エキナコシドは、AKR1B10/ERK シグナル伝達を調節することにより、乳がん MCF-7 細胞の悪性進行を阻害します

要約: この調査では、エキナコシド（ECH）の増殖、転移およびアドリアマイシン（ADR）耐性乳癌(BC) アルドケト還元酵素ファミリー 1 メンバー 10 (AKR1B10)/細胞外シグナル調節キナーゼ (ERK) 経路の調節を介した MCF{{0} 細胞。 ECHの化学構造が最初に確認されました。 MCF-7細胞を異なる濃度(0、10、20、40μg・mL-1)のECHで48時間処理した。 ウェスタンブロッティングを使用して、AKR1B10/ERK 経路関連タンパク質の発現を分析し、細胞計数キット-8 (CCK-8) アッセイを使用して、細胞の生存率を決定しました。 MCF-7 細胞を収集し、コントロール グループ、ECH グループ、ECH と Ov-NC のグループ、および ECH と OvAKR1B10 のグループに分類しました。 次に、ウェスタンブロッティングを使用して、AKR1B10/ERK 経路関連タンパク質の発現を分析しました。 CCK-8 および 5-エチニル-2'-デオキシウリジン (EdU) アッセイを使用して、細胞増殖を調べました。 細胞移動は、スクラッチ アッセイ、トランスウェル アッセイ、およびウエスタンブロット法で評価されました。 最終的に、MCF-7 細胞を ADR で 48 時間処理して、ADR 耐性を誘導しました。 細胞生存率は CCK-8 アッセイによってテストされ、細胞アポトーシスは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ニックエンドラベリング (TUNEL) アッセイおよびウェスタンブロッティングに基づいて推定されました。 プロテイン データ バンク (PDB) と分子ドッキングに基づいて、AKR1B10 への ECH の結合親和性が評価されました。 さまざまな用量の ECH は、AKR1B10/ERK 経路関連タンパク質の発現を用量依存的に減少させ、対照群と比較して細胞生存率を低下させました。 対照群と比較して、40 μg·mL -1 ECH は MCF-7 細胞の AKR1B10/ERK 経路をブロックし、細胞の増殖、転移、および ADR 耐性を阻害しました。 ECH + Ov -NC グループと比較して、ECH + Ov-AKR1B10 グループは、MCF-7 細胞のいくつかの生物学的挙動の回復を示しました。 ECH は AKR1B10 も標的にしました。 ECH は、AKR1B10/ERK 経路を遮断することにより、BC 細胞の増殖、転移、および ADR 耐性を阻害できます。

キーワード:エキナコシド; AKR1B10/ERK シグナリング; 乳癌; アドリアマイシン耐性

乳がん (BC) は女性の悪性腫瘍の中で群を抜いて最も多く、診断年齢の中央値は約 60 歳です [1]。 中国での BC の新規症例の割合は、世界の割合の 12.2% を占め、世界の BC による死亡の割合は 9.6% を占めています [2]。 高脂肪食、アルコール摂取、運動不足などの遺伝的および環境的要因は、乳がんの危険因子です[3-4]。 現代の治療法には、依然として手術、放射線療法、および薬物療法が含まれます [1]。 一般的な臨床薬には、シクロホスファミド、5- フルオロウラシル、ピラルビシン、クエン酸タモキシフェンなどがあります [5]。また、BC 細胞における薬剤耐性の存在も、ある程度の BC の治療をもたらします。 大きな挑戦 [6]。 同時に、不均一な腫瘍として、BC は骨、肺、肝臓、脳などの臓器に転移する可能性が高く、転移性乳がんはほとんどが不治になります [7]。 カンザシは私の国の伝統的な薬用素材です。 植物科に属し、「砂漠人参」として知られています[8]。エキナコシド(ECH) はカンカから抽出されたフェニルエタノイド配糖体です。 最近の研究では、次のことが強調されています。エキナコシド強力な抗酸化作用、抗炎症作用、抗がん作用があります。 たとえば、mTOR/STAT3 経路を阻害することにより、ECH はパラセタモール誘発性肝障害における炎症反応と酸化ストレスを緩和することができます [9]。 複数の証拠により、ECH が主に BC で腫瘍抑制因子の役割を果たしていることが確認されており、そのメカニズムは、miR-4306 および miR-4508 の発現のダウンレギュレーション [10] または Wnt/-カテニンのブロックに関連している可能性があります。シグナリング[11]。

アルドケトレダクターゼスーパーファミリーのメンバーであるアルドケトレダクターゼ 1B10 (AKR1B10) は、酸化還元反応を介して有毒物質を無毒物質に変換し、対応するアルコールを生成することができるため、宿主細胞に対して保護効果を発揮します [12]。 研究によると、AKR1B10 は主に結腸や小腸などの正常なヒト組織で発現していることが示唆されています [13]。 さらなる研究により、AKR1B10 は主に乳癌の癌遺伝子として機能し、乳癌の潜在的なバイオマーカーになる可能性があることが明らかになりました [14-16]。 MAPK ファミリーの重要なメンバーとして、細胞外調節タンパク質キナーゼ (ERK) は、後生動物のさまざまな進化的に保存された細胞プロセスを制御し、ERK の調節不全はさまざまな疾患につながる可能性があります [17]。 LI J et al [18] は、AKR1B10 が ERK シグナル伝達を活性化することによって乳がんの進行を促進できることを明らかにしました。 さらに興味深いことに、SwissTargetPrediction の Web サイトは、AKR1B10 がエキナセアの潜在的な標的であると予測しました。 ただし、ECH が AKR1B10/ERK シグナル伝達を媒介することによって乳がんの進行に関与しているかどうかは不明です。

この研究は、BC 悪性細胞の表現型に対する ECH の特定の影響を調査し、BC 細胞における ECH と AKR1B10/ERK 経路との関係を解明することに焦点を当てました。

1 素材

ヒト正常乳房上皮細胞株 MCF-10A およびヒト乳癌細胞株 MCF-7 は、中国科学院上海生物科学研究所の細胞資源センターから提供されました。 MCF-7 ADR 耐性細胞は Shanghai Huzhen Industrial Co., Ltd. から購入しました。 Wuhan Proceeds Life Technology Co.、Ltd.から; ECH (バッチ番号 07668) は、米国の Sigma-Aldrich から購入しました。 ADR (ロット番号 KGA8181) は Jiangsu Kaiji Biotechnology Co., Ltd. から購入しました。 RIPA 溶解液 (ロット番号 R0020) は、Beijing Soleibao Technology Co., Ltd. から購入しました。 BCAタンパク質定量試薬（ロット番号CX0013S）はKangwei Century Biotechnology Co.、Ltd.から購入しました。 CCK-8 試薬 (バッチ番号 C0037) は、Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. から購入しました。 Lipofectamine 2000 トランスフェクション試薬 (バッチ番号 11668019) は、Thermo Fisher Scientific Co., Ltd. から購入しました。

Ov-AKR1B10 および Ov-NC プラスミドは、Chongqing Youbao Biotechnology Co., Ltd. から提供されました。 EdU 試薬 (ロット番号 C00003) および TUNEL キット (ロット番号 C11026-1) は、Guangzhou Ribo Biotechnology Co., Ltd. から購入しました。 DAPI (ロット番号 40727ES10) は Shanghai Yisheng Biotechnology Co., Ltd. の Guangzhou Ribo Biotechnology Co., Ltd. から購入しました。 マトリゲル (ロット番号 354230) とトランスウェル チャンバー (ロット番号 3450) は、米国のコーニング社から購入しました。 パラホルムアルデヒド (ロット番号 158127)、クリスタル バイオレット (ロット番号 C0775)、および Triton X-100 溶液 (ロット番号 T8787) は、米国の Sigma Company から提供されました。 ウサギ AKR1B10 (バッチ番号 ab192865)、リン酸化 ERK1/2 (p-ERK1/2、バッチ番号 ab278538)、ERK1/2 (バッチ番号 ab184699)、E-カドヘリン (E-カドヘリン、ロット ab212059)、N-カドヘリン (N -cadherin、ロット ab76011)、カタツムリ (ロット ab216347)、B 細胞リンパ腫-2 (Bcl-2、ロット ab182858)、Bcl-2 関連 X タンパク質 (Bcl-2-関連する X、Bax、バッチ番号 ab182733) 抗体および HPR 標識ヤギ抗ウサギ二次抗体 (バッチ番号 ab6702) は、米国 Abcam から購入しました。 ECL 発光キット (バッチ番号 SL1350) は、Beijing Cool Lamb Technology Co., Ltd. から購入しました。Image-Pro Plus ソフトウェアは、米国の Media Cyber​​netics から購入しました。 Leica DM1000 蛍光顕微鏡と Leica DM ILLED 倒立顕微鏡は、ドイツの Leica Microsystems から購入しました。 SPSS 22.0 ソフトウェアは、米国 IBM から購入しました。

2つの方法

2.1 細胞培養と取り扱い

MCF{{0}A 細胞は、5% ウマ血清、20 ng·mL-1 上皮成長因子、0.5 ug·mL-1 コルチゾール、10 ng を含む DMEM/F12 で培養されました·mL-1 インスリン、100 ng·mL-1 コレラ毒素培地; MCF-7 および MCF-7/ADR セルは

10 パーセントの FBS を含む DMEM/F12 培地で培養。 すべての培地に 1 パーセントの二重抗体を添加し、5 パーセントの CO2 を含む加湿雰囲気で 37 度で保存しました。 その後、MCF-7 細胞にさまざまな濃度の ECH (0、10、20、40 ug·mL-1) を 48 時間介入させました。 MCF-7/ADR 細胞の薬剤耐性を維持するために、1.0 mg·L-1 ADR を適用しました。 セックス。 2.2 ウェスタンブロット法 MCF-7 細胞のタンパク質を RIPA ライセートで抽出し、タンパク質濃度を BCA 試薬で測定しました。 10% SDS-PAGE で分離されたタンパク質は、PVDF メンブレンを使用して転写されました。 室温で 2 時間 5% スキムミルクでブロッキングした後、メンブレンは /10 000)、E-カドヘリン (1/10 000)、N-カドヘリン (1/5 000) でした。 、Snail (1/1 000)、Bcl-2 (1/1 000)、Bax (1/1 000) HPR 標識ヤギ抗ウサギ二次抗体 (1/2 000) を室温で 1 時間添加。 標的タンパク質は ECL 発光キットを追加することによって検出され、タンパク質存在量は Image-Pro Plus ソフトウェアによって分析されました。

乳がん治療のためのエキナコシド カンザシ コーヒーが豊富

2.3 細胞生存率の CCK-8 アッセイ

MCF{{0}}A および MCF-7 細胞を培養用の 96- ウェルプレートに播種し (5×103 細胞/ウェル)、24 時間後に、異なる濃度 (0、10、20、40 ug·mL-1) の ECH が適用されました。介入後、48 時間後、10% 体積分率の CCK-8 試薬で処理され、セル生存率は 2 時間後に検出されました。 MCF-7 細胞の生存率に対する ECH の影響をさらに調査するために、トランスフェクトまたは非トランスフェクト MCF-7 細胞を 24 時間培養し、さまざまな濃度 (0、10、20、40 ug· mL-1) の ECH が介入に使用されました。 、CCK-8 試薬の 10% 体積分率をそれぞれ 24、48、および 72 時間で添加し、細胞生存率の検出方法は上記と同じでした。 MCF-7 細胞のドキソルビシン耐性に対する ECH の影響を調査するために、MCF-7/ADR 耐性細胞を ECH と 48 時間共培養し、次に CCK-8 作業溶液を細胞生存率を検出するために追加されました。

2.4 プラスミドトランスフェクション

MCF-7 細胞を 6- ウェル プレート (5 x 104/ウェル) に播種し、培養しました。 細胞が 60% ～ 70% のコンフルエンスに達したとき、Ov-AKR1B10 と Ov-NC はリポフェクタミン 2000 トランスフェクション試薬の指示に厳密に従って一過性にトランスフェクトされました。 各群の細胞をトランスフェクトし、トランスフェクションは48時間後に完了した。

2.5 EdU 染色による細胞増殖の検出

MCF{{0}細胞をECHで処理し、プラスミドをトランスフェクトした後、20 μmol・L-1 EdUを各ウェルに添加し、37度で2時間インキュベートしました。 続いて、細胞を固定し、それぞれ 4% のパラホルムアルデヒドと 0.5% の Triton X-100 で透過処理しました。 最後に、DAPI で染色された EdU 陽性細胞を蛍光顕微鏡で検出しました。

2.6 細胞遊走を検出する創傷治癒アッセイ

対数増殖期の MCF{{0} 細胞を 6- ウェル プレートに加え、細胞が 90% コンフルエンスに達したら、200 μL 滅菌ピペット チップを使用してストリークを作り、3 を洗浄しますPBSで倍。 傷の幅は倒立顕微鏡下で 0 時間と 48 時間で測定され、転送されたセルの数が決定されました。

2.7 細胞浸潤を検出するトランスウェルアッセイ

ECH 処理およびプラスミド トランスフェクト MCF-7 細胞をマトリゲルを含むトランスウェルの上部チャンバーに播種し、10% FBS を含む 500 μL の DMEM 培地をトランスウェルの下部チャンバーに加えました。 24時間後、表面の細胞を綿棒で拭き取り、細胞を固定し、それぞれパラホルムアルデヒドとクリスタルバイオレットで染色し、浸潤細胞を顕微鏡で数えました。

2.8 アポトーシスを検出するための TUNEL 染色

15 μmol L-1 ADR による介入後、ECH 処理およびプラスミド トランスフェクト MCF-7/ADR 耐性細胞を 96- ウェル プレートに播種し、4% パラホルムアルデヒドおよび {{ 8}}.5 percent Triton X-100透過処理後、TUNEL検出液を加え、キットの説明書に従い、37℃で45分間反応させ、DAPI細胞核を染色した。 . 蛍光顕微鏡下で細胞アポトーシスを観察するために、5つの視野がランダムに選択されました。

2.9 分子ドッキング

AKR1B10 タンパク質 (PDB ID: 1ZUA) の立体構造は、PDB データベース (https://www.rcsb.org/) から取得しました。 PyMOL 2.2.0 ソフトウェアを使用して有効成分から水を除去し、無関係な元の配位子を除去し、ECH の化学構造を OpenBabel 2.2.1 ソフトウェア (http://openbabel.org/wiki) で mol2 形式に変換し、最後に Autodock を使用します。 4.2 は分子ドッキングを実行し、可視化のために自由エネルギー (-10.8 kcal·mol-1) が最も低いポーズを選択します。

2.10 統計分析

この研究では、SPSS 22.0 ソフトウェアを使用して実験データを分析および処理し、平均 ± 標準偏差 (x ± s) として表しました。 グループ間の比較には、一元配置分散分析を使用しました。 Pのとき<0.05, the difference was statistically significant.

3件の結果

3.1 ECH は MCF-7 細胞の AKR1B10/ERK シグナル伝達を阻害する まず、ウェスタンブロッティングの結果から、ECH 曝露量の増加に伴い、MCF{{11 }} 細胞は減少し、減少傾向は用量依存的であった P<0.001) (Fig. 1). It can be speculated that ECH may participate in the malignant progression of BC by regulating AKR1B10/ERK signaling.

図1 効果エキナコシドMCF-7 細胞における AKR1B10/ERK シグナル伝達について (x̄  s, n=3)

3.2 AKR1B10 の過剰発現は、MCF-7 細胞増殖に対する ECH の阻害効果を逆転させた

CCK{{0}} の実験データは、MCF-10A 正常細胞と比較して、異なる濃度の ECH (0、10、20、40 μg·mL{{6} }) は、MCF-7 がん細胞の活性を濃度依存的に低下させました (P< 0.05), and when the mass concentration of ECH was 40 μg·mL-1, the cell activity decreased most significantly, so 40 μg·mL-1 ECH was used for subsequent experiments. To further verify whether ECH regulates BC development by regulating AKR1B10/ERK signaling, MCF-7 cells were first transfected with the Ov-AKR1B10 plasmid. After transfection of Ov-AKR1B10, the expression level of AKR1B10 was significantly increased (P<0.001). Western blotting results showed that transfection of Ov-AKR1B10 plasmid induced ECH exposure-induced reduced AKR1B10 and p-ERK1/2 protein levels again increased (P<0.001). In addition, the experimental data of CCK-8 and EdU demonstrated that the inhibitory effect of ECH treatment on the proliferation of MCF-7 cells could be alleviated by the up-regulation of AKR1B10 (P<0.05) (Fig. 2). Thus, overexpression of AKR1B10 rescued the inhibitory effect of ECH on the proliferative capacity of BC cells.

Fig.2 AKR1B10発現調節によるMCF-7細胞の増殖に対するエキノシドの効果 (蛍光染色、×200; x̄  s, n=3)

3.3 AKR1B10 の過剰発現は、MCF-7 細胞移動に対する ECH の阻害効果を逆転させた 同様に、対照群と比較して、ECH 投与は細胞移動および浸潤の数の有意な減少をもたらした (P<0.001); In contrast, increased expression of AKR1B10 resulted in enhanced cell migration and invasion (P<0.05). In addition, compared with the control group, the protein levels of N-cadherin and Snail were significantly decreased after ECH treatment, while the level of E-cadherin was significantly increased (P<0.001); The protein levels of cadherin and Snail increased, while the level of E-cadherin decreased (P<0.001) (Fig. 3). In conclusion, up-regulation of AKR1B10 expression rescued the inhibitory effect of ECH administration on BC cell migration and invasion.

Fig.4 AKR1B10発現調節によるMCF-7細胞のADR耐性に対するエキノシドの影響 (蛍光染色、×200; x̄  s, n=3)

4。討議

乳がんとは、さまざまな発がん因子の作用下で乳腺上皮細胞が制御されずに増殖することを指し、女性のがんによる死亡の主な原因でもあります [1]。 腫瘍転移は、腫瘍の最も脅威的な特徴の 1 つであり、腫瘍の長期治癒の根本原因でもあります [19]。 化学療法は、乳がんの臨床治療の一般的な方法です [20]。 乳がんの治療法と概念の継続的な進歩と更新により、乳がんの予後は大幅に改善されています[20]。 しかし、薬剤耐性の出現により、薬剤の臨床効果が大幅に制限されます [21]。 研究によると、転移性乳がん患者の約 90% と進行性乳がん患者の 50% が薬剤耐性を発症することがわかっています [22]。 ADR はアントラサイクリン系抗生物質で、DNA の化学構造に作用することで転移性または再発性乳がんの臨床治療に広く使用されており、乳がん患者の再発率と死亡率を効果的に低下させることができます [23]。 したがって、この研究では、BC細胞の増殖、転移、およびADR耐性に焦点を当て、BC進行の調節メカニズムを深く明らかにし、介入のための潜在的な分子標的を探索しました。

エキナセアは、天然ハーブのカンキツクとエキナセア・プルプレアの根茎から得られるフェニルエタノイド化合物です。 抗酸化剤、抗うつ剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、抗菌剤など、さまざまな薬理効果があります [24-25]。 最近の研究では、ECH が PI3K/Akt 経路を調節することにより、卵巣癌細胞の増殖、転移、および血管新生を阻害できることが報告されています [26]。 ECH は、TGF-1/Smad 経路を活性化することにより、肝臓がんにおいて抗がん活性を発揮することができます [27]。 ECH は、Wnt/-カテニン シグナル伝達経路を不活性化することにより、BC 腫瘍の成長を妨げることができます [11]。 この研究では、AKR1B10 が最初に、SwissTargetPrediction によって ECH の潜在的な標的であると予測されました。 したがって、著者らは、ECH が AKR1B10- 関連のシグナル伝達経路を調節することにより、BC 疾患の進行に関与している可能性があると推測しています。 これまでに、AKR1B10 はさまざまな癌で発現が増加し、癌を促進する役割を果たしていることがわかっています [28]。 さらに、AKR1B10 は、ERK シグナル伝達を活性化することにより、膀胱がん、肺腺がん、および BC の発症を悪化させる可能性があります [18, 29-30]。 乳癌細胞における AKR1B10 の異所性発現は、ERK 1/2 のリン酸化を促進し、ERK シグナル伝達経路を活性化します [18]。 ERK シグナル伝達経路は、MMP、特に MMP2 を活性化することで細胞外マトリックスの分解を促進し、それによって腫瘍細胞の浸潤と腫瘍転移を促進します [31-33]。 この実験の結果は、AKR1B10/ERK 経路関連タンパク質の発現が、さまざまな濃度の ECH で処理した後に用量依存的に減少することも示しました。これは、ECH が AKR1B10/ERK を阻害することによって BC の調節メカニズムに関与している可能性があることを示しています。小道。 さらに、ECH 暴露は、BC 細胞の生存率のさまざまな程度の低下ももたらしました。 この点をさらに証明するために、この研究では AKR1B10 過剰発現プラスミドを MCF-7 BC 細胞にトランスフェクトし、AKR1B10/ERK 経路と細胞増殖、移動と浸潤、上皮間葉転換に対する ECH 処理の阻害効果が過剰発現することを発見しました。 AKR1B10によって救助されました。 さらに、MCF-7/ADR 耐性細胞では、ECH 暴露により IC50 が減少し、アポトーシス細胞の数が増加しました。 一方、この設定での AKR1B10 の過剰発現は、再び IC50 を増加させ、アポトーシス細胞の産生を減少させました。 実験の最後に、ECH と AKR1B10 のターゲティング関係も完全に検証されました。 上記の実験結果は、

AKR1B10 の過剰発現は、ECH 抑制 BC の発生に対して拮抗効果をもたらします。

結論として、ECH 投与は BC 細胞の増殖、移動、浸潤、EMT および ADR 耐性を弱めることができ、そのメカニズムは AKR1B10 の標的化と AKR1B10/ERK シグナル伝達経路の阻害に関連している可能性があります。 この研究は当初、BC における ECH の潜在的なメカニズムを明らかにし、抗 BC 薬における ECH の適用に対する貴重な実験的根拠と理論的サポートを提供しました。 ただし、この研究にはまだいくつかの欠点があります。 まず、この実験には、BC 患者の生存率と予後に対する ECH の影響の分析は含まれていません。 第二に、この研究には、BC 腫瘍の成長における ECH の役割をさらに検証するための in vivo 動物実験が欠けていました。 今後の研究では、乳癌治療における ECH の臨床的意義がさらに調査される予定です。

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