促進することが明らかになっています[39]。 以前の研究でも、バーシカンにはEGF様モチーフがあることが判明しました[35]。 したがって、PDGFとバーシカンの両方がMAPKシグナル伝達経路の下流調節因子としてERK1とPKCを活性化する可能性があると仮定することができます。 これらのシグナル伝達経路は、増殖、分化、細胞移動、細胞生存などの多くの細胞イベントを誘発するため、癌の進行に関係しています。
PKCアイソザイムは、増殖、遊走、浸潤、腫瘍形成、および転移に関連する複数のシグナル伝達経路の交差点に位置するため、癌の新しい治療法を特定するための集中的な研究の対象となっています[40]。 たとえば、PKCアイソザイムはRas / Raf / MEK / ERKシグナル伝達経路を刺激し、癌細胞の生存と増殖に重要な役割を果たします[41]。
腫瘍細胞のPDGF受容体を介したシグナル伝達は、厳密に制御および制御されています。 特定の研究は、腫瘍細胞におけるPDGF下流シグナル伝達経路の増幅につながる2つの主要なメカニズムがあることを示唆しています。 まず、PDGFで刺激された細胞は、活性酸素種（ROS）を生成します。これは、チロシンホスファターゼの活性部位のシステイン残基と反応して阻害を引き起こします。 第二に、ユビキチン化プロセスの結果としてのMAPキナーゼホスファターゼ3の分解は、ERKの脱リン酸化と不活性化の原因であり、腫瘍の増殖と進行の増加をもたらします[33]。 これらの結果はまた、HCCグループが肝臓のMDAレベルの有意な増加を伴うPDGFタンパク質発現レベルの有意なアップレギュレーションを示したことを示した本研究のデータを支持します。 さらに、ウエスタンブロッティングデータは、ERK1タンパク質発現レベルの有意なアップレギュレーションを示しました。
PDGFを介した増加およびPDGF治療に関与するシグナル伝達経路は、バーシカンコアタンパク質合成の増加をもたらしました。 バーシカンmRNAに対するPDGFの効果は、PKCまたはERKシグナル伝達経路のいずれかの阻害によってブロックされます。 しかし、PDGFの効果はPKC阻害によってブロックできますが、ERK阻害によってはブロックできません[42]。 バーシカンmRNAコアタンパク質の発現にはPKCとERKの両方の活性化が必要です。 以前の研究では、さまざまなシグナル伝達経路がPDGF刺激によるバーシカン生合成のさまざまな側面を制御していることが示されています[43]。
酸化ストレスの間、ROSは絶えず生成され、すべての体細胞に有害な影響を及ぼします。 酸化ストレスは慢性肝疾患の進行と肝発癌に重要な役割を果たすことが報告されています[44]。 本研究は、経口ゲニステイン投与が、肝臓のNrf2、GSH、およびSODレベルの有意な増加と、MDAレベルの著しい抑制を反映して、用量依存的な抗酸化活性をもたらすことを示しました。 ジェニスタインは、カタラーゼやスーパーオキシドジスムターゼなどの抗酸化酵素の発現を誘導することにより、invitroで前立腺癌細胞に抗酸化活性をもたらすことが報告されています。
本研究はまた、ゲニステインが、特に75 mg / kgの用量で、血清GPT、アルカリホスファターゼ、およびアルブミンのレベルを正常な対照群で見られるレベルに回復させたことを示しました。 さらに、ゲニステイン治療群の肝臓サンプルは、HCC群と比較して線維組織とコラーゲン沈着の減少を示しました。 ゲニステインは、非アルコール性脂肪性肝疾患において肝保護効果を発揮することが実証されています[46]。 さらに、本研究では、ゲニステインはAFPレベルを著しく低下させ、したがって、ラットの生存率を最大90パーセントまで有意に増加させることが実証されました。
結論として、ゲニステインは抗腫瘍活性を示しましたが、これはその抗酸化活性だけでなく、バーシカン、PDGF、PKC、およびERK発現の阻害にも起因する可能性があります。 ゲニステインはまた、潜在的な治療候補となり、HCC患者の転帰を改善する可能性があります。
参考文献
[1] Foglia B、Parola M. FACT複合体および酸化ストレス応答：肝細胞癌の進行を維持するKEAP1 /NRF2-依存性の新規メカニズム。 腸。 2020; 69（2）：195–196。
[2] McGlynn KA、Petrick JL、El-SeragHB。 肝細胞癌の疫学。 肝臓学。 2020; 73（補足1）：4–13。
[3] El-Far YM、Khodir AE、Noor AO、他。 invivoおよびinvitroでの酸化ストレスおよびアポトーシスへの影響を介した肝細胞癌に対するアスコルビン酸ナトリウムの選択的細胞毒性活性および保護効果。 RedoxRep。2020;25（1）：17–25。
[4] El-Far YM、Khodir AE、Emarah ZA、他。 フコイダンはラットに誘発された肝細胞癌を改善します：miR143と炎症への影響。 NutrCancer。 2020; 28：1–13。
[5] Flynn MJ、Sayed AA、Sharma R、他。 肝細胞癌に対する免疫チェックポイント阻害剤の臨床開発における課題と機会。 肝臓学。 2019; 69（5）：2258–2270。
[6]田中Y、立石R、小池K.プロテオグリカンは、肝細胞癌の魅力的なバイオマーカーおよび治療標的です。 Int JMolSci。 2018; 19（10）：3070。
[7] Goekjian PG、JirousekMR。 新規抗がん剤としてのプロテインキナーゼC阻害剤。 専門家の意見調査薬。 2001; 10（12）：2117–2140。
[8] Schmitz KJ、Wohlschlaeger J、Lang H、他。 ERKおよびAKTシグナル伝達経路の活性化は、肝細胞癌の予後不良を予測し、癌組織のERK活性化は、C型肝炎ウイルス感染に関連しています。 Jヘパトール。 2008; 48（1）：83–90。 土井：10。 1016/j.jhep.2007.08.018。
[9] Kim ST、Hong JY、Park SH、他。 難治性固形腫瘍患者を対象とした抗肝細胞増殖因子抗体（YYB101）のヒト初の第I相試験。 Ther AdvMedOncol。 2020; 12：1758835920926796。 doi：10.1177/1758835920926796。
[10] Wu XP、Yang YP、She RX、他。 microRNA -329は、マウスのLPAR1-依存性LPAR1/ERKシグナル伝達経路を介して骨がんの痛みを軽減します。 Ther AdvMedOncol。 2019; 11：1758835919875319。
