CistancheDeserticola多糖類には神経保護効果があります
Mar 19, 2022
詳細情報：Ali.ma@wecistanche.com
Yue Liu、et al
概要：
虚血性脳卒中は、罹患率と死亡率が高い疾患です。Cistancheニクジュヨウ多糖類（CDP）は、肝保護や免疫恒常性など、さまざまな有益な効果をもたらします。 私たちが知る限り、CDPの保護効果(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）酸素-グルコース欠乏/再灌流（OGD / RP）によって損傷したニューロンの研究は行われていません。 この研究では、OGD/RPがPC12細胞モデルを損傷しました。 簡単に言えば、CDP(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）（{{0}}。05、0.5、および5 ug / ml）を再灌流前に投与しました。 CDPの保護効果(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）次に、細胞生存率、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）漏出、[Ca2 plus] I、ミトコンドリア膜電位（MMP）および細胞アポトーシスに基づいて評価し、再灌流後のレドックス状態を活性酸素種（ROS）、カタラーゼ（ CAT）、グルタチオンペルオキシダーゼ（GSH-Px）および総抗酸化能。 パーキンソン病関連タンパク質DJ-1が内因性抗酸化に関与し、神経保護虚血脳卒中後の影響、CDP間の相互作用を調査しました(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）とDJ{{0}}。 DJ -1の発現はELISAとウエスタンブロット分析によって検出され、DJ-1の転座は蛍光抗体法によって評価されました。 結果は、CDP（0。05、0.5、および5 ug / ml）がPC12細胞死を弱め、MMPおよびカルシウム恒常性を維持することを示しました。 酸化ストレスを抑制し、細胞アポトーシスを減少させました。 さらに、CDP（5 ug / ml）は、DJ-1の分泌と発現を著しく刺激しました。 全体として、結果はCDPが(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）を発揮します神経保護酸化ストレスを抑制し、DJ -1経路を調節することにより、OGD/RPによって誘発される損傷に対する効果
キーワード：ニクジュヨウ、多糖類、神経保護、酸素グルコース欠乏/再灌流、酸化ストレスDJ -1
1.はじめに
虚血性脳卒中は、世界で2番目に多い死亡原因であり、長期的な障害の主な原因です[1]。 脳卒中による死亡は2030年に780万人に増加すると予想されています[2]。 中国では、100人あたり58〜142人、000人が毎年脳卒中で亡くなっています。 したがって、虚血再灌流傷害を逆転させる効果的な戦略を開発する必要があります。 広範な証拠は、酸化ストレスが再灌流中の脳梗塞の発症と進行を促進する主要な要因であることを裏付けています[3,4]。 したがって、効果的な発見神経保護ROSを低減し、酸化ストレスを抑制することができる薬剤は、研究にかなりの関心を集めています。 パーキンソン病関連タンパク質DJ-1は、抗アポトーシスおよび抗酸化遺伝子発現を刺激することによって神経保護を仲介します[4,5]。 DJ -1は、酸化ストレスとマイトジェン刺激によってミトコンドリアに移行し、乳がん、黒色腫、OGD/RP損傷などの病的状態で細胞外マトリックスに分泌される可能性があります[6]。 さらに、DJ -1は、抗酸化における重要な役割のため、虚血性神経変性の治療標的化に有用です[4,7]。 過去10年間で、いくつかのグループがDJ-1が神経保護invivo焦点脳虚血モデルおよびinvitroOGD/ RPモデルへの影響[6–9]。一方、シクロスポリンAやフェニル酪酸ナトリウムなどの一部の薬剤は、DJ-1アップレギュレーション虚血性脳卒中を介して神経細胞死を抑制します[9,10 ]。
Cistancheニクジュヨウ、の統合乾燥植物CistancheニクジュヨウYCMaとCistanchetubulosaWightは、主に中国北部と北西部の砂漠地帯で生産されています[11]。 C.deserticolaは食用であり、「砂漠の高麗人参」として名誉を与えられています。 アクアポイント処方では、慢性腎疾患、性的インポテンス、女性不妊症、白帯下、不正出血、老人性便秘の治療として使用される炎[12].C。 ニクジュヨウから分離された主要な有効成分であるニクジュヨウ多糖類Cistanche ニクジュヨウ。 CDPは、免疫機能と脂質バランスを調節し、老化、酸化、肝臓障害からの保護を提供します。さらに、CDP(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）心臓と肝臓の虚血再灌流傷害を防ぎます[13,14]。 最近の研究では、CDPが(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）無毒であり[12,15,16]、エキナコシド、イソアクテオシド、アクテオシド、サリドロシドなど、C.Deserticolaから抽出された他の植物化学物質が展示されています神経保護効果[11,12]。 ただし、虚血性脳卒中損傷の改善のためのCDPの潜在的な使用は報告されていません。
本研究では、CDPが(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）神経保護のための酸化ストレスを抑制します。 CDPの潜在的な保護効果(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）虚血性脳卒中の損傷は、OGD/RPで損傷したPC12細胞を使用して調べました。 次に、DJ-1に関連する基本的な相互作用を調査しました。
2.方法
2.1。 細胞培養とOGD/RPモデル
PC12細胞は、5％CO2を含む正常酸素インキュベーター内で37度で10％FBSを含むRPMI1640培地で培養されました。 培地は48時間ごとに交換されました。 OGD/RPモデルを作成しました。 PC12セルを洗浄し、アールの平衡塩類溶液にさらしました。 次に、細胞を5％CO2と95％N2を含む嫌気性チャンバーに37度で4時間移し、再酸素化を行いました。このステップでは、同量の培地を細胞に添加しました。 再酸素化後、細胞を正常酸素インキュベーターに24時間置いた。
2.2。 薬物投与
CDP(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）Yuanye Biological Technology Co.、Shanghai、Chinaから購入しました（C23J7Y18405、純度> 98％）。 虚血性脳卒中の第一選択予防薬であるニモジピンは、陽性対照化合物として使用されました[17–19]。 ニモジピン注射はバイエル社からのものでした。細胞はランダムに6つのグループ、すなわち、コントロール、車両（OGD / RP）、ニモ（5 ug / ml）、CDPに分けられました。(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）（0 .05 ug / ml）、CDP(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）（0 .5 ug / ml）およびCDP（5 ug / ml）。 ニモジピンとCDP(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）再灌流前に追加されました。 対照群は通常の培地で培養され、正常酸素条件下で培養された。
2.3。 細胞生存率：MTTおよびNRUアッセイ
PC12細胞（ウェルあたり6×103）を96-ウェル培養プレートに播種しました。各グループの要件に従って細胞を処理しました。 MTT（Solarbio、中国）を5 mg / mlの濃度で細胞に添加し、37度で4時間インキュベートしました。 ホルマザンは、生細胞におけるコハク酸デヒドロゲナーゼの還元産物です[20]。 生成された青いホルマザンの溶解のためにDMSOが追加されました。 細胞を25度で10分間振とうした後、マイクロプレートリーダー（Thermo、USA）で490nmの波長での吸光度を検出しました。 細胞生存率の結果は、対照群のパーセンテージとして表されました[21]。
ニュートラルレッド取り込み（NRU）アッセイは、以前に公開されたプロトコル[22]に従って実行されました。 再灌流期間が終了したら、ニュートラルレッド（Solarbio、中国）を5 0 ug/mlの濃度で細胞に添加しました。 混合物を3時間インキュベートした。 次に、細胞を、０．５パーセントのホルムアルデヒドおよび１パーセントの塩化カルシウムを含む溶液で急速に洗い流した。 続いて、細胞を、１パーセントのエチル酸および５０パーセントの無水エタノールを含む混合物に加えた。 細胞を37度で20分間振とうした後、プレートを540nmの吸光度で読み取った。 細胞生存率の結果は、対照群のパーセンテージとして表されました。
ニクジュヨウ多糖類持っている神経保護効果
2.4。 細胞毒性の評価
LDHは、乳酸トピルビン酸の酸化を触媒する細胞質酵素です。 細胞膜が損傷すると、LDHは細胞外液に急速に放出されます。 したがって、LDH検出は通常、細胞毒性評価のために実行されます。 [23]。 実験手順は、LDHアッセイキット（Jiancheng、中国）によって提供された市販のキットの指示に従った。 各サンプルの吸光度は、マイクロプレートリーダーを使用して440nmで検出されました。 細胞死のパーセントは、次の式を使用して計算されました：生存率（パーセント）=（OD処理-OD処理ブランク）/（OD最大LDH活性-OD最大LDH活性ブランク）×100パーセント。
2.5。 細胞内Ca2プラス濃度の検出
Ca2plusの細胞内濃度はFluo-3/AM[15]で測定されました。 PC12細胞をPBSで3回洗浄し、2μMFluo-3 / AM（Beyotime、China）とともに、暗所で37度で30分間インキュベートしました。 次に、細胞外色素を除去するために、細胞をPBSで3回洗浄した。 Fluo -3 / AMの蛍光強度は、レーザー走査型共焦点顕微鏡（オリンパス、日本）で測定しました。 ソフトウェアパッケージOlympusFV10- ASW 4.1 ViewerとImageJは、グレースケール値の計算に使用されました
2.6。 MMPの測定
JC -1（5,5'、6,6'-テトラクロロ-1、1'、3,3'-テトラエチル-イミダカルボシアニン; Beyotime、中国）は、染色に一般的に使用される便利な電圧感受性プローブです。細胞とMMPの評価[24]。 PC12細胞を冷PBSで2回洗浄した後、50％培地と50％作動液を含む混合物と暗所で37度で15分間インキュベートした後、混合物を廃棄し、新しい培地と交換しました。 赤と緑の蛍光画像は、レーザー走査型共焦点顕微鏡で撮影されました。 MMP測定には、赤と緑の蛍光シグナルの相対的な比率を使用しました[25]。 ソフトウェアpackageOlympusFV10- ASW 4.1 ViewerとImageJを使用して、グレースケール値を計算しました。
2.7。 アポトーシス検出アッセイ、Hoechest33342、およびフローサイトメトリー分析
DNA結合色素であるHoechst33342は、細胞アポトーシスの検査に使用されました[26]。 再灌流後、PC12細胞をPBSで3回洗浄し、Hoechst33342（Beyotime、China）と5 ug / mlの濃度で、暗所で37度で15分間インキュベートしました。 次に、細胞をレーザー走査型共焦点顕微鏡で観察した。 アポトーシス細胞は、強い青色の蛍光と核の凝縮を示した。 各染色実験では、3つの確率場がキャプチャされて定量化されました。 オリンパスFV10-ASW 4.1ビューアとImageJは、グレースケール値の計算に使用されました。 アポトーシス細胞のパーセンテージは、次の式で計算されました：アポトーシス量/総量×100パーセント[27]。
2.8。 ROS生成の測定
蛍光プローブ2'、7'-ジクロロフルオレセイン-ジアセテート（DCFH-DA; Jiancheng、中国）は細胞膜に浸透し、非蛍光DCFHに加水分解することができます。 DCFHは細胞内ROSによって酸化されて蛍光DCFになります[29]。 再灌流後、細胞をPBSで2回洗浄し、次に最終濃度10μMのDCFH-DAとともに暗所で37度で45分間インキュベートした。 蛍光は、励起波長485 nm、発光波長535nmの蛍光分光光度計で観察しました。
ニクジュヨウ多糖類持っている神経保護効果
2.9。 酸化ストレス指標の決定：CAT、GSH-Px、およびT-AOCレベル
細胞をこすり取り、PBSに再懸濁した。 得られた細胞懸濁液を氷上で45回超音波処理し、1000r/minで10分間4度で遠心分離しました。 上澄みは保持され、検出に使用された[24]。 細胞上清の総タンパク質含有量は、BCAタンパク質アッセイ試薬キット（KeyGEN、中国）を使用して測定しました。 CAT、GSH-Px、およびT-AOCレベルの活性は、製造元の指示（Jiancheng、中国）に従って測定されました。 各サンプルの吸光度をマイクロプレートリーダーで検出しました。
2.10。 細胞外DJ-1濃度の測定
PC12細胞（ウェルあたり6×103）を96-ウェル培養プレートに播種しました。再灌流後、細胞上清を収集し、DJ -1 / PARK -7 ELISA Kit（Raybio、USA）で分析しました。 ）製造元の指示[9]に従ってください。 各サンプルの吸光度は、450nmまたは540nmの二重波長でマイクロプレートリーダーを使用して検出されました。
2.11。 ウエスタンブロット分析
細胞タンパク質は、メーカーの指示（KeyGEN、中国）に従って氷冷溶解緩衝液で抽出されました。 タンパク質濃度は、BCAタンパク質アッセイ試薬キットを使用して決定しました。 各グループからの等量のタンパク質溶解物（20 ug）を、12％ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、続いてニトロセルロースメンブレンに転写しました。 メンブレンを5％スキムミルクを含むPBSと室温で2時間インキュベートした後、抗PARK7 / DJ -1抗体（ab76008、Abcam、希釈率1：1000）で4度で一晩プローブしました。 次に、メンブレンをPBSTで3回洗浄し、二次抗体ヤギ抗ウサギIgG（SA 00001-2、Proteintech Group;希釈率1：5000）と室温で2時間インキュベートしました。 抗体抗- -チューブリン（10759-1- AP、Proteintech Group;希釈率1：1000）をコントロールと見なしました。 タンパク質バンドは、強化された化学発光（ECL）反応試薬によって視覚化されました。 バンド密度は、QuantityOneAnalysisソフトウェアv.4.6.9を使用して測定しました。
2.12。 免疫細胞化学分析
PC12細胞は、再灌流処理後、室温で15分間4％パラホルムアルデヒドで固定されました[9]。 過剰なパラホルムアルデヒドを除去した後、細胞を0。3パーセントのTritonX-100を含むPBSで室温で10分間インキュベートしました。 次に、細胞をPBSで3回洗浄した後、5％正常ヤギ血清と1時間インキュベートしました。 次に、ミトコンドリアを染色するために、細胞をウサギマウスモノクローナル抗ATPシンターゼ鎖（MABS1304、EMD Millipore、希釈率1：200）とインキュベートし、続いて抗PARK7 / DJ -1抗体とインキュベートしました（希釈率1： 100）プロテインDJ-1のプロービング用。 細胞を洗浄し、ヤギ抗ウサギIgG-Alexa 488（緑; A11034、Invitrogen;希釈率1：1000）およびヤギ抗マウスIgG-Alexa 594（赤; A11032; Invitrogen;希釈率1：1000）と90分間インキュベートしました。分。 最後に、細胞をPBSで3回洗浄し、DAPIを含む封入剤でスライドガラスに封入しました。 免疫蛍光画像は、レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して視覚化されました。
ニクジュヨウ多糖類持っている神経保護効果
2.13。 データ/統計分析
すべての値は平均±SDとして示されました。 有意性は、一元配置分散分析（ANOVA）と、それに続くダネットの多重比較検定によって決定されました。 p<。05は統計的有意性と見なされました。>
3.結果
3.1。 CDP(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）OGD/RPによる細胞損傷の抑制
OGD / RPに曝露されたPC12細胞は、数の有意な減少を示しました。 細胞の形が変わり、細胞膜が壊れた。 MTTアッセイでは、CDPの細胞生存率(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）グループ（{{0}}。05、0.5および5 ug / ml）は、それぞれ58.91パーセント±5.40パーセント、61.13パーセント±3.81パーセント、および68.57パーセント±3.24パーセントであり、p <.05（図1a） 、および車両の場合は51.68パーセント±3.89パーセントでした。="">(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）OGD / RP損傷から細胞を保護し、細胞死を減少させました。 さらに、Nimoグループの細胞生存率は77.02パーセント±5.22パーセントであり、これは5 ug /mlCDPの細胞生存率とほぼ同じです。(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）扱われたグループ。
NRUアッセイでは、CDPの細胞生存率(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）グループ（{{0}}。05、0.5、および5 ug / ml）は、それぞれ52.03パーセント±4.72パーセント、58.49パーセント±2.50パーセント、および69.17パーセント±3.91パーセントでした（図1B）。車両で47.14パーセント±2.88パーセントでした。 値は、CDPの濃度依存性の保護効果を示しています。
車両（44.73パーセント±3.30パーセント）とは対照的に、LDH放出はCDPで大幅に減少しました(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）グループ。 CDPで(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）グループ（{{0}}。05、0.5および5 ug / ml）、LDHリーク率はそれぞれ32.41パーセント±3.70パーセント、27.13±2.79パーセントおよび23.13パーセント±4.59パーセント、p <.01（図。1c）。 さらに、nimoグループのldhリーク率は21.99パーセント±4.02パーセントであり、これは5="" ug="">
3.2。 CDP(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）[Ca2plus]iのOGD/RPによる増加の減衰
PC12細胞の細胞内Ca2プラスレベルは、対照群（373.62±75.69）とは対照的に、OGD/RP損傷後に4146.60±195.97に増強されました。 CDP(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）グループ（{{0}}。05、0.5および5ug / ml）は、用量依存的に細胞内Ca2プラスレベルをそれぞれ2921.25±222.19、2015.85±230.53および1768.43±426.12に減少させる可能性があります（図2AおよびC ）。 さらに、5 ug / ml CDP治療群のCa2プラスレベルは、Nimo群のレベル（1591.19±213.21）に匹敵するレベルまで減少しました。
3.3。 CDP(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）減衰したOGD/RPによるMMPの散逸
対照群（1.67±0 .89）と比較して、ビヒクル群（0。48±0。1 0）は赤色FLよりも緑色FL蛍光を示しました。蛍光（図2BおよびD）。 赤と緑のFL蛍光の比率は、0.5および5 ug /mlCDPで1.11±0。26および1.18±0。16に減少しました。(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）それぞれ処理されたグループ、p<.01。>
3.4。 CDP(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）OGD/RP誘導細胞アポトーシスの防止
凝縮したクロマチンまたは断片化した核を示す細胞は、アポトーシス細胞として記録されました[30]。 Hoechst33342アッセイの結果は、OGD / RP後の凝縮した核の出現を明らかにしました（図3AおよびC）。 ビヒクル群の核において高いFL蛍光強度が観察された。 核のFL蛍光強度は5ug/mlCDPで弱まりました(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）扱われたグループ。 我々は、FITC-アネキシンV / PI二重染色を使用した仲間のサイトメトリーによってPC12細胞のアポトーシス率を分析しました（図3BおよびD）。 対照群の細胞アポトーシス率は4.16％±0。24％でしたが、車両群の細胞アポトーシス率は22.98％±0。66％でした。 5 ug / ml CDP治療群では、細胞アポトーシス率は7。86パーセント±1.16パーセントでした。
3.5。 CDP(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）OGD / RPによって誘発される細胞内ROS蓄積の減衰と、酸化還元状態の維持
CDPの効果(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）酸化ストレスに関する研究は、ROS生成、GSH-Px、CAT活性、およびT-AOCレベルに基づいて実証されました。 OGD / RP損傷PC12細胞のROSレベルは増加し、対照群よりも有意に高くなりました（p <.01）。>(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）グループ（{{0}}。05、0.5および5 ug / ml）は、用量依存的に減少しました（p <.01;図4a）。 さらに、cdpは、ビヒクルと比較して、t-aoc（p=""><.05;図4b）、cat（p><.05;図4c）、およびgsh-px（p><.05;図4d）レベルも大幅に増加させました。グループ。>(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）グループが増えました。
3.6。 CDP(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）DJ -1の分泌を刺激し、DJ-1の発現を増強しました
細胞上清中のDJ-1濃度の変化が検出され、DJ-1とCDPの関係の可能性が明らかになりました(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）。 DJ -1の放出は、OGD / RPで損傷したPC12細胞から観察されました（図5）。 DJ-1は5ug/mlCDPでかなりアップレギュレーションされました(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）治療群（38.66±8.44 pg / ml）であり、ビヒクル群（18.33±3.80 pg / ml、p <.01）および対照群（9.67±3.96 pg / ml、p <.01）よりも有意に増加しました。 。
CDPの影響を調査するには(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）DJ -1の細胞内発現について、ウエスタンブロッティングによりDJ-1タンパク質レベルを測定しました。 DJ -1タンパク質発現レベルは、再灌流の24時間後に有意に増加しました。 対照的に、5 ug / ml CDP後処理は、ビヒクルグループと比較してDJ -1の過剰発現を有意に増強しました（p <>
3.7。 CDP(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）ミトコンドリアへの強化されたDJ-1転座
PC12細胞は、抗PARK7 / DJ -1および抗ATP合成酵素鎖抗体で染色されました（図7および8）。 抗ATP合成酵素鎖抗体はミトコンドリア複合体Iと結合し、結合抗原はミトコンドリア内膜に局在していました。 結果は、DJ-1がOGD/RP傷害に続いてミトコンドリア内膜に移動したことを明らかにしました（図8）。 一方、DJ -1とミトコンドリアの二重染色の結果は、CDPが(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）DJ - 1ミトコンドリア転座と共局在化を促進しました（図8）。 これらの結果は、DJ-1と神経保護CDPの効果(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）（図9）。
4。議論
この研究では、CDPを直接報告しました(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）DJ -1タンパク質のアップレギュレーションを介して、OGD/RPによって誘発されるPC12細胞の損傷を効果的に軽減します。 CDP(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）細胞生存率の改善、細胞膜損傷の減少、細胞内Ca2と恒常性の維持、MMP喪失の防止、細胞アポトーシスの減少、酸化ストレスの抑制、DJ -1の発現の促進、およびミトコンドリアへのDJ-1の移行の促進。 DJ -1は最近、神経保護効果とミトコンドリアの完全性。 これらの結果は、神経保護CDPの効果(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）虚血に対して。 さらに、CDPとDJ-1の間の相互作用は神経保護OGD/RPによって誘発されるPC12細胞の損傷における役割。 上記の結果は、CDPの有益な効果についての理解を深め、将来の脳卒中の治療に役立つ情報を提供する可能性があります。
虚血性脳卒中は、興奮毒性、カルシウム過負荷、酸化ストレスなど、一連の複雑な生化学的および分子的メカニズムに起因しています[31]。 OGD / RPは、虚血再灌流のin vitroモデルとして広く使用されており、神経学的および生化学的変化の調査に使用されます。 PC12細胞株はOGD/RP損傷に敏感です[2]。 交感神経細胞の多くの特性と特徴を示し[32]、したがって脳卒中による神経学的損傷のメカニズムに関連する研究に広く使用されている神経細胞株[33,34]。 多くの研究は、酸化ストレスが脳卒中と脳虚血の損傷に重要な役割を果たしていることを示しています[35–37]。 パーキンソン病関連タンパク質DJ-1は、ROSを介した神経損傷を軽減することにより、虚血性神経変性および行動機能障害を抑制することができます[7]。 したがって、OGD / RP損傷PC12細胞モデルを使用して、神経保護CDPの効果(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）.
OGD / RPによって誘発されたPC12細胞の損傷の程度は、MTT、NRU、およびLDH放出アッセイによって評価されました。 CDPの管理(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）（{{0}}。05、0.5、および5 ug / ml）は、細胞の生存を改善し、LDH放出を減少させました。 CDP治療の有益な効果には、細胞内カルシウム過負荷の減少とMMPの維持も含まれていました。 細胞内Ca2プラス濃度の異常、特にミトコンドリアのカルシウム過負荷は、虚血性脳卒中によって誘発される神経細胞のアポトーシスと死に関連しています[38]。 MMPは、電子伝達系の効率を反映することができ、このシステムの病理学的障害指数として示されています[39]。 細胞内Ca2プラス濃度の上昇とMMP喪失の両方がニューロン構造の不安定化につながり、最終的には細胞損傷または細胞死を引き起こす可能性があります[21,40]。 この研究では、結果は、CDPが細胞内Ca2プラス過負荷を有意に抑制し、OGD/RP損傷PC12細胞のMMPレベルを増加させることを示しました。 アポトーシスは、脳虚血再灌流傷害の複雑な病態生理学において重要な役割を果たします。 データの増加は、アポトーシスがミトコンドリア機能障害に関係していることを示唆しています。 MMPの消失は、細胞アポトーシスを引き起こす初期の事象です[8,39]。 アポトーシスは、冗長な細胞を処分するためのエネルギー依存性のプログラム細胞死のプロセスです。 虚血性脳卒中の多くのニューロンはアポトーシスを起こします[41]。 この研究では、アポトーシスに対するCDPの効果を調べるために、Hoechst33342およびAnnexin V-FITC/PI染色を実行しました[23,28]。 結果は、CDPが核の完全性を維持し、細胞アポトーシス率を低下させることを示しました。 これらすべての結果は、CDPの抗アポトーシス活性がPC12細胞の神経損傷における有益な効果に寄与していることを示しています。
過剰なROS蓄積によって引き起こされる虚血損傷を受けている細胞は、脂質過酸化、細胞膜損傷、カルシウム過負荷、およびミトコンドリア機能障害を引き起こし、最終的に細胞のアポトーシスと死を引き起こす可能性があります[42]。 SOD、CAT、GSH-Pxなどの内因性抗酸化物質の消費も発生を示しました。図9.CDPの保護効果の考えられるメカニズム(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）OGD/RPによるPC12細胞の損傷に対して。 CDPの治療は、酸化ストレスを抑制し、Ca2プラス濃度とMMPを安定させ、ミトコンドリアでのDJ-1の発現と局在化を促進します。 Y. Liuetal。 Biomedicine＆Pharmacotherapy 99（2018）671 –680 678虚血再灌流中の酸化ストレス。 この研究では、OGD / RPグループは、5 ug / ml CDP処理グループと比較して、ROSの有意な増加と、CAT、GSH-Px、およびT-AOCの減少を示しました。 ただし、CDPグループではROSの生成率と内因性抗酸化物質（CAT、GSH-Px、T-AOC）の消費率が大幅に低下することが観察されました。 5 ug / ml CDPグループの有益な効果は、Nimoグループの効果に近かった。 結果は、CDPがROSの生成を阻害し、酵素による抗酸化防御を回復することを示唆しました。
DJ-1は重要なレドックス反応性です神経保護脳卒中の酸化ストレスの調節に関与するタンパク質。 DJ -1の過剰発現の有益な効果には、虚血再灌流による細胞の生存と、ミトコンドリアの透過性遷移孔の開口部の促進など、ミトコンドリアの機能と形態の維持が含まれます[39,43]。 以前の研究では、OGD /RPに曝露された細胞におけるDJ-1の保護効果は、その抗酸化特性とミトコンドリア転座に関連していることが示されています[43–45]。 DJ -1は、転座を介してミトコンドリアの欠陥を軽減する効率的な内因性神経保護を実行します[46]。 いくつかの研究は、DJ -1転座がミトコンドリアの動きに影響を及ぼし、細胞間相互作用を強化し、他の細胞の生存促進プロセスを促進する可能性があることを示しています。
DJ -1は、invitroモデルとinvivoモデルの両方で、細胞の移動と接着、走化性、増殖、アポトーシスなどのいくつかのプロセスに影響を与えます[6,9,47,48]。 OGD / RP損傷PC12細胞脳卒中モデルを使用して、CDP間の潜在的な関係を調査しました(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）とDJ-1。 DJ - 1の過剰発現は、ELISAおよびウエスタンブロッティングによって特定されました。 この機能に加えて、実験での主要な発見は、CDPのときにDJ-1の有意な過剰発現が起こったことを示しました(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）（5 ug / ml）は再灌流前に投与されました。 これは可能性を示唆しました神経保護CDPとDJの関係における効果-1。 さらに、OGD /RPおよびDJ-1の豊富な発現の条件下でミトコンドリアに位置するDJ-1は、ROSに対する細胞の感受性を低下させ、酸化ストレスを阻害することを観察しました[45]。 この結果は、CDPがDJ -1を調節および増強することを示唆しています。これは、ミトコンドリア機能障害と酸化ストレスの間の分子リンクとして機能し、脳卒中に固有の二次細胞死の進行をもたらします[5,47,49–51]。 ミトコンドリアのDJ-1の安定化と並行して、CDP(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）治療は細胞の生存を増加させ、Ca2と恒常性を安定させ、MMPの散逸を改善し、ミトコンドリア関連のアポトーシスを防ぎます[43]。 全体として、私たちの結果は、CDPが小説を発揮することを示しました神経保護虚血性脳卒中の治療におけるメカニズム。
5。結論
私たちの結果は、CDPが(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）部分的にDJ-1を介した経路に起因する抗酸化作用により、PC12細胞をOGD/RP誘発性損傷から保護します。 これらの効果には、細胞膜損傷率の低下、[Ca2 plus] Iホメオスタシスの維持、MMP散逸の改善、細胞アポトーシスの阻害、細胞内ROSの減衰、およびDJ-1レベルの調節が含まれます。 結果はまた、CDPとDJ -1の間の相互作用が神経保護を増幅し、ミトコンドリアの完全性を維持することを示しました。 したがって、脆弱なニューロンはCDPによって保護することができます(石棺アンシュニクジュヨウ多糖類）虚血性脳卒中中のDJ-1発現の増強を介して。
謝辞
この研究は、中国国家自然科学基金（助成金81360649）、国家科学技術キープログラム（助成金2015BAK45B01）、および寧夏回族自治区科学技術支援プログラム（助成金2016BZ07）によってサポートされました。
ニクジュヨウ多糖類持っている 神経保護効果
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