パートⅠ：Cistanche Tubulosaフェニルエタノイド配糖体はミトコンドリア依存性およびMAPK経路によって肝細胞癌細胞のアポトーシスを誘導し、シスプラチンとの組み合わせにより抗腫瘍効果を増強します

連絡先：Audrey Hu Whatsapp / hp：0086 13880143964メール：audrey.hu@wecistanche.com

Pengfei Yuan、Changshuang Fu、Yi Yang、Aipire Adila、Fangfang Zhou、Xianxian Wei、Weilan Zhang、Jie Lv、Yijie Li、Lijie Xia、Jinyao Li

概要

カンカニクジュヨウ中国の漢方薬の一種であり、さまざまな生物学的機能を発揮します。 以前の研究では、Cistanche tubeulosaフェニルエタノイド配糖体（CTPG）さまざまな腫瘍細胞に対して抗腫瘍効果を示します。 ただし、HepG2およびBEL -7404肝細胞癌（HCC）細胞に対するCTPGの抗腫瘍効果はまだとらえどころのないです。 私たちの研究は、CTPGが細胞周期停止とアポトーシスの誘導を通じてHepG2とBEL -7404細胞の成長を有意に阻害することを示しました。これは、p38、JNK、 ERK1/2およびミトコンドリア膜電位の低下を特徴とするミトコンドリア依存性経路。 その後、シトクロムcの放出とカスパーゼ-3、-7、-9、PARPの切断がCTPG処理によって増加しました。 さらに、CTPGは、マトリックスメタロプロテイナーゼ-2および血管内皮増殖因子のレベルを低下させることにより、HepG2の移動を有意に抑制しました。 興味深いことに、CTPGは脾細胞の増殖を促進するだけでなく、シスプラチンによって誘導される脾細胞のアポトーシスを減少させました。 H22腫瘍マウスモデルでは、シスプラチンと組み合わせたCTPGは、H22細胞の増殖をさらに抑制し、シスプラチンの副作用を軽減しました。 まとめると、CTPGは、直接的な抗腫瘍効果と間接的な免疫増強効果によってHCCの増殖を抑制し、シスプラチンの抗腫瘍効果を改善しました。

キーワード

カンカニクジュヨウフェニルエタノイド配糖体、アポトーシス、MAPK経路、ミトコンドリア依存性経路、シスプラチン、免疫増強。

序章

肝臓がんは、2018年に世界で6番目に多く診断され、がんによる死亡の4番目に多い原因であると予測され、南東アジア（モンゴル、カンボジア、ベトナム）で毎年約841 000の新規症例と782000人の死亡がありました。 .1中国では、2015年に肝臓がんががん関連死の3番目に多い原因でした。2原発性肝がんの90％以上が、世界中の肝細胞がん（HCC）です。 現在、肝切除、肝移植、および経皮的切除がHCCの治療の主な方法です。 残念ながら、これらの治療法は早期肝がんと診断された患者の30％に有効ですが、進行性肝がんと診断された患者（40％を占める）は、生存期間を延長するために緩和的治療に頼らなければなりません。動脈化学塞栓療法は、アジア太平洋地域の進行性HCC患者のほとんどにとって重要かつ一般的な緩和療法です。5ソラフェニブは、進行性肝がんの治療のために2006年にFDAによって承認され、腫瘍細胞の増殖と血管を阻害するマルチキナーゼ阻害剤です。産生し、腫瘍細胞のアポトーシスを促進します。 ソラフェニブは、患者さんの生存期間を3〜5か月延長しますが、重篤な副作用があり、薬剤耐性の発生と密接に関連しています6。したがって、HCCの新薬や戦略の開発が急務です。

漢方薬（TCM）を単独で、または他の戦略と組み合わせてHCCの治療に使用されており、生存期間の延長、生活の質の向上、副作用の軽減などの臨床的利点が示されています7,8。Cistancheは、フェニルエタノイド配糖体（PhG）、イリドイド、リグニン、および抗酸化、抗炎症、抗老化、記憶増強、免疫増強機能などのさまざまな生物学的機能を持つ多糖類を含むTCMです。の主要な有効成分Cistanche、および抗酸化、抗炎症、抗アポトーシス、肝保護、および神経保護を含む複数の機能を持っています。10-12私たちのグループは次のように報告しましたCistanchetubulosaフェニルエタノイド配糖体（CTPG）メラノーマB 16- F10細胞、食道癌Eca -109細胞、およびHCC H22細胞の増殖を、invitroまたはinvivoで外因性または内因性のシグナル伝達経路を介して阻害する可能性があります。 さらに、CTPGには免疫賦活効果がありました。13-15

この研究では、invitroでHepG2およびBEL -7404細胞に対するCTPGの抗腫瘍効果とメカニズムを調査し、invitroおよびinvivoでCTPGの免疫調節機能を分析し、化学療法と組み合わせたCTPGの治療効果をさらに評価しました。 invivoでのHCCH22腫瘍マウスに対する薬物シスプラチン。 CTPGは、ミトコンドリア依存性アポトーシスとMAPKシグナル伝達経路を介してHepG2およびBEL-7404細胞の増殖を阻害できることがわかりました。 CTPGは、マトリックスメタロプロテイナーゼ-2（MMP -2）および血管内皮増殖因子（VEGF）のレベルを低下させることにより、HepG2細胞の遊走を有意に抑制しました。 さらに、CTPGは免疫細胞の増殖と活性化を促進し、マウスの免疫力を高めました。 重要なことに、シスプラチンと組み合わせたCTPGは、in vivoでのH22細胞の増殖をさらに阻害し、シスプラチンの副作用を軽減することができます。

材料および方法

動物

生後約6〜8週齢の雄BALB / c、Kunmingマウス、雌C57BL / 6マウスは、新疆医科大学（ウルムチ、新疆ウイグル自治区、中国）の動物実験センターから購入し、新疆ウイグル自治区の動物施設に室温で収容しました。 （RT）25±3度、12/12時間の明暗期間。

細胞株と細胞培養

マウスH22細胞はProcellLifeScience＆Technology Co.、Ltd.（Wuhan、Hubei、China）から購入し、ヒトHCCHepG2およびBEL-7404細胞はXinjiangKey Laboratory of Biological Resources andGeneticEngineeringから入手しました。 、Xinjiang University（Urumqi、Xinjiang、China）およびRPMI 1640培地（Gibco、USA）または10％の熱不活化胎児ウシ血清（MRC、China）、1％Lを含むDulbeccoの改変Eagle's培地（DMEM）（Gibco）で培養-グルタミン（100mM）、100U / mLペニシリン、および100ug / mLストレプトマイシン（37度、5％CO2の加湿雰囲気）。

高速液体クロマトグラフィー（HPLC）

CTPG（Upbio Tech Co.、Ltd.、Shanghai、China）の主要な化合物は、以前に報告されたようにHPLCによって認定および定量されました。13ZORBAXSB-C18カラム（25 0×4.6mm;5μm）を使用しました。移動相は、0.2％のギ酸溶液と23％から31％の勾配のメタノールで構成されていました。 合計10μLのサンプルが注入され、330nmで検出されました。 エキナコシドおよびアクテオシド標準（Yuanye、上海、中国）を使用して、CTPGの成分を分析しました。

細胞生存率の分析

HepG2およびBEL-7404細胞に対するCTPGの抗腫瘍効果は、MTT（3-（4、5-ジメチル-2-チアゾリル）-2、{{7 }}ジフェニル-2-H-テトラゾリウムブロミド）。 HepG2およびBEL-7404細胞を96-ウェルプレート（5×1 0 4細胞/ウェル）にプレーティングし、0、2 0 0、 37度で24時間インキュベートした後、それぞれ24時間および48時間の400および600 ug /mLCTPG。 約35ug/ mLのシスプラチン（Yuanye）を陽性対照として使用しました。 次に、100μLのMTT（0.5mg / mL、FBS培地を含まない培地で希釈）を各ウェルに添加し、37度および5％CO2で3時間培養しました。 インキュベーション後、プレートを1200 rpmで7分間遠心分離し、培地を除去し、200 ug / mL DMSOを各ウェルに添加して、形成されたホルマザン結晶を溶解しました。 OD490値は、96-ウェルマイクロプレートリーダー（Bio-Rad Laboratories、CA、USA）によって測定されました。 脾細胞に対するCTPGの効果を評価するために、細胞をC57BL / 6マウスから分離し、1×105細胞/ウェルの密度で96-ウェルプレートに播種しました。 脾細胞を0、200、400、600 ug / mLでそれぞれ24時間、48時間、72時間処理しました。 細胞生存率は、次の式として計算されました：細胞生存率（パーセント）=（OD処理済み/ OD未処理）×100パーセント。

Kiの検出-67

Ki {{0}}の検出は、以前の研究に従って行われました。16簡単に言うと、BEL -7404細胞は、さまざまな濃度（0、200、400、および600ug / mL）のCTPGで処理されました。またはシスプラチン（35ug / mL）。 24時間後、細胞を回収してPBSで洗浄し、Foxp3染色バッファーセット（eBioscience、USA）で製造元の指示に従って固定し、透過処理しました。 細胞内染色は、FITC結合Ki -67抗体（BD Biosciences、San Jose、CA、USA）を使用してRTで15分間実施しました。 サンプルはフローサイトメトリー（BD FACSCalibur、CA、USA）によって分析されました。

細胞アポトーシスと細胞周期の分析

HepG2およびBEL-7404細胞を、2.5×105細胞/ディッシュの密度で播種し、37度で一晩インキュベートしました。 細胞をトリプシン処理し、さまざまな濃度のCTPGで処理した後、遠心分離によって回収するか、カスパーゼ阻害剤（Z-VAD-FMK）またはカスパーゼ-3阻害剤（Ac-DEVD-CHO）（Beyotime、中国）で2時間前処理しました。 CTPG治療の数時間前。 24時間後、フローサイトメトリーによってアポトーシスが検出されました。 簡単に説明すると、収集した細胞を冷PBS（Gibco）で洗浄し、2.5μLのアネキシンV-FITCと5μLのPI-PE染色液（Solarbio、北京、中国）を含むアネキシン結合バッファーに再懸濁し、細胞をRTでインキュベートしました。暗闇の中で15分間。 細胞周期分布の分析のために、CTPG処理後に細胞を回収し、冷70％エタノールで4度で30分間固定しました。 細胞をPI（BD Biosciences）で暗所で30分間染色しました。 サンプルはフローサイトメーター（BD FACSCalibur）で分析しました。 細胞アポトーシスおよびサイクル関連タンパク質の発現レベルは、ウエスタンブロットによって検出されました。

ウエスタンブロット法

以前の研究に従ってウエスタンブロットを行った17。HCCをCTPGで24時間処理した。 氷冷PBSで2回洗浄した後、すべての付着細胞と浮遊細胞を収集し、RIPA Lysis Buffer（Beijing ComWin Biotech Co.、Ltd）で20分間氷上で溶解しました。 12000 rpmで4度で10分間遠心分離した後、ビシンコニン酸アッセイキット（Thermo Fisher Scientific、USA）を製造元の指示に従って使用して、タンパク質濃度を測定しました。 同じ濃度のタンパク質を12％SDS-PAGEで分離し、PVDFメンブレンに転写しました。 PBSTバッファー（0.05％Tween -20を含むPBS）で洗浄した後、膜を5％脱脂乳で37度で1時間ブロックし、一次抗体（Cell Signaling Technology、MA、USA）とインキュベートしました。 ）適切な希釈で一晩4度で。 PBSTで3回洗浄した後、メンブレンを対応するHRP標識二次抗体（eBioscience）と37度で2時間インキュベートしました。 ECLアッセイキット（Beyotime）を使用して標的タンパク質を検出した。 グレースケールスキャンデータは、ImageJによって取得されました。

ミトコンドリア膜電位の分析（Δψm）

Δψmは、膜透過性JC -1色素（Beyotime）によって決定されました。 簡単に説明すると、HepG2およびBEL -7404細胞を、さまざまな濃度のCTPG（0、200、400、および600ug / mL）で24時間処理しました。 すべての細胞を収集し、JC-1洗浄バッファーで洗浄しました。 細胞をJC-1蛍光プローブで製造元の指示に従ってRTで20分間染色しました。 PBSで2回洗浄した後、すべてのサンプルをフローサイトメトリー（BD FACSCalibur）で分析しました。

Hoechst33342染色

Hoechst 33342染色は、以前の研究に従って行われました16。核の形態学的変化は、膜透過性DNA結合色素Hoechst 33342（Beyotime）を使用して調べました。 簡単に説明すると、細胞を6-ウェルプレートに2mL培地で1×105細胞/ウェルの濃度で接種しました。 70％から80％のコンフルエンスに達したとき、細胞を200、400、および600ug/mLのCTPGまたはシスプラチンで24時間処理しました。 細胞をPBSで洗浄し、4パーセントの氷冷パラホルムアルデヒドで4度で10分間固定した。 PBSで洗浄した後、細胞をHoechst33342で4度で10分間染色しました。 サンプルは、蛍光倒立顕微鏡（Nikon Eclipse Ti-E、日本）で観察されました。

移行アッセイ

HCC細胞の遊走は、創傷治癒アッセイによって検出されました。 簡単に説明すると、HepG2細胞（2×1 0 4 /ウェル）を24-ウェルプレートに播種しました。 8 0パーセントのコンフルエンスに達した後、各ウェルの中央を20μLのピペットチップで1回引っ掻きました。 PBSで洗浄した後、細胞をシスプラチン（35ug / mL）またはさまざまな濃度（0、200、400、および600ug / mL）のCTPGで37度で処理しました。 24時間後、各サンプルの画像を顕微鏡（Nikon Eclipse Ti-E）で撮影しました。 細胞移動の平均距離は画像Jによって分析されました。創傷治癒のパーセンテージは次の式で計算されました：創傷治癒（パーセント）=（示された時点での1-スクラッチ領域/ 0時間でのスクラッチ領域）×100パーセント。 細胞遊走関連タンパク質MMP-2およびVEGFの発現レベルはウエスタンブロットによって検出されました。

脾細胞の増殖とアポトーシス

増殖分析のために、脾細胞を3匹のC57BL / 6マウスから分離し、CFSE（eBioscience）で染色しました。 CFSE標識細胞を24-ウェルプレートにウェルあたり1mLの培地で2×106細胞の密度で接種し、さまざまな濃度のCTPG（200、400、および600 ug / mL）で処理するか、35ugと組み合わせました。 /mLシスプラチンを72時間。 CD3-APCおよびCD19-PE（BD Biosciences）で染色した後、フローサイトメトリー分析を行いました。 アポトーシス分析のために、脾細胞をウェルプレートあたり1 mLの培地で2×106細胞の密度で24-ウェルプレートに接種し、さまざまな濃度のCTPG（200、400、および600 ug / mL）で処理するか、シスプラチンを24時間。 2.5μLのアネキシンV-FITCと5μLのPI-PE溶液で染色した後、フローサイトメトリー分析を行いました。

CTPGInVivoの安全性評価と免疫刺激活性

CTPGのinvivo免疫刺激活性を評価するために、6〜8週間の雄昆明マウスをランダムに7つのグループ（5匹のマウス/グループ）に分けました。 皮下注射（sc、200、400 mg / kg）、腹腔内注射（ip、200、400 mg / kg）、および胃内投与（ig、200、400 mg / kg）を2日ごとに合計7回適用しました。 、対照群は何の治療も受けていなかった。 マウスは一日おきに体重を測定し、マウスの状態を毎日観察した。 CTPG治療後、マウスの臓器を分離して体重を測定しました。 臓器指数は、臓器指数=臓器重量（mg）/体重（g）の式に従って計算されました。 脾細胞を収集し、カウントし、抗CD 3- APC、抗CD 19- PE、抗CD49bFITCまたは抗CD4- APC、抗CD{{で染色しました。 22}} PE、抗CD 8- FITC（BDBiosciences）。 サンプルはフローサイトメトリー（BD FACSCalibur）によって検出されました。

H22担癌マウスにおけるシスプラチンと組み合わせたCTPGの抗腫瘍効果

約6〜8週齢の雄BALB / cマウスにH22細胞を皮下注射しました（100μLPBS中のマウスあたり1。0×106）。 腫瘍体積が約60mm3に達したとき、担癌マウスをランダムに4つのグループ（6マウス/グループ）に分け、シスプラチン（4mg / kg）、CTPG（400mg / kg）、シスプラチン（4mg / kg）とCTPG（それぞれ400mg/kg）、または無治療（対照群）。 腫瘍マウスに、それぞれ5日目、7日目、9日目、11日目、および13日目にCTPGを腹腔内注射した。 シスプラチンは7日目と11日目に静脈内注射されました。 腫瘍の体積と体重を1日おきに測定した。 腫瘍体積は次のように計算されました。腫瘍体積（V）=a×b2/ 2、ここでaとbは、それぞれノギスによって測定された腫瘍の最長と最短の直径を表します。 20日目に、臓器と腫瘍を分離し、重量を測定しました。 脾細胞を収集し、カウントし、抗CD3-APCおよび抗CD19-PEまたは抗CD4-FITCおよび抗CD8-APCまたは抗CD11b-PEおよび抗Gr-1-APCまたは抗CD4-FITC、抗CD 25- APC、および抗Foxp 3- PE（BD Biosciences） 。 続いて、細胞の頻度および数をフローサイトメトリー（BD FACSCalibur）によって分析した。

統計分析

すべてのデータは、平均±平均の標準誤差（SEM）として表された。 統計分析は、Prism5。0ソフトウェアを使用した一元配置分散分析（ANOVA）を使用して実施されました。 P<.05 was="" considered="" statistically="">

結果

CTPGはinvitroでHCC細胞の増殖を阻害しました

CTPGの成分は、Cistancheのフェニルエタノイド配糖体の主成分であるエキナコシドおよびアクテオシド標準（補足図1A）を使用したHPLCによって認定および定量されました。 18ピーク保持時間とピーク面積によると、CTPGには28％のエキナコシドと9.9％のアクテオシドが含まれていました。 さらに、CTPG中の多糖類の含有量はフェノール硫酸法で34.8％でした19。MTTアッセイは、CTPGが用量および時間依存的にBEL -7404およびHepG2細胞の生存率を有意に低下させることを示しました（図1A）。 一貫して、BEL -7404細胞の増殖は、Ki -67染色によって分析されたCTPG処理によって有意に阻害されました（図1B）。 インビトロでの脾細胞の増殖に対するCTPGの効果もMTTアッセイによって分析された。 CTPGが用量依存的に脾細胞の増殖を促進することを観察しました（図1C）。

マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）シグナル伝達経路は、ヒト癌細胞の生存、分化、および薬剤耐性において極めて重要な役割を果たします20。MAPKシグナル伝達経路が増殖に対するCTPGの阻害効果に関与していたかどうかを調べるためHCC細胞の場合、MAPKシグナル経路からのさまざまなタンパク質のリン酸化レベルを、さまざまな濃度およびさまざまな時点でCTPGで処理した後のHepG2細胞で分析しました。 JNK（P-JNK）およびp38（P-p38）のリン酸化は、CTPG治療によって用量依存的に増強されました。 ERK（P-ERK）のリン酸化は、200および400ug / mL CTPG処理によってダウンレギュレーションされましたが、P-ERKは600ug / mL CTPG処理下でアップレギュレーションされました（図1D）。 さらに、P-JNK、P-p38、およびP-ERKのレベルは、時間依存的にアップレギュレーションされました（図1D）。 これらの結果は、CTPGがMAPKシグナル伝達経路を介してHCC細胞の増殖を阻害する可能性があることを示唆しています

CTPGがS期でHCC細胞周期を停止させる

さらに、CTPGが細胞周期停止の誘導を通じてHCC細胞増殖を阻害したかどうかを分析しました。 CTPGで処理した後、S期でのBEL-7404細胞の蓄積が用量依存的に観察されました。 同様に、CTPGもS期でHepG2細胞周期停止を誘発し、頻度は対照群の40.66パーセントから600ug / mL CTPG治療群の61.90パーセントに増加しました（図2A）。 サイクリンとサイクリン依存性キナーゼ（CDK）は、細胞分裂の制御と発達に重要な役割を果たし、そのうち21はG2 / M期に関連していました22。サイクリンD1の発現レベルは、CTPG治療によって用量依存的に減少しましたが、G1はS期の進行​​。 サイクリンB1、CDK1、およびCDK2の発現レベルも低下しました。 これらのタンパク質はG2/M相に関連していました（図2B）。 これらの結果は、CTPGが細胞周期停止を誘導することによりHCC細胞増殖を抑制したことを示唆した。

HCC細胞におけるCTPG活性化ミトコンドリア依存性アポトーシス経路

また、CTPGがHCC細胞のアポトーシスを誘発するかどうかを検出し、CTPGがHepG2およびBEL -7404細胞のアポトーシスを用量依存的に誘導することを発見しました（図3A）。 さらに、BaxおよびBcl -2の発現レベルは、CTPG処理によってそれぞれ用量依存的に増加および減少しました（図3B）。 HepG2細胞のアポトーシスは、CTPGで24時間処理した後、Hoechst33342染色によってさらに決定されました。 核の形態を倒立蛍光顕微鏡で観察した。 図3Cに示すように、コントロールのHepG2細胞は均一に染色され、CTPGで処理されたHepG2細胞は、シスプラチンで処理されたHepG2細胞と同様に、用量依存的にクロマチン凝縮と断片化を示しました。 これらの結果は、CTPGがHCC細胞のアポトーシスを誘導したことを示した。

ミトコンドリア外膜の完全性はBcl-2ファミリーによって厳密に制御されており、Δψmの減少は、カスパーゼカスケードを活性化してアポトーシスを誘導するシトクロムcの放出を促進します。23,24Δψmが減少すると、JC {{ 3}}ポリマー（赤色蛍光）はモノマー（緑色蛍光）に分解します25。したがって、HCC細胞のΔψmは、24時間のCTPG処理後のJC-1染色によって検出されました。 図4Aに示すように、FL -1チャネルの緑色蛍光強度はCTPG処理によって用量依存的に増加しましたが、FL-2チャネルの赤色蛍光強度は両方で用量依存的に減少しました。 BEL-7404およびHepG2セル。 逆蛍光顕微鏡観察は同様の結果を示し（図4B）、CTPGがHCC細胞のΔψmを減少させることを示しています。 その後、CTPG処理後にBEL -7404細胞とHepG2細胞の両方でシトクロムcのレベルが増加することを観察し（図4C）、CTPG処理HCC細胞でのΔψmの減少をさらに確認しました。

シトクロムcの放出は、イニシエーターカスパーゼ-9を活性化してアポトーシスを誘導することができます。26ウエスタンブロットアッセイの結果は、切断されたカスパーゼ-3、-7、および{{4}のレベルを示唆しました。 }は、切断されたカスパーゼ-8のレベルを変更せずに増加しました（図5）。 活性化されたカスパーゼ-3は、ポリ（ADPリボース）ポリメラーゼ（PARP）のDNA修復酵素を切断して、DNA修復を防ぎ、DNA損傷を蓄積します27。切断されたPARPのレベルのアップレギュレーションも観察されました。 CTPGによって誘導されるHCC細胞アポトーシスにおけるカスパーゼカスケードの役割は、カスパーゼ阻害剤（Z-VAD-FMK）とカスパーゼ-3阻害剤（Ac-DEVD-CHO）をそれぞれ使用してさらに決定されました。 Z-VAD-FMKは、CTPGによって誘導されたBEL -7404およびHepG2細胞のアポトーシスを有意に逆転させました（補足図1B）。 同様に、Ac-DEVD-CHOもCTPGによって誘導されたHepG2細胞のアポトーシスを有意に逆転させました（補足図1C）。 結果は、CTPGがミトコンドリア依存性経路によってHCC細胞のアポトーシスを誘導したことを示した。

CTPGはinvitroでHCC細胞の遊走を抑制しました

癌細胞の遊走は、腫瘍転移における重要なプロセスの1つと考えられています。 CTPGがHCC細胞の遊走に影響を与えるかどうかを判断するために、HepG2細胞の運動性を創傷治癒アッセイで評価しました。 図6AおよびBに示すように、HepG2細胞の遊走は、用量依存的にCTPG処理によって有意に阻害されました。 MMPファミリーとVEGFは腫瘍細胞の移動に重要な役割を果たします28。CTPGを24時間処理した後、MMP -2とVEGFのレベルは大幅に低下し（図6C）、CTPGが浸潤と転移を抑制する可能性があることを示唆しています。 HCCの。

CTPGはマウスの免疫力を強化しました

Cistanchedeserticola多糖類はリンパ球増殖の促進やマクロファージの活性化などの免疫調節機能を持っていることが報告されています29。T細胞とB細胞は主なリンパ球であり、それぞれ細胞性免疫応答と体液性免疫応答を仲介します。 CTPGには34.8パーセントの多糖類が含まれていました。 したがって、本発明者らは、T細胞およびB細胞の増殖に対するCTPGの効果を調べた。 補足図2Aに示すように、CTPGは、シスプラチンの存在下でも、用量依存的にT細胞とB細胞の増殖を有意に増加させました。 興味深いことに、CTPGはシスプラチンによって誘導される脾細胞のアポトーシスを有意に阻害し（補足図2B）、CTPGがマウスの免疫系に対するシスプラチンの副作用を改善できることを示しています。

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