3. ディスカッション

プランバギンは植物由来の二次代謝産物であり、抗炎症、抗がん、抗アレルギー、抗菌活性などのいくつかの生物学的機能を示します [8,9]。 しかし、プルンバジンが色素沈着過剰および黒色腫に関連するメラニン生成を阻害する効果があるかどうかは不明でした。 本研究では、プルンバギンがB16F10黒色腫細胞のメラニン生成を強力に抑制することを実証し、この研究はプルンバギンの抗炎症作用、抗アレルギー作用、抗菌作用、抗メラニン生成作用に基づいたスキンケア化粧品の開発の機会を提供する可能性があります。

関連する研究によると、カンサスは「寿命を延ばす奇跡のハーブ」として知られる一般的なハーブです。 主成分はシスタノシドで、抗酸化作用、抗炎症作用、免疫機能促進作用などさまざまな作用があります。 シスタンケと美白のメカニズムは、シスタンケ配糖体の抗酸化作用にあります。 人間の皮膚のメラニンはチロシナーゼによるチロシンの酸化によって生成されますが、その酸化反応には酸素の関与が必要なため、体内の酸素フリーラジカルがメラニン生成に影響を与える重要な因子となります。 シスタンケには抗酸化物質であるシスタノシドが含まれており、体内のフリーラジカルの生成を減らし、メラニンの生成を抑制します。

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メラニン生成の上方制御は、血中および腫瘍組織中のチロシナーゼレベルが過剰発現している悪性黒色腫でよく観察されるため、メラニン生成が悪性黒色腫の化学療法の潜在的な標的であることは明らかです [1]。 本研究では、プルンバジンがメラニン生成に関連する転写機構とは独立してチロシナーゼ活性を直接抑制することを発見しました（図6）。 したがって、我々の結果は、プルンバジンが悪性黒色腫の管理のための予防および治療戦略の潜在的な要素である可能性があることを示唆しています。 実際、黒色腫治療に対するプルンバギンの抗黒色腫効果、化学増感効果、放射線増感効果が報告されています[17-21]。

プルンバギンの抗がん作用と抗炎症作用を扱った以前の研究では、約 5 ～ 10 μM のプルンバギン (この研究で使用された濃度よりも高い) が in vitro モデルで使用されてきました [17,22] ,23]。 そこで、正常角化細胞（HaCaT）や水晶体上皮細胞（B3）など、スキンケア化粧品によって損傷を受ける可能性のある増殖細胞におけるプルンバギンの毒性作用を調査しました。 私たちの結果は、低濃度の約 0.5 ～ 1 μM のプルンバジンは正常な角化細胞や水晶体上皮細胞に対して毒性はありませんが、チロシナーゼ活性とメラニン合成を低下させるのに十分な効果があることを実証しました。 さらに、プルンバジンは、よく知られた美白剤である 1 mM アルブチンや 0.2 mM コウジ酸よりもメラニン生成を効果的に抑制することもわかりました。 これらの結果は、プルムバジンが美白化粧品の開発成分として安全に使用できることを示唆しています。

本研究では、L-DOPA酸化に基づく細胞および無細胞チロシナーゼ活性アッセイを使用して、チロシナーゼ酵素反応に対するプルンバジンの阻害効果を研究しました。 それにもかかわらず、我々は、プルンバジンがどのようにチロシナーゼ活性を阻害するかについての正確な分子機構を示唆しなかった。 このメカニズムは、プルンバジンがチロシナーゼと直接相互作用してそのオキシダーゼ活性を阻害するのか、それともチロシナーゼ活性の低下をもたらす間接的な影響を与えるのかを判断するためにさらに研究される必要があります。

4. 材料と方法

4.1. 試薬と抗体

キノコから精製された Plumbagin、-MSH (M4135)、アルブチン (A4256)、コウジ酸 (K3125)、L-DOPA (333786)、およびチロシナーゼ (T3824) は、Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) から購入しました。 MITF (#12590)、p-AKTS473 (#4060)、p-AKTT308 (#13038)、p-CREB ​​(#9198)、p-ERK1/2 (#4370)、ERK1/2 (#9102)、 H2AX (#9718)、PARP (#5625)、およびカスパーゼ-3 (#9665) は、Cell Signaling Technology (米国マサチューセッツ州ダンバーズ) から購入しました。 チロシナーゼ (sc-7833) および - チューブリン (sc-9104) は、Santa Cruz Biotechnology (米国テキサス州ダラス) から購入しました。

4.2. 細胞培養および細胞生存率アッセイ

4.3. イムノブロッティング

4.4. 細胞内および細胞外のメラニン含有量の測定

メラニン含有量は、以前に記載された方法に若干の変更を加えて測定および定量化されました [2、24]。 メラニン含有量分析のために、B16F10 細胞を 10% ウシ胎児血清を含むフェノールレッドを含まない DMEM 中で培養しました。 B16F10細胞を、プルムバギンの非存在下または存在下で-MSH処理して3または4日間培養した。 培養細胞または培地を回収し、ペレットを 10% DMSO を含む 1N NaOH に 80 °C で 1 時間溶解しました。 475 nm の吸光度リーダーを使用してメラニン含有量 (OD475) を測定し、メラニン含有量を細胞タンパク質濃度に対して正規化しました。

4.5. RNA の分離と定量的 RT-PCR

4.6. 細胞チロシナーゼ活性アッセイ

細胞チロシナーゼ活性は、以前に記載された方法に修正を加えて測定しました[25、26]。 培養B16F10細胞をプルンバジンの非存在下または存在下で-MSHとともにインキュベートし、その後細胞を洗浄し、1パーセントのデオキシコール酸ナトリウムおよび0.5パーセントのトリトンXを含むPBSで溶解しました。{{8} }。 タンパク質濃度を測定した後、50 μg のタンパク質を 2.0 mM L-DOPA および 0.1 M PBS (pH 6.8) とともに 37 °C で 1 時間インキュベートしました。 L-DOPA の酸化は、吸光度リーダーを使用して 475 nm (OD475) で測定されました。 活性は次の式を使用して測定しました: チロシナーゼ活性 (パーセント)=(サンプルの OD475/コントロールの OD475) × 100。

4.7. 無細胞チロシナーゼ活性アッセイ

4.8. DPPH ラジカル消去活性アッセイ

4.9. 統計分析

5。結論 

この研究の主な発見は、プルンバギン (i) チロシナーゼ活性を阻害することにより、-MSH 誘発メラニン合成を抑制することです。 (ii) MITF に関連した転写機構や、メラニン生成に関連する AKT および ERK1/2 活性化を含むシグナル伝達カスケードには影響を与えません。 (iii) 濃度が 5 μM 未満の場合、正常角化細胞 (HaCaT) および水晶体上皮 (B3) 細胞に毒性を引き起こしません。 まとめると、プルンバジンは、CREB-MITF 転写軸とは独立してチロシナーゼ活性を阻害することにより、-MSH 誘発メラニン合成を無効にします。 したがって、これらの結果は、美白化粧品の開発に使用することにより、色素沈着過剰を軽減するための有望で安全な天然物プルバジンを示唆しています。

略語

参考文献

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