DNA依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット（DNA-PKcs）が雄マウスの慢性腎臓病の進行を促進する

腎臓損傷上皮脱分化とミオを開始しますフィその間のブロブラストの活性化慢性腎臓病の進行。 ここで、私たちは、フィDNA-PKcs の発現が顕著であることフィで増加することはできません両方の慢性腎臓病の腎臓組織患者と雄マウス片側の尿管閉塞によって引き起こされるそして片側虚血再灌流傷害。 in vivoでのDNA-PKcsのノックアウトまたはその特異的治療フィc 阻害剤 NU7441 は、慢性腎臓病の発症雄のマウスで。 インビトロ、DNA-PKCSフィciency は上皮細胞の表現型を保存し、フィトランスフォーミング増殖因子ベータ 1 によって誘導されるブロ芽細胞の活性化。さらに、我々の結果は、TAF7 が DNA-PKcs の基質の可能性として、RAPTOR 発現を上方制御することによって mTORC1 活性化を促進し、その後、損傷した上皮細胞および筋細胞の代謝再プログラミングを促進することを示しています。フィブロブラスト。 まとめると、DNA-PKcs を阻害して、TAF7/mTORC1 シグナル伝達を介して代謝再プログラミングを修正することができます。慢性腎臓病治療の潜在的なターゲットとして機能します慢性腎臓病. 

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慢性腎臓病(CKD) は世界中の成人の 10% に影響を与えています1。 CKDは重症化する可能性が高いため、世界の公衆衛生に大きな負担を与えています。末期腎臓病(ESRD)、透析または腎臓移植が必要です1、2。 腎間質線維症は、CKD2-4 の主要な病理学的特徴の 1 つです。 腎線維症の病態生理学的特徴の多くは、肝硬変や心筋症などの他の線維性疾患と共通しています5。 CKDには効果的な治療法がなく、病理学的メカニズムをより深く理解することが緊急に必要であることが強調されています。根本的なCKD.

損傷した腎臓では、間質性線維症には、トランスフォーミング成長因子ベータ 1 (TGF- 1)、上皮の脱分化、筋線維芽細胞の活性化などの線維化促進因子の異常な発現が関与します。 間質性線維症の重要なメディエーターとして、TGF- 1 は、平滑筋アクチン (-SMA)、フィブロネクチン (FN)、コラーゲンなどの線維化遺伝子の発現を活性化するだけでなく、ヴァールブルグ効果のような代謝再プログラミングも促進します。腎臓細胞6,7。 最近、代謝調節異常と間質線維症の関係が証明され、腎損傷時に腎細胞（尿細管上皮細胞8,9および筋線維芽細胞10）で代謝の再プログラミングが起こり、CKDの発症に寄与していることが明らかになった。 腎細胞の代謝再プログラミングは、脂肪酸酸化 (FAO) の大幅な減少と解糖への代謝移行を引き起こし、免疫細胞浸潤と間質線維症に寄与します 7、11、12。 さらに、臨床データは、CKD 患者では代謝および炎症経路が調節不全であることを明らかにしています7。 遺伝的または薬理学的方法による FAO の回復または解糖の阻害は、腎線維症のさまざまな動物モデルで線維症を軽減します 11,13-15。

代謝再プログラミングの分子機構では、細胞質セリン/スレオニンプロテインキナーゼである哺乳類ラパマイシン標的 (mTOR) が細胞代謝を調節し、代謝恒常性を維持するように作用します 16,17。 mTOR の 2 つの異なる機能複合体は、その結合タンパク質に従って定義されています。 MTOR 複合体 1 (mTORC1) は、その特異的な制御因子 RAP TOR と相互作用し、ラパマイシンに感受性があります 18,19。 mTOR 複合体 2 (mTORC2) は、RICTOR20 によって制御されます。 慢性的な mTORC1 活性化は、腎間質性線維症を含むさまざまな病理学的状態で代謝の再プログラミングを促進します 9,21-23 が、特に間質性線維症においてこの活性化を調節するメカニズムはほとんど不明のままです。

DNA 依存性プロテインキナーゼ (DNA-PK) は、触媒サブユニット (DNA-PKcs) と Ku70/80 ヘテロ二量体から構成される三量体複合体であり、DNA 二本鎖切断 (DSB) 24、25 または ROS26 によって活性化されます。 DNA-PK のよく知られた機能は、V(D)J 組換え中に生成されるプログラムされた DSB を結合し、リンパ球の組換えにおいて重要な役割を果たす非相同末端結合 (NHEJ) を媒介することです 25。 その結果、V (D) J 組換えの欠損により、DNA-PKcs の変異により T および B リンパ球の発達が停止します 27,28。 しかし、DNA-PKcs ノックアウトマウスでは、成長遅延や T 細胞リンパ腫の高頻度の発症は見られませんでした 28。 DNA-PKcs は DNA DSB センサーではありますが、NHEJ29 に必要とされるレベルをはるかに上回るレベルまで細胞内に蓄積するなど、いくつかの珍しい特性を持っています。 さらに、DNA-PKcs は核と細胞質の両方に存在します 30。 その異常な特性と一致して、最近の証拠は、DNA-PKcs が NHEJ31 以外の追加の機能を持っていることを示しています。 たとえば、DNA-PKcs を介した転写因子 USF-1 のリン酸化は、インスリンによって誘導される脂肪酸合成を促進し 32、DNA-PKcs は老化時の代謝低下を促進します 33。 代謝や老化など、DNA PKcs の NHEJ 以外の機能に関する研究はまだ芽生えたばかりで、多くの疑問が未解決のままです 31。 さらに、ホスホイノシチド 3- キナーゼ (PI3K) 関連キナーゼの 1 つとして、DNA-PK が mTOR 活性化を調節することがわかっています 34。

この研究では、我々の結果は、DNA-PKcsがCKDにおけるTATAボックス結合タンパク質関連因子7（TAF7）のリン酸化を介してRAPTOR/mTORC1シグナル伝達の活性化を媒介することを示している。 DNA-PKcs の阻害は、CKD における損傷した上皮細胞および筋線維芽細胞の代謝の再プログラミングを修正します。 DNA-PKcs は、CKD を治療するための新たな潜在的な標的として機能する可能性があります。

結果

DNA-PKcsはCKD患者の腎臓および腎線維症のマウスで増加している

DNA-PKcs の活性は、健康なヒト腎臓組織および CKD ヒト腎臓組織における DNA-PKcs (p-DNA-PKcs) における S2056 自己リン酸化の免疫組織化学的染色によって分析されました。 腎切除サンプルの非腫瘍部分は、腎細胞癌患者から収集された「健康な」腎臓組織として使用されました。 結果は、これらの正常な腎臓組織ではp-DNA-PKcsがほとんど検出されないが、CKDヒト腎臓組織ではp-DNA-PKcsのタンパク質レベルが著しく増加していることを示しました（図1a）。 DNA-PKcs 活性と腎線維症の in vivo での関連性を判断するために、腎線維症に関連する重要な遺伝子であるフィブロネクチン (FN) の発現を免疫組織化学染色で解析し、間質線維症の程度を解析するためにシリウスレッド染色も行いました。 CKD患者における（図1a）。 我々の結果は、p-DNA-PKcsのタンパク質レベルと間質線維症の程度との間に正の相関があることを明らかにした（P= 0.005、図1b、c）。 さらに、以前に公開されたヒト CKD マイクロアレイ データセット (Nephroseq) を使用して、DNA-PKcs の発現レベルも分析されました。 DNA-PKcsのmRNAレベルは、対照と比較して48人のCKD患者の腎生検組織で1.6-倍以上大幅に増加しており（補足図1a）、CKDの程度と有意な正の相関を示していることがわかりました。患者の腎線維症（補足図1b）。 さらに、ロータス テトラゴノロバス レクチン (LTL) (尿細管マーカー) または -SMA (筋線維芽細胞のマーカー) による p-DNA-PKcs の免疫蛍光共染色の結果は、DNA-PKcs が尿細管上皮細胞と尿細管上皮細胞の両方で上方制御されていることを示しました。 CKD患者の腎臓組織の筋線維芽細胞（図1d、e）。 利用可能なオンライン腎臓単細胞 RNA 配列データベース (http://humphreyslab.com/SingleCell/) 35 の分析により、DNA-PKcs mRNA が腎臓細胞で広く発現され、対照腎臓と比較してヒト糖尿病腎臓で上方制御されていることが明らかになりました (補足図) .1c)。

DNA-PKcs 活性と腎臓線維症の発症との関連をさらに特定するために、次に、片側尿管閉塞 (UUO) および片側虚血再灌流 (UIR) という腎臓線維症の 2 つのマウス モデルにおける DNA-PKcs の発現と活性を調べました。 p-DNA-PKcs の免疫組織化学的染色により、UUO モデルでは偽対照と比較して p-DNA PKcs が 3 日目に顕著に誘導され、3 日目から腎線維症が進行するにつれて p-DNA-PKcs のタンパク質レベルがさらに増加し​​たことが示されました。 １４（図１ｆ）。 ウェスタンブロットおよびqRT-PCRの結果は、DNA-PKcsの総タンパク質およびmRNAレベルも、偽対照と比較してUUOマウスの腎臓組織で有意に上方制御されていることを示しました（図1gおよび補足図1e）。 同様の結果がUIRマウスでも観察されました（図1hおよび補足図1d、f）。 DNA-PKcs と CKD との間の潜在的な関連性により、我々は CKD における DNA PKcs の役割とメカニズムの影響をさらに調査するようになりました。

マウスにおける DNA-PKcs 媒介の CKD の進行

次に、「方法」に記載されているように、CRISPR / cas9を使用してDNA-PKcsコード化遺伝子PrkdcをノックアウトしたDNA-PKcsノックアウトマウスを作成しました（補足図2a）。 補足図2aに示すように、DNA-PKcsヘテロ接合（+/-）およびホモ接合（-/-）ノックアウトマウスと野生型（WT）マウスは、遺伝子型決定によって区別されました。 Prkdc mRNA（補足図2c）およびDNA-PKcsタンパク質レベル（図2e）は、DNA-PKcs-/-マウスの腎臓組織では検出されず、マウスにおけるDNA-PKcsのノックアウトが成功したことを示しています。 腎損傷および線維症に対する DNA-PKcs ノックアウト戦略の効果を評価するために、成体 (6 ～ 8 週齢) DNA-PKcs-/- および WT 対照雄マウスを UUO に供し、手術の 7 日後に安楽死させました。 PAS染色により、UUOによって誘発された尿細管萎縮および拡張の程度が、WT対照と比較してDNA-PKcs-/-マウスにおいて顕著に改善されたことが明らかになった（図2a）。 腎線維症も、観察され、マッソン染色によって定量化されたように、WTマウスと比較してDNA-PKcs-/-マウスで大きく改善された(図2b)。 間質性コラーゲンI沈着および-SMAの免疫標識の画像は、両方の古典的な線維形成促進マーカーが、WT対照と比較してDNA-PKcs-/-マウスのUUO腎臓で有意に減少していることを示した（図2c、d）。 ウェスタンブロットで分析したところ、FNおよび-SMAを含む線維化促進マーカーのタンパク質レベルも、DNA-PKcs-/-マウスのUUO腎臓で有意に減少しました（図2e）。 QRT-PCR分析では、マウスのDNA-PKcsをノックアウトすると、UUO腎臓で大きく上方制御されていたCol1a1、Col3a1、Fn1、Acta2などの重要な腎線維症遺伝子の発現レベルが著しく低下することが示された。 線維症の減少と一致して、DNA PKcs ノックアウトは、UUO によって誘導される腎障害マーカー KIM-1 の mRNA レベルも減少しました（補足図 2c）。 さらに、炎症は腎線維症の主要な特徴であり、腎線維症の発症において重要な役割を果たします。 そこで、サイトカイン Il1、Il6、Tnf、Mcp1 などの炎症関連マーカーを qRT-PCR で分析しました。 UUOモデルでは、UUOによって誘発される炎症性サイトカインの上方制御がDNA-PKcsノックアウトによって著しく減少することがわかりました（補足図2c）。 臨床研究と動物モデルの両方がマクロファージと腎線維症の程度の間に強い相関関係を示しているため、UUO腎臓組織に浸潤したマクロファージをマクロファージマーカーF4/80の免疫組織化学的染色によって評価しました。 画像により、UUO 7 日後の WT マウスの閉塞した腎臓に多くの浸潤マクロファージが明らかになりましたが、これは DNA-PKcs ノックアウトによって顕著に減少しました（図 2f）。 興味深いですね、DNA-PKcs

腎線維症に対する腎尿細管 DNA-PKcs の影響をさらに評価するために、CRISPR / cas9 ノックイン マウスを使用して、in vivo で特異的 DNA-PKcs ノックアウトを持つ近位尿細管上皮細胞を構築しました（補足図 2e、f）。 DNA-PKcsのガイドRNA（gRNA）を含むアデノ随伴ウイルス（AAV）を3週間被膜下注射した後、近位尿細管細胞特異的DNA-PKcsノックアウトマウスをUUOに供し、術後7日目に安楽死させた。 DNA-PKcsの免疫蛍光染色は、尿細管細胞にはDNA-PKcsが存在しないことを示しましたが（図2h）、AAV-gRNAを注射したcas9マウスの-SMA陽性筋線維芽細胞では依然として発現していました（補足図2g）。 DNA PKcs の gRNA を含まない AAV を注射された cas9 マウスのマウスのもの。 ウェスタンブロット分析により、AAV-sgRNAを注射したcas9マウスのUUO腎臓では、DNA PKcsおよびFNおよび-SMAを含む線維化促進マーカーのタンパク質レベルも、対照群と比較して有意に減少していることが示されました（図2g）。 。 UUOモデルと同様に、DNA-PKcsノックアウトマウスもUIR誘発性CKDから保護されました（補足図2h–m）。 まとめると、これらの結果は、DNA-PKcs の欠失がマウスの CKD の進行を軽減することを示唆しています。

腎臓における DNA-PKcs の過剰発現が腎線維症を引き起こすのに十分であるかどうかを判断するために、以前のいくつかの研究で説明されているように、ヒト DNA-PKcs 過剰発現プラスミド (Addgene: 83317) を尾静脈高圧注入法によってマウス腎臓に送達しました 36。 DNA-PKcs プラスミド注射の 36 時間後、マウスに 7 日間 UUO 手術を施しました。 まとめると、我々の結果は、ヒトDNA-PKcsの異所性発現がin vivoで腎線維症の進行を促進するのに十分であることを示しています（補足図3）。

DNA-PKcs 活性の阻害はマウスの CKD の発症を軽減する

これらの発見により、我々は、DNA PKcs の阻害剤を腎線維症から保護するために使用できる可能性を検討するようになりました。 私たちの仮説を検証するために、成体（6〜8週齢）WT雄マウスを、UUO手術の1日後から開始して、高特異性DNA-PKcs阻害剤NU7441で毎日治療しました。 NU7441-治療マウスと対照マウスはUUO手術の7日後に安楽死させられ、免疫組織化学的染色によってDNA-PKcs活性が分析されました。その結果、NU7441治療がUUO腎臓組織におけるDNA-PKcsの活性化を顕著に阻害したことが示されました(図3a)。 PAS染色で示されるように、UUOによって誘発された尿細管萎縮および拡張の程度は、ビヒクル対照と比較して、NU7441での治療後に大幅に改善された（図3b）。 マッソン染色の組織病理学的分析により、媒体対照UUO腎臓と比較して、NU{14}}治療マウスの閉塞(UUO)腎臓における腎間質線維症が約50%減少していることが明らかになった(図3c)。 免疫蛍光染色の画像は、UUOによって誘発された間質コラーゲンIの沈着がNU7441処理によって著しく減少したことを示しました（図3e）。 ウエスタンブロットによって分析された、FNおよび-SMAを含む線維化促進マーカーのタンパク質レベルも、溶媒対照と比較して、NU7441-処理マウスのUUO腎臓で有意に減少しました（図3f）。 QRT-PCR分析により、NU7441治療により、媒体対照と比較して、UUOマウスの腎臓組織におけるCol1a1、Col3a1、Fn1、およびActa2を含む重要な腎線維症遺伝子の発現レベルが著しく低下したことが示されました（補足図4a）。 さらに、UUO マウスの腎臓組織におけるマクロファージの浸潤は、溶媒対照と比較して、NU7441 での治療後に大幅に減少しました (図 3d)。 qRT-PCRで分析したところ、NU7441は、UUOマウスの腎臓組織におけるサイトカインIl1、Il6、Tnf、Mcp1などの炎症関連マーカーの発現レベルも低下させた（補足図4a）。 さらに、DNA PKcs ノックアウトマウスも NU7441 で処理し、NU7441 のオフターゲットの可能性を調べました。 我々の結果は、NU7441がDNA-PKcsノックアウトマウスにおいて明らかな抗線維化効果を持たないことを示し（図3g、h）、この実験設定におけるDNA-PKcsに対するNU7441の特異的な作用を示唆している。

UUO 誘発性腎損傷および腎線維症に対する NU7441 の保護効果は、UIR 誘発性 CKD にも拡張されました。 予想どおり、NU7441 治療は、溶媒対照と比較して、UIR 誘発性の腎損傷および線維症からも保護しました（補足図 4b–h）。 まとめると、これらの結果は、NU7441 による DNA-PKcs 活性の阻害がマウスにおける CKD の進行を軽減することを示しています。

図3|DNA-PKcs 活性を阻害すると、UUO マウスにおける CKD の発症が軽減されます。 a NU7441 (40 mg/kg) または UUO に供したビヒクルで処理したマウス (7 日目) の腎臓における p-DNA-PKcs の免疫組織化学的染色、スケール バー: 20 μm。 バーは定量結果を表します(平均±SD、各グループのn=6匹のマウス)。 b NU7441またはUUOに供したビヒクルで処理したマウスの腎臓のPAS染色、スケールバー: 50μm。 バーは定量結果を表します(平均±SD、各グループのn=6マウス)。 c NU7441またはUUOに供したビヒクルで処理したマウスの腎臓のマッソン染色、スケールバー：50μm。 バーは定量結果を表します (平均±SD、各グループの n=6 匹のマウス)。 d NU7441またはUUOに供したビヒクルで処理したマウスの腎臓におけるF4/80の免疫組織化学的染色、スケールバー：20μm。 バーは定量結果を表します (平均±SD、各グループの n=6 マウス)。 e NU7441またはUUOに供したビヒクルで処理したマウスの腎臓におけるCOL1A1の免疫蛍光染色、スケールバー：20μm。 バーは定量結果を表します(平均±SD、各グループのn=6マウス)。 f NU7441またはUUOに供したビヒクルで処理したマウスの腎臓におけるFNおよび-SMAのタンパク質レベル。 バーは定量結果を表します(平均±SD、各グループのn=6マウス)。 g NU7441またはUUOに供したビヒクルで処置したDNA-PKcs-/-またはWTマウスの腎臓におけるFNおよび-SMAのタンパク質レベル。 バーは定量結果を表します(平均±SD、各グループのn=6マウス)。 h NU7441またはUUOに供したビヒクルで処理したDNA-PKcs-/-またはWTマウスの腎臓のシリウスレッド染色。 バーは定量結果を表します (平均±SD、各グループの n=6 匹のマウス)。 対応のない両側 t 検定を使用して、a、c、e の p 値を決定しました。 一元配置分散分析とその後の Tukey の多重比較検定を使用して、b、d、h の p 値を決定しました。 f、g の p 値を決定するために、二元配置 ANOVA とそれに続く Šídák の多重比較検定が使用されました。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

DNA-PKcs の阻害は尿細管上皮細胞の表現型を保存し、in vitro で間質線維芽細胞の活性化を制御します

上皮損傷と筋線維芽細胞の活性化は、CKD2 の発症の中心的な出来事です。 免疫染色により、HK-2細胞（図4a）と初代尿細管上皮細胞（補足図5a）の両方でp-DNAPKcsがTGF 1刺激によって明らかに誘導されたことが明らかになりました。 ウエスタンブロットの結果は、DNA-PKcsのリン酸化および総タンパク質レベルも、TGF 1またはH2O2で処理したHK-2細胞で有意に上方制御されたことを示しました（図4iおよび補足図5b）。 さらに、CRISPR-Cas9 を使用して DNA-PKcs ノックアウト HK-2 細胞を生成し、WT および DNA-PKcs-/- マウス初代尿細管上皮細胞を培養しました。 DNA-PKcsノックアウトHK-2細胞の構築が成功したことは、ウェスタンブロッティングによって確認されました（補足図5c）。 我々の結果は、DNA-PKcs ノックアウトまたは NU{{27 }}処理した細胞（図4b〜d、k、l）。 しかし、KU80ノックアウトは、尿細管上皮細胞においてTGF1によって誘導されるFN産生を促進した(図4m)。 UUOモデルと同様に、DNA-PKcsノックアウトは、H2O2によって誘発されたHK-2細胞のDNA切断を悪化させませんでした（補足図5d）。 KU70/80はまずDSBのDNA切断端を認識し、次にDNA-PKcsを動員して、NHEJ37を介してDSBの修復に必要なDNA-PKを形成します。 これらの結果は、DNA-PKcs がその DSB 修復機能とは無関係に、CKD における腎上皮細胞の線維化促進作用を増強することを示唆しました。

DNA-PKcsが間質線維芽細胞の活性化と増殖に関与しているかどうかを調べるために、培養を行った。 ウエスタンブロットの結果は、DNA-PKcsのリン酸化レベルおよび総タンパク質レベルも、TGF1処理NRK-49F細胞において有意に上方制御されることを示した（図4j）。 免疫染色により、NRK-49F細胞ではDNA-PKcsの活性がTGF1処理によって顕著に誘導されたが（図4e）、NU7441処理によって顕著に阻害されたことが明らかになった。 NRK-49 F細胞をTGF 1で処理すると、COL1、-SMA、およびFNの上方制御を伴う線維芽細胞の活性化と筋線維芽細胞の分化が誘導されましたが、NU7441での前処理は線維化促進性の表現型を大幅に鈍化させました（図4f、g、n）。 さらに、EdU染色によって示されるように、NU7441処理は、ビヒクル対照と比較して、TGF1によって誘導されるNRK-49F細胞増殖を有意に阻害した(図4h)。 総合すると、これらのデータは、DNA-PKcsの阻害が尿細管上皮細胞の表現型を保存し、インビトロでTGF1によって誘導される間質線維芽細胞の活性化を調節することを示す。

さらに、TGF 1- が DNA-PKcs 発現を誘導するメカニズムも調べました。 第一に、JASPAR転写因子結合プロファイル分析を通じて、DNA-PKcsのプロモーター領域にSMAD2の可能性のある複数の結合部位を発見しました38。第二に、ルシフェラーゼアッセイの結果は、SMAD2の過剰発現がDNA-PKcsの転写活性化を増加させることを示しました（補足図5e）。 。 さらに、SMAD シグナル伝達の活性化に対する DNA-PKcs の影響も分析されました。 結果は、DNA-PKcsノックアウトがUUOマウスモデルにおけるSMAD2 / SMAD3の活性化を阻害したことを示しました（補足図5f）。 これらの結果は、SMAD2 / SMAD3がDNA PKcs発現を上方制御する一方、DNA-PKcsがSMAD2 / SMAD3を活性化し（補足図5g）、正のループを形成することを示唆しました。

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