免疫学的肝線維症のラットに対するCistancheフェニルエタノイド配糖体の効果とメカニズム
Mar 11, 2022
連絡先：Audrey Hu Whatsapp / hp：0086 13880143964メール：audrey.hu@wecistanche.com
YOU Shu-ping1、ZHAO Jun2、MA Long1、Mukaram TUDIMAT1、ZHANG Shi-lei1、LIU Tao1
（1.新疆医科大学公衆衛生学部毒物学科、ウルムチ830011、
中国; 2.マテリアメディカ研究所、新疆ウイグル自治区、ウルムチ830004、中国）
概要：
目的の抗線維化効果を研究することCistancheフェニルエタノイド配糖体ウシ血清アルブミン（BSA）中の（CPhG）-ラットに誘発された肝硬変とその考えられるメカニズム方法：75匹のSDラットをランダムに6つのグループに分けました：正常対照（蒸留水処理）、モデル（BSA処理）、陽性薬物[BSA処理プラス化合物Biejiarangan錠（BJRG）0。6 g・kg "']、およびBSA処理プラスCPhG（0。125、{{1 0 }}。25および0。5g-kg"1）グループ。各BSA処理およびCPhG（0。125、0。25、および0.5）には13匹のラットがいました。 g-kg'1）群と他群12匹のラットBSA免疫の皮下注射と尾静脈注射を用いてラット肝硬変モデルを誘発した一方、ラットに異なる治療薬を投与した。実験期間後、ラット塩素水和物を10％投与する前に12時間絶食させ、すぐに安楽死させました。肝臓の重量を測定して肝臓指数を計算しました。グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（GPT）、グルタミン酸シュウ酸トランスアミナーゼ（GOT）、アルカリホスファターゼ（ ALP）、総タンパク質（TP）、およびアルブミン（ALB）は、Mind-Ray自動生化学分析装置によって評価されました。 肝臓組織中のヒドロキシプロリン（HyP）の密度は、kiVsの指示に従って分光光度法を使用して決定されました。 肝臓組織におけるI型およびIII型コラーゲンの組織病理学的変化および発現もまた、免疫組織化学的染色によって決定された。 結果正常な対照群と比較して、モデル群の肝臓組織のコラーゲン線維はそれらのリンクを拡張し、小葉全体を包み込み、小葉の構造的損傷と偽小葉の形成を引き起こした。 肝臓指数（P<0.05), gpt,="" got,="" alp,="" tp,="" and="" alb="" serum="" levels=""><0.05), hyp="" content=""><0.01) were="" significantly="" increased,="" so="" was="" the="" expression="" of="" type="" i="" collagen="" and="" type="" iii=""><0.01) in="" the="" model="" group.="" compared="" with="" the="" model="" group,="" various="" doses="" (0.125,="" 0.25="" and="" 0.5="" g="" •="" kg"1)="" of="" cphg="" significantly="" reduced="" the="" bsa-induced="" elevation="" of="" the="" liver="" index="" gpt,="" got,="" alp,="" tp,="" and="" alb="" serum="" levels=""><0.05), and="" hyp="" content=""><0.01) the="" morphology="" of="" the="" pathological="" tissue="" sections="" was="" close="" to="" that="" of="" the="" normal="" control="" group,="" and="" cphg="" significantly="" reduced="" the="" expression="" of="" two="" types="" of="" collagens=""><0.01). conclusion:="" cphg="" can="" significantly="" reduce="" the="" degree="" of="" bsa-induced="" liver="" fibrosis="" in="" rats.="" the="" mechanism="" may="" be="" associated="" with="" the="" down-regulation="" of="" two="" types="" of="" collagens="" and="" suppression="" of="" the="" activation="" of="" hepatic="" stellate="">
キーワード：Cistanche; フェニルエタノイド配糖体; 肝線維症; ウシ血清アルブミン; タイプコラーゲン
Cistanche（Cistanche）植物は有名で価値のある漢方薬です。 その正確な治療効果と穏やかな薬効のために、それは古くから強力で栄養価の高い漢方薬と見なされており、「砂漠の高麗人参」の評判があります。 近年では、Cistancheその驚くべき生物活性で人々の注目を集めています。 化学的および薬理学的研究は、Cistancheフェニルエタノイド配糖体（CPhG）は、Cistancheの薬効の主要な材料ベースの1つです]。 CPhGには、抗酸化剤、抗うつ剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、抗菌剤、免疫調節などのさまざまな生物学的活性があります]。 ピーターは1989年に、CPhG化合物であるエキナコシドが肝臓に有意な保護効果をもたらすことを最初に発見し、その後、CPhG抗肝硬変研究への人々の関心を呼び起こしました。 この研究グループの予備研究では、多肉植物の茎の抽出物がCistancheinvitro免疫肝損傷モデルおよびHepG2.2.15細胞モデルに対して優れた肝保護および肝保護を示します。 抗B型肝炎ウイルスの効果はありますが、CPhGによる肝硬変の抑制の具体的なメカニズムと抗肝硬変の具体的なメカニズムはまだ明らかではありません。 この研究では、ラットにウシ血清アルブミン（ウシ血清アルブミン、BSA）を皮下注射し、尾静脈にウシ血清アルブミン（ウシ血清アルブミン、BSA）を注射して、免疫肝線維症モデルを作成し、肝障害と線維症の程度を評価し、肝保護と抗肝線維症。 考えられる作用機序。
1材料と方法
1.1試薬と機器。
の新鮮な肉質の茎Cistanche（C.tubulosa）6. 0 kg、70％エタノールを3時間、各3時間還流し、抽出物を合わせました。 AB。 8レジンを精製して、フェニルエタノイド配糖体抽出物、すなわちCPhG（Cistancheフェニルエタノイド配糖体）70パーセントの純度の高効率液相クロマトグラフィーを使用して趙淳によって新疆ウイグル自治区の製薬研究所の研究者によってCPhGとして同定された化合物。 0。5パーセントのナトリウムカルボキシメチルセルロース（CMC-Na）を使用して、薬をさまざまな濃度に調合し、後で使用するために4度の冷蔵庫に保管します。 複合Biejia範囲の錠剤（複合Biejia範囲の錠剤、BJRG）（Inner Mongolia Furui Technology Co.、Ltd.、バッチ番号：20131006）、BSA（American Sigma社の製品、CAS：9048-46。8、輸入原液入り）、ラノリン（上海元兵科工業株式会社）、液体パラフィン（天津風水ファインケミカル株式会社）、リン酸緩衝液[フィッシャーバイオケミカルプロダクツ（北京）株式会社、バッチ番号：NZD1132]。 肝組織ヒドロキシプロリン（Hyp）検出試薬（南京江城生物工学研究所、バッチ番号：20140526）、ウサギ抗コラーゲン1型抗体0.2 mL（American Abcain社、バッチ番号：140619）、ウサギ抗コラーゲン11型抗体{{ 20}} mL（China Bioss社、バッチ番号：98O788W）。 電気加熱定温インキュベーター（上海毅協技術有限公司）、縦圧蒸気滅菌器（上海ボックスン工業株式会社医療機器工場）、L -530マルチチューブラック自動バランス遠心分離機（長社翔義Centrifuge Instrument Co.、Ltd.）、自動生化学分析装置（Mindray、シリアル番号：A086A0182）、化学発光分析装置（Tiger Technology、シリアル番号：mp2808）。
1.2動物、モデルの準備と投与
雄の健康なSDラット、SPFグレード、体重{{0}} g、新疆医科大学の実験動物センターから提供、動物生産ライセンス番号SCXK（新規）2011。{{13 }}004。 SPF環境実験動物使用ライセンス番号：SYXK（新規）2011-0004、給餌制御された環境条件（25度および12時間の明/暗サイクル）、ラットは自由に飲食し、標準ペレットを給餌し、通常の給餌後に使用3日。 動物実験に関連するすべての手順は、新疆医科大学の最初の臨床付属病院の動物倫理委員会によって承認されました。 75匹のSDラットをランダムに6つのグループ、すなわち正常対照群、モデル群、BJRG陽性薬物対照群（0.6g・kg）、CPhG 0.125、0.25および0.5g・kgに分けた。 CPhGグループには各グループに13匹の動物がおり、他のグループには各グループに12匹の動物がいます。 BJRG陽性薬物対照群の用量を設定するには、薬物の説明を参照して、ヒトとラットの間の体表面積変換の等価線量比を設定してください。 CPhGの場合(Cistancheフェニルエタノイド配糖体) 用量については、文献[8]および実験前の結果を参照してください。 正常な対照群に加えて、ラットは朱Qigui等を使用しました。 。 方法免疫肝線維症モデルを作成しました。 モデルは感作段階と尾静脈攻撃段階に分けられました。 感作段階：通常の対照群に加えて、各群のラットに0.5mLの通常の生理食塩水を注射した。 他のグループのラットには、BSA 9g・Lフロイントの不完全アジュバント、毎回0。5 mL、合計5回のSCを複数ポイント与えました。 最初の2回の注射の間隔は14日で、最後の3回の注射の間隔は7日でした。 最後の感作注射から1週間後、各ラットの眼内静脈叢から採血し、双方向拡散法によりラット血清抗BSA抗体を検出した。 発作段階：モデル群および投与群として、抗体陽性ラットは、BSAを週2回5週間尾静脈に注射し続けます。 注射量は、それぞれ2mLからそれぞれ4mLに徐々に増加します。 正常な対照群は、生理的な尾静脈注射ブラインを受け取ります。 投与量：モデルは、設定された投与量igで同時に投与されます（ブランクコントロールグループとモデルグループigには蒸留水が与えられます）。 モデルが完成した後、治療はH1時間ごとに4週間継続され、実験期間は合計15週間です。
1.3肝臓指数の決定
各グループは、最後のig（水を助けることはできません）の後に24時間絶食し、体重を量り、頸椎脱臼によって犠牲にしました。 肝臓を採取し、臓器表面の血液を濾紙で吸い取り、脂肪とメサンギウムを切り取って秤量した。 肝臓指数。 肝臓指数=臓器品質（g）/ fこの品質（g）×100。
1.4肝硬変を観察するためのマッソン染色。 すべてのラットは同じ部位から肝臓組織を採取し、1 0パーセントのパラホルムアルデヒドで固定し、従来のパラフィンに包埋し、切片化してマッソンで染色し、顕微鏡で組織学的変化を観察しました。 肝硬変の分類は、文献[10]を参照して5つのグレードに分けられます。 グレード0：線維症なし。 グレードI：線維性結合組織は門脈領域に限定されているか、門脈領域が拡大して小葉に向かって発達する傾向があります。 グレード¨：線維性結合組織過形成、小葉の2/3以上、グレードIの変化を伴う。 四川グレード：線維性結合組織が中心静脈周辺の肝小葉に入ります。 lVグレード：線維性結合組織は、小葉全体に複数のびまん性過形成を示し、偽小葉が形成され、グレードIIIの変化が見られます。
1.5血清生化学的指標の検出
各グループのラットは、最後の投与後24時間絶食（水を助けることができない）し、体重を測定し、ペントバルビタールナトリウム（30mg・kg-、ip）麻酔後に採血し、12000xgで10分間遠心分離しました。血清を分離し、血清グルタミン酸-ピルビン酸トランスフェラーゼ（GPT）、グルタミン酸-オキサル酢酸トランスフェラーゼ（GOT）、アルカリホスファターゼ（ALP）、総タンパク質（TP）、およびタンパク質を検出する自動生化学分析装置。 タンパク質（アルブミン、ALB）含有量。
1.6肝臓組織ホモジネート中のヒドロキシプロリンの含有量の測定
肝臓組織の0.1g（湿重量）を正確に量り、それを試験管に入れ、1mLの加水分解物を正確に加え、よく混合します。 肝臓組織HyPテストキットの指示に厳密に従って、肝臓組織HyPの含有量を確認してください。
1.7肝組織線維症1型およびIII型コラーゲン発現を測定するための免疫組織化学的方法
Nikon DIGITALSIGHTDS-Fi2生物学的顕微鏡で組織切片を観察し、K1232 0顕微鏡カメラシステムを使用して、低倍率および高倍率で明確な視野を選択しました。 写真。 Motic Med6.0CMlASカラー画像解析ソフトウェアを使用して、顕微鏡カメラシステムで200倍に拡大し、視野ごとに3つの視野をランダムに選択し、視野ごとに2cmx3cmサイズの5つの領域をランダムに選択します。 I型および四川型コラーゲンは免疫組織化学的に陽性です。 反応生成物は細胞質の茶黄色の細粒染色であり、平均吸光度値が測定されます。 値が大きいほど、組織内のI型およびII型コラーゲンの含有量が高くなります。 計算式：吸光度値=コラーゲン面積（cm）/肝臓組織面積（cm）。
1.8統計分析
統計分析にはSPSS16。0統計ソフトウェアを使用し、実験結果データはX_Sで表されます。 複数のグループ間の平均の比較では、分散分析の一元配置分散分析を使用し、複数のグループのサンプル平均のペアワイズ比較では、統計にLSD法を使用します。 科学的分析、順序付けられた分類データのRidit分析を使用、テストレベルは=0。05
2件の結果
2.1BSA誘発肝硬変ラットの体重と肝臓指数に対するCistancheエタノール抽出物の効果
表1からわかるように、正常対照群と比較して、モデル群の体重が減少し、肝臓指数が増加しました（PO。0 5）。 モデル群と比較して、BJRG群およびCPhG 0。125、0。25、および0.5 g-kg'1群が大きかったマウスの体重が増加し、肝臓指数が減少した（ P<0.05), indicating="" that="" the="" liver="" cells="" of="" the="" rats="" were="" damaged="" after="" the="" injection="" of="" bsa,="" and="">(Cistancheフェニルエタノイド配糖体) ラットの肝障害に対して一定の保護効果があります。
2.2BSA誘発肝硬変のラットの肝硬変に対するCistancheエタノール抽出物の効果
図1から、正常対照群のラットの肝組織は正常であり、炎症性細胞浸潤は見られず、肝小葉構造は無傷で透明であり、肝細胞は紐状に分布しており、不規則な類洞はなく、門脈領域は拡大していません。 モデルグループのラットは、コラーゲン線維が伸びて結合し、肝小葉全体を取り囲み、正常な肝小葉の構造を破壊し、偽小葉を形成するグレードIII〜IVの線維症を示しますが、ほとんどが寛大な偽小葉です。 陽性薬物BJRGグループとCPhG(Cistancheフェニルエタノイド配糖体) 群は有意な治療効果を示し、病理組織切片は形態が基本的に正常対照群と類似していることを示した。
マッソン染色による肝硬変の標準得点によると、Shao Quchangグループと比較して、モデル肝臓の線維化の程度は有意に増加しました（P<0.01); the="" degree="" of="" liver="" fibrosis="" in="" the="" positive="" drug="" bjrg="" group="" and="" cphg="" 0.125,="" 0.25="" and="" 0.5="" g-kg="" 1="" group="" significantly="" lower="" than="" the="" model="" group=""><0.01) ridit="" analysis="" showed="" that="" cphg="" has="" a="" preventive="" and="" therapeutic="" effect="" on="" immune="" liver="" fibrosis="" (table="">
2.3BSA誘発肝線維症ラットの肝機能に対するCistancheエタノール抽出物の効果
表3は、正常対照群と比較して、モデル群の血清GPT、GOT、ALP活性、およびTP含有量が有意に増加したことを示しています（P
Tab.1の効果Cistancheフェニルエタノイド配糖体（CPhG）ウシ血清アルブミン（BSA）によって誘発された肝線維症ラットの体重と肝臓指数
2.4BSA誘発肝線維症ラットの肝臓組織におけるHyP含有量に対するCistancheエタノール抽出物の効果
表4の結果は、正常な対照群と比較して、モデル群の肝臓組織のHyP含有量が有意に増加したことを示しています（PO.01）。 モデルグループと比較して、CPhGのHyPコンテンツ(Cistancheフェニルエタノイド配糖体) {{0}}。125、0。25、および0.5 gkの鉱山グループであり、BJRGグループは大幅に減少しました（P<0.05,><0.01)o shows="" that="" cphg="" reduces="" the="" extracellular="" matrix="" (extracellular="" matrix,="" ecm)="" deposition="" in="" the="">
2.5BSA誘発肝線維症ラットの肝臓組織におけるI型およびIII型コラーゲンの発現に対する根茎根のエタノール抽出物の効果
表5は、正常対照群と比較して、モデル群の肝臓組織におけるI型およびIII型コラーゲンの発現が増加したことを示しています（P<0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" positive="" animal="" bjrg="" group="" and="" cphg="" 0.125,="" 0.25="" and="" 0.5="" g-="" the="" expression="" of="" type="" i="" and="" type="" iii="" collagen="" in="" the="" liver="" tissue="" of="" the="" kg-1="" group="" decreased=""><0.05,><0.01), and="" the="" cphg="" 0.5="" g•kg"1="" group="" was="" the="" most="" significant.="" it="" showed="" that="" cphg="" can="" prevent="" liver="" fibrosis="" in="" rats="" and="" the="" therapeutic="" effect="" can="" reduce="" the="" proliferation="" of="" collagen="" fibers="" in="" rats,="" which="" is="" consistent="" with="" the="" observation="" results="" of="" liver="" tissue="">
3ディスカッション
Liver fibrosis is a process of damage and repair after repeated or chronic liver damage. It is mainly related to chronic inflammation and the chemical factors that cause chronic liver damage. It has become a world medical problem with high morbidity and mortality. Most of the various liver diseases eventually develop into advanced liver cirrhosis through liver fibrosis, which becomes the main cause of death from liver disease. In this study, a rat model of BSA-immune liver fibrosis was used. After BSA-immunized rats were injected with BSA through tail vein attacks 10 times, their liver tissue structure was severely damaged, inflammatory cells were infiltrated, and the fibrous septum composed of collagen fibers was in or Has formed. According to reports, liver fibrosis caused by BSA immune damage is closer to liver fibrosis caused by clinical chronic hepatitis and is suitable for liver fibrosis caused by antigen-antibody complex reaction, prevention and treatment, and screening of traditional Chinese medicine. According to research, fibrosis can be >260 d".
ラットにおけるBSA誘発免疫肝線維症モデルを使用したこの研究の結果は、MingZhijunらの報告と一致しています。 およびZhangGuilinget al。は、この研究が免疫性肝線維症モデルをうまく再現したことを示唆しています。 CPhG(Cistancheフェニルエタノイド配糖体) 介入は、血清GPT、GOT、ALP、TP、およびALBレベルを低下させ、抗肝硬変効果を示す可能性があります。 CPhGを長期間使用しても、肝機能に悪影響を与えることはありません。
この研究の結果は、CPhGの予防的投与が(Cistancheフェニルエタノイド配糖体) 治療は肝硬変のプロセスを効果的に抑制し、病気の程度を減らすことができ、用量の増加とともに改善はより明白になります。 これは、CPhGが肝硬変に対してより優れた予防および治療効果を持っていることを示唆しています。これはBJRG陽性対照群の効果と同等です。
Liver fibrosis is also the central link in the development of liver cirrhosis. According to reports, cytokines are involved in the formation of portal hypertension and liver fibrosis. The salient feature of liver fibrosis is that the synthesis and degradation of type I and III collagen and hyaluronic acid (hyaluronic acid) are out of balance, which leads to ECM deposition, especially related to the deposition of type I and III collagen ⑶, accounting for the total amount of ECM>80パーセントo正常な肝臓ECMにおけるI型コラーゲンとIII型コラーゲンの比率は1です。 肝硬変の場合、肝内コラーゲンは5〜7倍以上増加し、III型コラーゲンは通常線維症の初期段階で発生し、I型接着剤の原理は線維症の後期段階にあります。 増加が最も重要であるため、I型およびIII型コラーゲンの増殖は肝硬変の程度と正の相関があります。 肝硬変は、ECM合成と分解の不均衡の動的なプロセスです。 この研究は、CPhGが肝臓でのECMの沈着を減少させることを発見し、さらにCPhGが(Cistancheフェニルエタノイド配糖体) 実験的肝線維症の予防と治療効果があります。
免疫組織化学を使用して肝臓組織のI型およびIII型コラーゲン含有量の変化を検出すると、CPhGの治療効果を客観的かつ直接観察できます。(Cistancheフェニルエタノイド配糖体) 肝線維症に対して。 この研究は、CPhGのラットの肝臓組織におけるI型およびIII型コラーゲンを示しました(Cistancheフェニルエタノイド配糖体) グループは、中心静脈と門脈領域の周りにのみ見つかりました。 染色は減少して浅く、糸状であった。 免疫組織化学的染色は弱く陽性であり、CPhGがコラーゲン産生を減少させることができることを示唆している。 肝硬変のプロセスを阻害するメカニズムは、肝星細胞の活性化を阻害し、ECMの合成を減少させ、それによって抗線維化効果を発揮することによる可能性があります。
要約すると、ラット肝線維症に対するCPhGの作用機序は、コラーゲン産生を阻害し、コラーゲン分解を促進し、肝線維症のラットの肝組織におけるコラーゲンとHyPの含有量を減らし、それによってECMと抗肝線維症。 化学の役割と作用の特定のメカニズムは、まだ徹底的に研究する必要があります。
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