水性酵素抽出によるカボチャ (Cucurbita Moschata) 種子油の脂肪酸組成、抗酸化作用、および薬理活性の評価 パート 1

May 08, 2023

概要:パンプキンシードオイルは副産物であり、いくつかの健康上の利点を促進する栄養素と生物活性成分が豊富です。 この研究は、Cucurbita moscata Duch から抽出されたカボチャ種子油の化学組成、抗酸化物質、および薬理学的活性を比較することを目的としました。 元ポワール。 (PSO1) および水性酵素抽出による Cucurbita moschata (日本かぼちゃ) (PSO2)。 酵素抽出プロセスでは、ペクチナーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ (1:1:1) からなる酵素混合物を使用しました。 油の脂肪酸組成は、脂肪酸メチルエステル/ガスクロマトグラフィー質量分析法を使用して決定されました。 抗酸化活性アッセイは、安定フリーラジカル ジフェニルピクリルヒドラジル、ラジカル カチオン 2、20 -アジノビス-(3- エチルベンゾチアゾリン-6-スルホネート、第二鉄還元力/抗酸化力、およびチオシアン酸第二鉄アッセイを使用して測定されました。皮膚の老化と美白プ​​ロセスに関与する酵素が研究されました. リノール酸はすべてのカボチャ種子油の主成分でした. さらに、大量のオレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸も検出されました. PSO2 は、他のカボチャ種子油と比較して最も高い抗酸化活性を持っていましたPSO1 と市販のカボチャ種子油 (COM1 および COM2). PSO1 と PSO2 は両方とも、市販のものよりもヒアルロニダーゼ、コラゲナーゼ、およびチロシナーゼに対して高い阻害効果を示しました。これはさらなる薬理学的研究に有益であり、皮膚に効果をもたらす機能性食品として使用できます。

関連する研究によると、カンクン「寿命を延ばす奇跡のハーブ」として知られる一般的なハーブです。 その主成分は、シスタノシドなど様々な効果があります。抗酸化物質, 抗炎症薬、 と免疫機能の促進。 シスタンシュとのメカニズム 美白カンクサの抗酸化作用にあり配糖体。 人間の皮膚のメラニンは、次の物質によって触媒されるチロシンの酸化によって生成されます。チロシナーゼ、酸化反応には酸素の関与が必要なため、体内の酸素フリーラジカルはメラニン生成に影響を与える重要な要素になります。 シスタンケには抗酸化物質であるシスタノシドが含まれており、体内のフリーラジカルの生成を減らすことができます。メラニンの生成を抑制する.

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キーワード:カボチャ・モスカタ。 日本かぼちゃ。 カボチャ種子油; 水性酵素抽出; 脂肪酸; 酸化防止剤。 老化防止

1. はじめに

カボチャはウリ科ウリ属に属し、メキシコ北部で栽培され、ヨーロッパ、西アメリカ、アジアに広がった一般的で有名な植物です [1]。 カボチャは、トコフェロール、カロテノイド、-シトステロールなどの植物化学物質に加え、タンパク質、炭水化物、脂質、繊維などの栄養素を豊富に含む機能性食品と考えられています[2]。 カボチャのさまざまな部分に含まれる植物栄養素には薬理学的活性があることがわかっています[2]。 カボチャの皮抽出物は、動物モデルにおいて有益な火傷効果を示しました[3]。 カボチャの果肉は、抗酸化作用、抗炎症作用、抗血管新生作用 [2] に加え、マウスの抗疲労作用 [4] を示しました。 さらに、カボチャの種は、心血管系死亡のリスクを低下させる必須脂肪酸とフィトステロールの優れた天然供給源です[5、6]。 パンプキンシードオイルは、カボチャの種子の加工の副産物であり、さまざまな脂肪酸や、カロチン、トコフェロール、ビタミンB、ルテイン、フィトステロール、その他のミネラルなどの生理活性化合物が豊富に含まれています[7,8]。 このオイルは、抗酸化作用、抗炎症作用、抗菌作用、および創傷治癒作用を発揮します [1,9]。 さらに、高血圧、糖尿病、がんなどの病気に対していくつかの健康上の利点があります[8、10]。

種子油を抽出するためのさまざまな方法が開発されており、これには冷間圧搾法 [11] や高圧抽出 [12] などの機械的方法が含まれます。 ヘキサン、酢酸エチル、アセトン、メタノールなどの有機溶媒を使用した種子油の溶媒抽出も文書化されています[13、14]。 酵素支援抽出は、環境に優しく安全な技術であるため、植物油産業の代替方法です。 水性酵素抽出の主なメカニズムは、植物材料の細胞壁を加水分解して破壊し、浸透性を高め、油相を含む生物活性成分を放出することです[15]。 この抽出に適用されるさまざまな酵素混合物は、ペクチナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノース、グルカナーゼ、キシラナーゼで構成されています [16、17]。 酵素混合物の最適化された条件、例えば、温度、pH、反応時間、粒子サイズ、酵素濃度も、酵素活性を強化しました[16]。 現在、この方法は多くの果物や植物の種子から油を抽出するために広く使用されています[18,19]。 以前のいくつかの研究では、高収量と効果的な薬理活性を得るためにカボチャ種子油の最適化された条件が実証されました [20,21]。

現在、人々はパンプキンシードオイルをデザートやサラダのドレッシングに入れて消費しており、化粧品の成分としても人気があります。 皮膚の老化は、酸化ストレス、DNA損傷、高度な糖化最終産物の蓄積によって引き起こされる、しわ、弾力性の喪失、水分の喪失、および肌の荒れを特徴とする複雑な生物学的プロセスである[22]。 皮膚の重要な成分であるヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチンは、それぞれヒアルロニダーゼ、コラゲナーゼ、エラスターゼ酵素によって分解され、皮膚の老化を引き起こします。 オリーブ油、ヒマワリ種子油、グレープシード油、ホホバ油などのいくつかの植物油は、水分を保持し、皮膚のバリア機能を改善し、皮膚の老化を防ぐための皮膚の化粧品として使用されています[23]。 さらに、皮膚の色素沈着は、メラニン生成に関与するヒトの変化しやすい顕著な表現型であり、チロシナーゼ酵素によって制御されています[24]。 現在、さまざまな植物抽出物が化粧品や医薬品として、メラニン生成を減少させ、美白剤として作用することが試験されています[25、26]。

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最近、C. moschata Duch. エクスポワールは、タイで一般的に栽培され人気のあるカボチャの品種の 1 つですが、その機能的価値と薬理学的特性に関する研究はほとんどありません。 さらに、水性酵素抽出は、カボチャの種から油を抽出し、高い収率と効率を得る興味深い方法です。 したがって、この研究は、C. moschata Duch からのカボチャ種子油の主成分、抗酸化物質、および薬理学的活性の決定に焦点を当てました。 元ポワール。 (タイの品種) と C. moschata (日本かぼちゃ) を水性酵素抽出法を使用して抽出しました。

2。材料と方法

2.1. 植物素材

C. モスカタ ダッチの新鮮な果実。 エクス ポワールと C. モスカタ (日本カボチャ) は、2020 年 12 月にタイのチェンマイの地元市場から購入されました。種子が収集され、すべての繊維状ストランドが除去されました。 種皮を除去した後、外皮を取り除いたカボチャの種子を洗浄し、周囲温度で乾燥させた。 さらなる実験まで、種子を密封したビニール袋に入れて保管した。 さらに、2 つの市販のカボチャ種子油サンプル (COM1 および COM2) をタイのチェンマイのスーパーマーケットから購入しました。 すべての実験は、市販の油の消費に適した日付内に実施されました。

2.2. 化学薬品および試薬 

Clostridium histolyticum 由来のコラゲナーゼ (ChC-EC.3.4.23.3)、ブタ膵臓由来のエラスターゼ (PE-EC 3.4.21.36)、N-スクシニル-Ala-Ala-p-ニトロアニリド、硫酸第二鉄 (FeSO4)、ヒアルロン酸ナトリウム塩Streptococcus equi、ウシ試験由来のヒアルロニダーゼ、Aspergillus niger 由来のペクチナーゼ (EC 3.2.1.15、5 単位/mg タンパク質以上、最適 pH=4.{{20}})、最適温度= 61 °C)、Aspergillus niger 由来のセルラーゼ (EC 3.2.1.4、0.3 単位/mg 固体以上、最適 pH=6.5、最適温度 {{ 30}}–55 °C)、Aspergillus Mito 由来のプロテアーゼ (EC 3.4.21.112、0.6 単位/mg 固体以上、最適 pH=5.1、最適温度=57.2 ◦ C)、2,20 -アジノビス3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホネート(ABTS)、2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジルハイドレート(DPPH)、2,4,6トリピリジル-s-トリアジン(TPTZ)、6-ヒドロキシ-2、5,7、8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸(Trolox)、ウシ血清アルブミン、コウジ酸、L −チロシン、L−DOPA、リノール酸、リン酸二水素ナトリウム(NaH2PO4・2H2O)、二塩基性リン酸ナトリウム、およびキノコ由来のチロシナーゼは、Sigma−Aldrich(St. 米国ミズーリ州ルイス)。 さらに、37 パーセントの塩酸、95 パーセントのエタノール、蒸留 (DI) 水、ジメチルスルホキシド (DMSO)、およびメタノールは RCI Labscan Co., Ltd. (バンコク、タイ) から購入しました。 チオシアン酸アンモニウム (NH4SCN) と塩化第一鉄 (FeCl2) は Loba Chemie Pvt. から購入しました。 Ltd. (インド、ムンバイ)。 トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンは、Merck(ダルムシュタット、ドイツ)から購入した。

2.3. 水性酵素抽出

両方の C. moschata Duch からのカボチャ種子油。 Ex Poir と C. moschata (日本カボチャ) は、Kanopka らによる以前の研究の酵素加水分解パラメーターを使用した水性酵素抽出法によって抽出されました。 (2016)、酵素濃度、酵素と基質の比、反応温度、pH、反応時間を含みます [21]。 ペクチナーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼを含む 3 つの異なるタイプの酵素を 1:1:1 の重量比で組み合わせて、酵素の濃縮カクテルを生成しました。 その後、得られた濃縮カクテルを脱イオン水で希釈して、2パーセントw/wの水性酵素混合物を生成した。 次いで、外皮のないカボチャの種を、得られた水性酵素混合物に1:1の重量比で添加した。 次いで、混合物を室温でMoulinex DB81ブレンダーを使用して均一になるまで細かく粉砕した。 次に、得られたスラリーの pH を 0.1 M HCl を使用して 4.7 に調整し、54 °C で 15 時間インキュベートしました。 スラリーを室温まで冷却した後、11,500×gで10分間遠心分離した。 油相である上澄みの上層を収集した。 抽出プロセス中に生成されたクリームは乳化されず、マイクロピペットを使用してサイフォンで除去されました。 カボチャの種の残留物を、真空下でワットマン No.1 濾紙を通して濾過することによって除去した[21]。 C. moschata Duch からのカボチャ種子油。 Ex Poir (PSO1) および C. moschata (日本かぼちゃ) (PSO2) は、さらなる実験まで室温で十分に密閉された耐光性容器に保管されました。

2.4. 脂肪酸メチルエステル/ガスクロマトグラフィー質量分析 (FAME/GC/MS) 法を使用したカボチャ種子油の化学組成の決定

カボチャ種子油の脂肪酸組成は、脂肪酸メチルエステル/ガスクロマトグラフィー質量分析 (FAME/GC/MS) 法を使用して測定されました。 FAME は、メタノールによる脂肪の酸触媒エステル交換反応によって誘導される脂肪酸エステルの一種です。 この研究では、カボチャ種子油 (PSO1、PSO2、COM1、および COM2) を、メタノール中の 0.5 M NaOH 溶液を 100 °C で 15 分間添加することによってけん化しました。 。 冷却後、油サンプルをメタノール溶液中の三フッ化ホウ素 (BF3) で 10 °C で 1 分間誘導体化し、FAME 製品を形成しました。 冷却し、飽和NaClおよびヘキサンを添加した後、FAMEをヘキサン相に分配し、注射用バイアルに収集した。 FAME 抽出物は、次の条件下で GC/MS 技術を使用して分析されました: キャピラリー カラム寸法 (TR-FAME、サイズ 60 m × 0.25 mm、粒子サイズ 0.25- μm)、50 °C の実行温度プログラム; 10 °C/min のランプ 1 速度で 180 °C まで 2 分間保持し、15 分間保持。 ランプ 2 の速度 4 °C/min、最終温度 230 °C、22.50 分間保持。 ヘリウムをキャリアガスとして流量 1.0 mL/min で使用しました。 オイルサンプルは、オートサンプラーにより 235 °C でスプリットレスモード (スプリット比 1:20、スプリットフェロー 20 mL/min) で注入されました。 70 eV で動作するエレクトロスプレー イオン化 (ESI) 源を備えた MS 検出器は、イオン源とトランスファー ラインの温度をそれぞれ 200 °C と 220 °C に設定し、m/z 範囲の質量スペクトルを記録しました。 38~600。 分析された化合物は、その質量スペクトルを公開データと比較することによって割り当てられました (米国国立標準技術研究所、2008 年)。 組成パーセントは、トータルイオンクロマトグラム (TIC) のピークを積分することによって計算されました。 すべての測定は、タイのバンコクにあるチュラロンコン大学ハラール サイエンス センターの研究およびサービス研究所によって、ハラール GMP/HACCP およびハラール QHS/ISO 22000 に基づいて実行されました。

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2.5. 抗酸化活性の測定

2.5.1. 2、2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル(DPPH)ラジカル消去アッセイ

DPPH ラジカル (DPPH・) 消去活性は、Chaiyana らによって確立された方法を使用して測定されました。 (2017年)[27]。 簡単に説明すると、DMSO に溶解した油サンプル (PSO1、PSO2、COM1、COM2) 20 μL とリノール酸を、96- ウェル プレート内で 167 μM DPPH エタノール溶液 180 μL と混合し、30 分間インキュベートしました。暗闇の中で室温。 アスコルビン酸 (1 mg/mL) を陽性対照として使用しました。 光学密度(OD)は、マイクロプレートリーダー(Microplate Reader EZ Read 2000、Biochrome、England)を使用して520 nmで測定した。 実験は 3 回ずつ行われ、3 回の独立した実験が行われました。 DPPH 阻害のパーセンテージは、式 (1) を使用して計算されました。

DPPH 阻害 (パーセント)={[(ODA − ODB) − (ODC − ODD)]/(ODA − ODB)} × 100、(1)

ここで、ODA は、DI 水と DPPH・溶液を含む混合物の OD です。 B は、脱イオン水と DMSO を含む混合物の ODB です。 C は、油サンプルと DPPH・溶液を含む混合物の ODC です。 ODD は、油サンプルと DMSO を含む混合物の OD です。

2.5.2. 2、20 -アジノビス-3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸(ABTS)アッセイ

ABTSカチオンラジカル(ABTS・plus)消去活性は、Chaiyanaらによる比色法により測定した。 (2017) および Paradee ら。 (2019) [27,28] に若干の変更を加えています。 ABTS・plus は、2 mL の 7 mM ABTS と 3 mL の 2.45 mM 過硫酸カリウムを加えて生成し、暗所、室温で 16 ~ 24 時間インキュベートしました。 得られたABTS・plusを続いてエタノールで希釈して、750nmで0.7±0.1のODを得た。 簡単に説明すると、DMSO に溶解した油サンプル (PSO1、PSO2、COM1、COM2) 20 µL とリノール酸を、96- ウェル プレート内で 180 µL の ABTS• とエタノール溶液と混合し、室温で 5 分間インキュベートしました。 。 ODは、マイクロプレートリーダー(Microplate reader EZ Read 2000、Biochrome、England)を使用して750nmで測定した。 アスコルビン酸 (1 mg/mL) を陽性対照として使用しました。 標準曲線は、2.5 ~ 30 μg/mL の範囲のさまざまな濃度の Trolox に対して 750 nm での吸光度をプロットすることによって作成されました。 ABTS・プラス消去活性は、Trolox 標準曲線 (R2=0.9922) から計算され、Trolox 等価抗酸化能 (TEAC) として表されました。 実験は 3 回ずつ行われ、3 回の独立した実験が行われました。

2.5.3. 第二鉄還元抗酸化力 (FRAP) アッセイ

各サンプルの鉄還元抗酸化力 (FRAP) は、Chaiyana らによる以前の研究に記載されている FRAP アッセイを使用して決定されました。 (2017) これは Saeio らからわずかに変更されました。 (2011) [27,29]。 FRAP 試薬は、300 mM 酢酸緩衝液 (pH 3.6)、40 mM HCl 中の 10 mM 2,4,6 トリピリジル-s-トリアジン (TPTZ)、および 20 mM FeCl3 を 10:1:1 の割合で混合することによって新たに生成しました。 この研究では、20 μL の油サンプル (PSO1、PSO2、COM1、COM2) とリノール酸を 96- ウェル プレート内で 180 μL の FRAP 試薬と混合し、暗所、室温で 5 分間インキュベートしました。 ODは、マイクロプレートリーダー(Microplate reader EZ Read 2000、Biochrome、England)を使用して595nmで測定した。 アスコルビン酸 (1 mg/mL) を陽性対照として使用しました。 標準曲線は、595 nm での吸光度を、0.003 ~ 0.5 mM の範囲のさまざまな濃度の硫酸第二鉄 (FeSO4) に対してプロットすることによって作成されました。 FRAP 値は FeSO4 標準曲線 (R2=0.9965) から計算され、等価容量 (EC1) として表されました。 実験は 3 回ずつ行われ、3 回の独立した実験が行われました。

2.5.4. チオシアン酸第二鉄 (FTC) アッセイ

脂質過酸化の抑制は、チオシアン酸第二鉄 (FTC) 法によって調査されました。 この方法は、Osawa et al. によって記載された手順に従って実行されました。 (1981) [30] に若干の修正を加えたもの。 混合物は、50 μL の油サンプル (PSO1、PSO2、COM1、COM2) とリノール酸、DMSO 中の 50 パーセントのリノール酸 50 μL、10 パーセントのチオシアン酸アンモニウム (NH4SCN) 水溶液 50 μL で構成されていました。 、および 2 mM 塩化第一鉄 (FeCl2) 50 μL。 次に、混合物を 37 ± 2 °C で 1 時間インキュベートし、マイクロプレート リーダー (Microplate Reader EZ Read 2000、Biochrome、England) を使用して 500 nm で OD を測定しました。 - トコフェロール (0.025 ~ 0.1 mg/mL) を陽性対照として使用しました。 実験は 3 回ずつ行われ、3 回の独立した実験が行われました。 脂質過酸化阻害活性は、式 (2) を使用して計算されました。
脂質過酸化阻害 (パーセント)={[(ODA − ODB) − (ODC − ODD)]/(ODA − ODB)} × 100、(2)
ここで、ODA はリノール酸、NH4SCN、および FeCl2 を含む混合物の OD です。 ODB は DMSO の OD です。 ODC は、油サンプル、リノール酸、NH4SCN、および FeCl2 を含む混合物の OD です。 ODD は、油サンプルと DMSO を含む混合物の OD です。

2.6. アンチエイジング活動の決定

2.6.1. 抗ヒアルロニダーゼ活性

抗ヒアルロニダーゼ活性の測定は、Chaiyana et al. によって以前に記載されているように実行されました。 (2020) [31]。 まず、20 μL の油サンプル (PSO1、PSO2、COM1、COM2) を 100 μL の 15 U/mL ヒアルロニダーゼ溶液と混合し、37 °C で 10 分間インキュベートしました。 インキュベーション後、20 mM リン酸緩衝液 (pH 5.35) に溶解した 0.03 パーセント w/v ヒアルロン酸 100 μL を添加し、37 °C で 45 分間インキュベートしました。 その後、1 mLの0.1パーセントウシ血清アルブミンを添加し、室温で10分間インキュベートした。 OD は、マルチモード検出器 (Beckman Coulter DTX880、米国カリフォルニア州フラートン) を使用して 600 nm で測定しました。 オレアノール酸 (0.25 パーセント w/v) を陽性対照として使用しました。 実験は 3 回ずつ行われ、3 回の独立した実験が行われました。 ヒアルロニダーゼ阻害のパーセンテージは、式 (3) を使用して計算されました。

ヒアルロニダーゼ阻害 (パーセント)={[(ODA − ODB) − (ODC − ODD)]/(ODA − ODB)} × 100、(3)
ここで、ODA は、脱イオン水、ヒアルロニダーゼ溶液、およびヒアルロン酸を含む混合物の OD です。 ODB は、脱イオン水とリン酸緩衝液 (pH 5.35) を含む混合物の OD です。 ODC は、油サンプル、ヒアルロニダーゼ溶液、およびヒアルロン酸を含む混合物の OD です。 ODD は、油サンプルとリン酸緩衝液 (pH 5.35) を含む混合物の OD です。

2.6.2. 抗コラゲナーゼ活性

抗コラゲナーゼ活性の測定は、Chaiyana et al. によって確立されたプロセスに従って実行されました。 (2019) および Thring ら。 (2009) 若干の変更を加えています [32,33]。 簡単に説明すると、20 μL の油サンプル (PSO1、PSO2、COM1、COM2) を、Clostridium histolyticum 由来の 0.1 U/mL コラゲナーゼ溶液 20 μL と混合し、37 °C で 15 分間インキュベートしました。 インキュベーション後、80 μL の 50 mM トリシンバッファー (400 mM NaCl および 10 mM CaCl2、pH 7.5) および 40 μL の N-[3-(2- フリル) アクリロイル]-Leu-Gly- Pro-Ala (FALGPA) 基質溶液を添加しました。 OD を 340 nm で直ちに検出し、マイクロプレート リーダー (Microplate Reader EZ Read 2000、Biochrome、England) を使用して 20 分間連続測定しました。 オレアノール酸 (1% w/v) を陽性対照として使用しました。 実験は 3 回ずつ行われ、3 回の独立した実験が行われました。 コラゲナーゼ阻害のパーセンテージは、式 (4) を使用して計算されました。

コラゲナーゼ阻害 (パーセント)=[(ODA − ODB)/ODA] × 100、(4)
ここで、ODA は、油サンプル、コラゲナーゼ溶液、トリシン緩衝液、および FALGPA 基質を含む混合物の OD です。 ODBは、DMSO、コラゲナーゼ溶液、トリシン緩衝液、およびFALGPA基質を含む混合物のODである。

2.6.3. 抗エラスターゼ活性

抗エラスターゼ活性の測定は、Chaiyana et al. によって確立されたプロセスに従って実行されました。 (2019) および Thring ら。 (2009) に若干の変更を加えました [32,33]。 簡単に説明すると、10 μL の油サンプル (PSO1、PSO2、COM1、COM2) をブタ膵臓由来の 0.03 U/mL エラスターゼ溶液 40 μL、次に 50 μL の 200 mM Tris-HCL 緩衝液 (pH 8.0) および 100 μL の0.8mMのN-スクシニル-Ala-Ala-Ala-p-ニトロアニリド(AAAPVN)基質溶液を添加した。 OD は 410 nm で直ちに検出され、その後マイクロプレート リーダー (Microplate Reader EZ Read 2000、Biochrome、England) を使用して 20 分間継続的に測定されました。 オレアノール酸 (1% w/v) を陽性対照として使用しました。 実験は 3 回ずつ行われ、3 回の独立した実験が行われました。 エラスターゼ阻害のパーセンテージは、式 (5) を使用して計算されました。

エラスターゼ阻害 (パーセント)=[(ODA − ODB)/ODA] × 100、(5)
ここで、ODA は、油サンプル、エラスターゼ溶液、トリス塩酸緩衝液、および AAAPVN 基質を含む混合物の OD です。 ODBは、DMSO、エラスターゼ溶液、トリス-HCl緩衝液、およびAAAPVN基質を含む混合物のODである。

2.7. 抗チロシナーゼ活性の測定

天然抽出物の美白効果は、Saeio et al. に従って実施された抗チロシナーゼ活性測定によって確立されました。 (2011)およびLaosirisathianら。 (2020) [29,34]。 この研究では、L-チロシンと L-DOPA がチロシナーゼ酵素の基質でした。 簡単に説明すると、10 μL の油サンプル (PSO1、PSO2、COM1、COM2) を 96- ウェル プレート内で 30 μL のチロシナーゼと混合し、室温で 10 分間インキュベートしました。 インキュベーション後、2.5 mM の L-チロシンまたは L-DOPA である基質 100 μL を添加し、30 分間インキュベートしました。 ODは、マイクロプレートリーダー(Microplate reader EZ Read 2000、Biochrome、England)を使用して450nmで測定した。 コウジ酸 (20 μg/mL) をポジティブコントロールとして使用しました。 実験は 3 回ずつ行われ、3 回の独立した実験が行われました。 チロシナーゼ阻害のパーセンテージは、式 (6) を使用して計算されました。

チロシナーゼ阻害 (パーセント)={[(ODA − ODB) − (ODC − ODD)]/(ODA − ODB)} × 100、(6)
ここで、ODA は DMSO、チロシナーゼ酵素、および L-チロシンを含む混合物の OD です。 ODB は、チロシナーゼ酵素と pH 6.8 の PBS を含む混合物の OD です。 ODC は、油サンプル、チロシナーゼ酵素、および L-チロシンを含む混合物の OD です。 ODD は、油サンプル、チロシナーゼ酵素、および pH 6.8 の PBS を含む混合物の OD です。

2.8. 統計分析

すべてのデータは平均±標準偏差 (SD) として示されました。 統計的有意性は、一元配置分散分析 (ANOVA) を使用して分析され、その後 GraphPad Prism (バージョン 8.0、GraphPad ソフトウェア) を使用して Tukey の事後検定が行われ、p < 0.05 が考慮されました。統計学的に重要な。

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3。結果と考察

3.1. パンプキンシードオイルの特徴

この研究では、有機溶媒抽出の代わりに水性酵素抽出を使用して、C. moschata Duch からカボチャ種子油を抽出しました。 Ex Poir (PSO1) および C. moschata (PSO2) は、シンプルで効果的かつ生産的なプロセスであるためです [15,21]。 PSO1は粘度の低い暗褐色の液体であったのに対し、PSO2は粘度の低い緑褐色の液体であった。 どちらのパンプキンシードオイルも特有の臭いがありました。 PSO1 および PSO2 の収率は、それぞれ 17.7 パーセント v/w および 15.6 パーセント v/w でした。 油とは別に、カボチャの種にはさまざまな栄養成分が含まれていることが報告されています。 C. モスカタの最も近い組成は主に炭水化物 (39.51 パーセント) で、次に脂肪 (28.49 パーセント)、タンパク質 (19.23 パーセント)、水 (7.67 パーセント)、および灰分 (5.18 パーセント) が続きます [35]。 しかし、溶媒と機械的圧搾を使用した以前の研究と比較して、本研究では C. モスカタ油の収量が低いことが明らかになりました。 溶媒抽出は種子から最大 98 パーセントの油を抽出する最も効果的な油抽出方法であると記載されていますが、溶媒残留物と生成された油の純度に関していくつかの問題があります [36]。 さらに、抽出プロセスで使用される溶媒は、生成される油の収量に影響を与えました。 ヘキサン、石油エーテル、石油ベンゼン、シクロヘキサン、イソプロピルエーテル、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、プロパン-2-オール、およびアセトンで抽出すると、43.4〜64.4パーセントが得られました[37,38]。 したがって、溶媒抽出よりもコールドプレスの方が適していました。 ただし、コールド プレスでは、スクリュー プレスの使用の初期段階でいくつかの複雑な問題が発生する可能性があります [39]。 したがって、水性酵素抽出は、コールドプレス油 (33.5 パーセント) と比較して、より高いカボチャ種子油含量 (36.0 パーセント) を生成するため、代替抽出方法となる可能性があります [21]。 水性酵素抽出のプロセスはコールドプレスよりも複雑でしたが、比較的安価な投資コスト、市販の酵素製剤のコストの継続的な削減、ユニークで価値のある植物化学成分を同時に単離できる可能性、および問題への対処が含まれます。グリーンテクノロジーの実装に対する広範な要望[21]。 予備研究では、セルラーゼ、ペクチナーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼなどのいくつかの酵素が、植物の細胞壁構造を破壊して植物からの生物活性抽出を高めるためによく使用されていることが記載されています[16、17]。 したがって、我々は、Kanopka らによって以前に記載されているように、ペクチナーゼ、セルラーゼ、およびプロテアーゼ (1:1:1) を含む酵素混合物を使用して種子油を抽出するようにこの研究を設計しました。 (2016) は、カボチャ種子油の最高収量を得るために酵素加水分解条件を最適化しました [21]。 さらに、この方法は、ここでは「グリーン抽出」と呼ばれる、溶媒抽出に代わるより安全で環境的に持続可能な代替方法を示しています。

3.2. パンプキンシードオイルの化学組成

脂肪酸組成分析では、水性酵素抽出法を用いたカボチャ種子油(PSO1およびPSO2)と、コールドプレス抽出により製造された市販のカボチャ種子油(COM1およびCOM2)を比較分析しました。 PSO1、PSO2、COM1、COM2 の脂肪酸組成を表 1 に示します。すべてのカボチャ種子油サンプルは、多価不飽和 (PUFA)、一価不飽和 (MUFA)、および飽和脂肪酸で構成されていました。 シス-リノール酸 (C18:2) は、すべての油サンプルの主成分でした。 脂肪酸含有量が最も高いのはCOM2(51.74パーセント)、次いでCOM1(48.00パーセント)、PSO1(39.09パーセント)、PSO2(37.63パーセント)となった。 同様に、シス-オレイン酸 (C18:1) は、特に PSO2 (37.45 パーセント) に高い割合で存在し、続いて COM1 (33.39 パーセント)、PSO1 (31.22 パーセント)、COM2 (28.64 パーセント) でした。 パルミチン酸 (C16:0) やステアリン酸 (C18:0) などの飽和脂肪酸は、各油サンプル中に少量しか見つかりませんでした。 微量の他の PUFA、MUFA、および飽和脂肪酸も観察および特定されました。

文献では、リノール酸はオメガ-6としても知られており、人体では合成できず、食事から摂取することによってのみ摂取できる必須脂肪酸です。 リノール酸は人間の健康機能にとって重要な栄養素であり、細胞膜の主要成分であるセラミドの前駆体、ビタミンD、およびさまざまなホルモンに関与しています[40,41]。 動物実験では、リノール酸欠乏が皮膚の鱗状やかゆみを引き起こす可能性があることが示されています[23]。 さらに、植物油からのリノール酸は、皮膚の炎症や座瘡の予防とともに、皮膚の創傷治癒をサポートします[23]。 さらに、オレイン酸、またはオメガ-9は、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患の予防に有益です[42]。 実際、オレイン酸は創傷部位における一酸化窒素の生成を大幅に減少させ、その結果、創傷の閉鎖が速くなりました[43]。 これらのデータは、リノール酸(オメガ-6)とオレイン酸(オメガ-9)を豊富に含むカボチャ種子油が潜在的な健康上の利点を示すことを裏付けています。

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私たちの調査結果によると、カボチャ種子油 (PSO1、PSO2、COM1、COM2) は、リノール酸 (C18:2)、オレイン酸 (C18:2)、パルミチン酸 (C16:0) などの多くの脂肪酸で構成されています。ステアリン酸 (C18:0) はカボチャ種子油に含まれる一般的な成分です [44]。 すべての油サンプルではリノール酸 (オメガ-6) とオレイン酸 (オメガ-9) が優勢でした。 リノール酸の量が最も多いのは COM2 で、次に COM1、PSO1、PSO2 が続きます。 また、オレイン酸の量が最も多かったのは PSO2 で、次いで COM1、PSO1、COM2 でした。 これらの結果は、カボチャ種子油の水性酵素抽出では、コールドプレス抽出よりもリノール酸がわずかに少ないものの、オレイン酸は含まれていないことを説明しています。 水性酵素抽出によるカボチャの種のリノール酸含有量が市販の油サンプルよりも低い理由は、抽出プロセスの違いによるものでした。 以前の研究では、異なる抽出物から得たカボチャ種子油中の不飽和脂肪酸、特にオレイン酸とリノール酸の量に不一致があることが判明した[39]。 オレイン酸の含有量は、コールドプレスされたカボチャ種子油の 28.19 パーセントからペンタンで抽出されたカボチャ種子油の 30.56 パーセントまでの範囲でしたが、リノール酸の含有量は、ペンタンで抽出されたカボチャ種子油の 43.86 パーセントの範囲でした。コールドプレスされたカボチャ種子油では 46.67 パーセントに達します [39]。 抽出方法の違いとは別に、抽出プロセスで使用される溶媒と種子の成熟時の温度も植物種子のリノール酸含有量に影響を与えます。 以前の研究では、石油エーテルではリノール酸含有量が低い亜麻仁油 (26.2 パーセント) が生成されるのに対し、n-ヘキサンではリノール酸含有量が 46.5 パーセントという矛盾した結果が得られることが強調されました [45]。 さらに、リノール酸はヒマワリの種子の成熟中の温度に反比例します [46]。

さらに、相対的な研究により、脂肪酸組成に関する化学組成から、ジエチルエーテルを使用して抽出されたカボチャ種子油 (C. maxima) には、リノール酸とオレイン酸がそれぞれ 47.45 パーセントと 35 パーセント存在することが判明しました [47] 。 Akinらによると、 (2018) によると、リノール酸の含有量は 53.19 パーセントから 53.27 パーセントの範囲であり、次にオレイン酸が続き、これも低温圧搾された C. pepo L. 種子油抽出物中に 27.52 パーセントから 27.59 パーセントの範囲で多量に存在していました [48] ]。 したがって、この研究における水性酵素抽出でも、以前の研究で言及された溶媒抽出やコールドプレス抽出よりも低い脂肪酸収率が得られました。 品種比較では、PSO1 (C. moschata Duch. Ex Poir) が PSO2 (C. moschata、または日本カボチャ) よりも多量のリノール酸を示すことがわかりました。 逆に、PSO2 は PSO1 よりも多量のオレイン酸を示しました。 重要なことに、脂肪酸プロファイルとカボチャ種子油の量の変動は、特定の品種の起源、気候条件、収穫後の管理に依存していました[49]。 異なる抽出方法から得られるカボチャ種子油の脂肪酸プロファイルの違いとは別に、水性酵素技術による油にはフィトステロールとトコフェロールが豊富に含まれていることが報告されています[50]。 したがって、グリーン抽出法から生成された PSO1 および PSO2 は、さらなる用途のための代替カボチャ種子油として提案されています。


詳細については: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

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