MylabrisPhalerataPallasとMylabrisCichoriiLinnaeusを区別するためのHPLCフィンガープリントとスペクトル-抗腫瘍効果の関係
Mar 09, 2022
Jian-Yong Zhang、Qi-Hong Chen、Xian Pei1、Rong Yan、Can-Can Duan、Yun Liu4、Xiao-Fei Li
1薬学部、Zunyi Medical University、Zunyi、中国、
2教育省の基礎薬理学の主要研究所および教育省の民族医学の合同国際研究所、Zunyi Medical University、Zunyi、Guizhou、China。
3基礎医学部、Zunyi Medical University、Zunyi、中国、4Guizhou Provincial College-based Key Lab for Tumor Prevention and Treatment with Distinctive Medicines、Zunyi Medical University、Zunyi、China。
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ハイライト
この研究は、2つのMylabris種を識別するための、適用可能で信頼性が高く、より効率的なHPLCメソッドを提供します。 そして、HPLCフィンガープリントとスペクトル-抗腫瘍効果統合され、Mylabrisの新しいマーカーの3つの重要な差分マーカーが見つかりました。
概要
目的：HPLCフィンガープリントとスペクトルに基づく2つのオビゲンセイ種間の識別の評価-抗腫瘍効果関係。 方法：この研究では、ケモメトリックス分析とスペクトルを統合したシンプルで効率的な高速液体クロマトグラフィー（HPLC）メソッド-抗腫瘍効果Mylabrisの2つの種、Mylabris phalerata Pallas（MP）とMylabris cichorii Linnaeus（MC）を区別するために関係が構築されました。 結果：指紋分析では、PCAとOPLS-DAを使用した類似性とパターン認識分析を使用してMPとMCの違いを評価するために、14の特徴的なピークが選択されました。 中国の10地域からのサンプルのHPLCクロマトグラムは、MPとMCの違いを示し、7つの特徴的な化学マーカーが見つかりました。 スペクトルで-抗腫瘍効果関係分析では、4つの活動マーカーがIC50の低下に重要な役割を果たし、灰色の関係分析と多変量線形回帰分析によるMylabrisの抗腫瘍成分である可能性があります。 スペクトル効果関係の結果と組み合わせたケモメトリックス分析は、ピーク2（シトシン）、4（不明）、および14（不明）が2種のオビゲンセイを区別するための重要な示差マーカーであることを示しました。
結論：この方法は、MPとMCを区別するために適用可能で、信頼性が高く、より効率的であり、昆虫薬の品質管理を容易にするための新しい方法を提供します。
キーワード：HPLC、フィンガープリント、スペクトル-抗腫瘍効果、オビゲンセイ、差別
バックグラウンド
中国ではバンマオと呼ばれるミラブリスは、癤、根深い潰瘍、腹部腫瘤を治療するための伝統的な漢方薬（TCM）として使用されており、重要です抗腫瘍エージェント。 また、ヨーロッパでは民間療法として広く使用されています[1]。 ミラブリスの主要な有効成分はカンタリジンであり、これは効果的です抗腫瘍化合物[2]。 現代の薬理学的研究は、オビゲンセイが複数の活性を持っており、その二重性のために腫瘍の治療に高く評価されていることを示しています抗がん剤特性と白血球数を増やす能力[3-4]。 現在、Mylabrisは、Aidi注射やCompound ban maoカプセルなど、中国の一部の臨床抗がんTCM処方で広く使用されています。
中華人民共和国の薬局方（2015年版）によると、Mylabrisは、植物学的特性、個体群動態、および生態学が異なるMylabris phalerata Pallas（MP）とMylabris cichorii Linnaeus（MC）の乾燥体として定義されています[ 5-6]。 オビゲンセイも毒性の高い薬です。 中国で入手可能な薬剤は通常MPとMCの混合物であるため、2つの種の化学的および活性の違いを特定する必要があります。
TCMには多くの既知および未知の成分が含まれているため、それらの化学成分の定量的プロファイル分析は重要な課題をもたらします。 高速液体クロマトグラフィー（HPLC）フィンガープリントは、複雑なシステム内のほとんどの化合物の全体的なプロファイル特性のため、TCMの品質管理（QC）において重要な役割を果たします。 さらに、TCMのフィンガープリント分析は、種の認証と品質評価に優れた再現性と安定性を備えており、世界保健機関、中国国家食品医薬品局（SFDA）、および欧州医薬品評価機関（EMEA）に受け入れられています。 最近、HPLCフィンガープリントを組み合わせたケモメトリックス分析がQCのために開発され、さまざまな複雑な天然源を識別しています[7]。 ただし、有効成分の違いを反映できないため、TCMの違いを区別することは効果的ではありません。これは、臨床使用にとってより重要です。 これまでのところ、スペクトル-抗腫瘍 効果関係アプローチは、TCMの生物活性成分を首尾よく特定するために使用されてきました[8]。 ケモメトリックス分析およびスペクトル-抗腫瘍効果の関係と組み合わせたHPLCフィンガープリントは、TCMの複数のソースの違いをよりよく解明します。
最近、カンタリジンの含有量を測定するためのいくつかの方法が報告されています。これは、オビゲンセイの品質を測定するために使用できます[9]。 一部のクロマトグラフィーフィンガープリントもQCに適用されました[10-11]。 1つの研究だけが、HPLCに基づくMylabrisの水溶性化合物のグラジエント溶出を含む方法を利用しました。 一方、使用されたサンプルは10個のみで、MCサンプルは使用されませんでした[12]。 私たちの知る限り、化学組成と活性に基づいてMPとMCを区別することはこれまで研究されていませんでした。
この研究は、ケモメトリックス分析とスペクトルを組み合わせたHPLCフィンガープリントを使用して、2種類のオビゲンセイを識別する簡単で効率的な方法を開発することを目的としています。抗腫瘍効果MylabrisのQCの基礎を提供する関係。 この方法は、他のTCMのQCマーカーを識別するためにも適用できます。
材料および方法
合計で、Mylabris phalerata Pallas（MP）とMylabris cichorii Linnaeus（MC）の20バッチが中国のさまざまな州から収集され（表1）、Xiao-FeiLi教授によって特定されました。 バウチャーの標本は私たちの研究室に預けられました。
参照標準のシトシン、ウリジン、グアノシン、およびアデノシンは、ChengduPush Biotechnology Co.、Ltd.（Chengdu、China）から購入しました。 HPLCグレードのアセトニトリルとメタノールはThermofisherScientific（Fairlawn、NJ、USA）から購入しました。 研究全体を通して、ワトソンの純水を使用しました。 他の化学薬品および溶媒は分析グレードであり、アラジン試薬（上海、中国）、成都ケロン試薬（成都、中国）およびシノファーム化学試薬（北京、中国）から入手しました。
装置とクロマトグラフィー条件
HPLC分析は、Agilent 126 0 InfinityHPLCシステムを30度で使用し、Phenomenex Synergy Polar-RP80（4.6mm×250mm、5μm）でフィンガープリントを作成しました。 分離には、溶離液A（水/氷酢酸、100：1、v / v）およびB（メタノール）による線形グラジエント溶出を使用しました。 グラジエントプログラムは次のように開発されました：0-1分、3。0-4。6パーセントB; 1-9分、4。6-6。8パーセントB; 9-25分、6。8-51。0パーセントB; 25-30分、51。0-100パーセント。 移動相の流量は1.0mL/minでした。 クロマトグラムは254nmでモニターしました。 15分の平衡化期間の後、10μLのサンプルを注入に使用しました。
サンプル準備
乾燥したサンプルを粉砕して粉末にし、各粉末サンプル2.5gを50 mLの75％エタノールで毎回1.5時間還流して2回抽出しました。 抽出したサンプルを混合し、減圧下で20mLに濃縮しました。 次に混合物を80mLの水で4度下で24時間沈殿させた。 続いて、抽出物を3000 g min -1で10分間遠心分離し、上清を分離しました。 上澄みを減圧下で25mLに濃縮した。 最後に、HPLC分析の前に、上清を0.22μmミリポアフィルムでろ過しました。
方法論の検証
HPLCメソッドは、精度、再現性、および安定性について検証されました（0時間、2時間、4時間、8時間、12時間、24時間）。 バリデーションは、リテンションタイム（RT）とピーク面積（PA）に基づいて推定されました。 最後に、複数の化合物の統合された化学的特性を識別するために、Mylabrisの20バッチの化学的フィンガープリントが確立されました。 分析のために、いくつかのケモメトリックス技術が化学指紋に導入されました。
パターン認識分析
対応のないスチューデントのt検定を使用して、2種類のピーク面積の差を統計的有意性について評価しました。 0。05未満のp値は統計的に有意であると見なされました。 古典的な教師なし手法として、主成分分析（PCA）が統計データ分析に広く適用されています。 多くの変数を使用する代わりに、PCAは多くの情報を失うことなく少数のPCを取得し、スコアプロットを視覚化して観測値を自由に分離します。 この研究では、SIMCA-P plus 14.0ソフトウェア（Umetrics、Umea、Sweden）を使用して、HPLCフィンガープリントの各成分の正規化されたピーク面積に対してPCAを実行し、2種類のMylabrisの区別を見つけました。
2つのMylabris種間のより好ましい識別のために、直交部分最小二乗判別分析（OPLS-DA）の監視された方法を適用して、HPLCフィンガープリントの各成分の正規化されたピーク面積の違いを分析しました。 VIP値は、OPLSの重みの二乗の重み付き合計であり、モデルに対する各X変数の相対的な寄与を反映しています。 VIP> 1の変数は、Sプロットとともに、OPLS-DA分析から生成されたスコアプロットのサンプルの分離に影響を与えると見なされました。 次に、識別のための特徴的な化学マーカーが得られた。
スペクトル-抗腫瘍効果の関係分析
探索するには抗腫瘍指紋データと統合されたMylabrisサンプルのピーク面積に影響を与え、2つの種の違い、指紋のピークとアンチ-腫瘍効果が研究された。 灰色の関係分析と多変量線形回帰分析（MLRA）を組み合わせた2つの方法が、SPSS19。0（IBM、米国）とGM6。0ソフト（Grey Systems Theory Institution、NUAA、中国）によって適用されました。 Theアンチ-腫瘍試験は当社の公表された方法[12]によって実施され、ヒト肝細胞癌細胞株HepG2細胞は、10％ウシ胎児血清を添加したRPMI1640培地で維持されました。 細胞は、37℃で5％のCO2を含む加湿雰囲気で培養されました。 増殖を評価するためにSRB法を使用したアンチ-腫瘍活動次に、HepG2細胞のIC50を計算し、最後にIC50と正規化されたピーク面積をケモメトリックス分析に使用しました。 次に、オビゲンセイの特徴的な活動マーカーを取得しました。
結果と考察
抽出条件の最適化
Mylabrisから水溶性化合物を十分に抽出するために、抽出システムが最適化されました。 超音波および還流は、これらの化合物が還流によって最適に抽出できることを示した。
HPLCメソッドの最適化
ハーブの全体的な特徴を説明するための最大のクロマトグラフィーピークを取得するために、クロマトグラフィーカラムの組成、移動相、および検出波長（200、254、265、および278 nm）を調査しました。 結果は、Phenimenex Synergy Polar-RP80カラム、水（1％氷酢酸を含む）、メタノール、および254nmがMylabrisHPLC分析に最適な条件であることを示しました（図1）。4つの標準物質の構造を図2に示します。 。
メソッドの検証
この研究では、14個のピークが十分に分離され、「共通のピーク」として使用されました。 精度、再現性、および安定性は、リテンションタイム（RT）とピーク面積（PA）に基づいています。 精度（n =6）のRTとPAのRSD値は、それぞれ0.2と4パーセントを超えませんでした。 再現性（n =6）のRAおよびPAのRSD値はそれぞれ0。2および4％未満であり、安定性（0-24 h）のRSD値は{未満でした。 {10}}。4パーセントと5パーセント。これは、サンプルが24時間以内に安定していることを示しています。 これらの結果は、研究対象のサンプルとHPLCメソッドの品質が安定しており、十分に管理されていることを示しています。
指紋の類似性評価
The fingerprint similarity analysis was used to evaluate the similarity of HPLC peaks. The similarities of MP and MC were calculated by the reference HPLC fingerprint, respectively. As shown in Table 1, except for two MP samples (from Guizhou2 and Guizhou5) with lower similarities (0.880 and 0.920, respectively), other samples of MP were >0.930. The similarities of MC samples were >{{0}}。921。ただし、MCサンプル（Guizhou2およびGuizhou4から）。類似点はそれぞれ0。888および0。887でした。 これらのデータは、1つの種内のオビゲンセイの品質が安定していることを示しました。 ただし、参照HPLCフィンガープリントと比較した3つのMPサンプルのみの類似性は>0。930でした。 参照HPLCフィンガープリントと比較した2つのMCサンプルのみの類似性は>0.921でした。 これらの結果は、オビゲンセイの2つの種がいくつかのピーク領域でかなりの変動であることを示しました。
パターン認識分析によるMPとMCの識別
For global analysis of the difference, PCA was used to find the quality variation of the samples from the two species of Mylabris. Figure 3 shows that the two-dimensional PCA model was constructed by the first two PCs, which included approximately 61.8% of the original data. The score plot showed that the MP and MC samples could not be separated by PCA. To understand the differences between MP and MC, an OPLS-DA model was established. As shown in Figure 4, the Mylabris samples could be classified into two groups with R2X=0.502, R2Y=0.492, and Q2=0.0769 as compared to the PCA model. These results showed that the OPLS-DA model was more suitable than the PCA model for distinct separation of the test samples based on their different components. From the S-plot of OPLS-DA, peak markers including peaks 1, 2, 4, 7, 9, 12, and 14 between MP and MC could be found (Figure 5). Based on VIP>1、ピーク1、2、4、7、9、12、および14は、2つの種を区別する上で最も重要な変数である可能性があります（図6）。 ピークグループ（1、2、4、7、9、12、および14）は、特徴的な化学マーカーとしてMPとMCを区別する上で重要な役割を果たす可能性があります。
灰色の関係分析によるスペクトル効果の関係
To further evaluate the relationship between the variations of normalized peak area and IC50, grey relational analysis (GRA) was performed. The influence rank by normalized peak area was P13>P14>P3>P2>P12>P4>P9>P1>P10>P7>P6>P8>P5> P11 as shown in Table 2. The results indicated that the top-6 peak including peaks 13, 14, 12, 2, 3, and 4 were the main influencing factors for the antitumor effect based on the standard of Relative Grey correlative degree (RGCE) >0.75.
MLRAによるスペクトルと効果の関係
MLRAモデルは、2つ以上の変数と次の式で作成された応答との間の関係の複雑さを推定するための最も一般的なモデリング方法です。
ここで、Yは推定値であり、応答を表します。 Xnは独立変数、b {{0}}は切片、bnはXnの回帰係数です。 この研究では、MLRAを適用して、HPLCフィンガープリントのピーク面積の値とanti-HepG2のIC5 0との間にフィンガープリントの有効性の関係を確立し、考えられる抗腫瘍成分を見つけました。 データの共線変換は、一般的なMLRAモデルによって検出されました。これは、Y（IC50）とX（PA）の間の相関関係を調査するのには適していません。 PCA MLRAモデルを使用して指紋と効果の関係を調査し、累積分散寄与率が91.068パーセントの最初の6台のPCを分析用に選択しました。 最後に、SPSS出力とPCに従って次の式が確立されました：IC50=1。115864plus（1.87268PA 1- 699 .722PA2 plus25.7138PA3 - 24。1528PA4plus7.22878PA {{ 23}}。2114PA6プラス2.95283PA7- 15。5305PA8プラス13.0297PA9プラス22.5683PA10 - 10。3462PA11プラス123.762PA12プラス31.0428PA13 - 10。702PA14）×10-6。 （Rは0.682、P <>
2つのオビゲンセイ種の統合分析
実験は、HPLCフィンガープリントがMylabrisの化学的特性を反映するために使用できることを示しました。 類似性アルゴリズム、PCA、およびOPLS-DAを適用して、MCとMPの違いを見つけました。 ピークグループ（1、2、4、7、9、12、および14）は、特徴的な化学マーカーとして定義されました。
さらに、GRAとMLRAの両方が、さらに区別するための十分な方法であることが証明されました。 GRAとMLRAの分析結果を統合すると、Mylabrisの活性マーカーとしてのピーク2、4、および14が、Mylabrisの薬力学的材料の基礎となる可能性のある抗腫瘍効果の原因となるはずです。
重要な示差マーカーは、特徴的な化学的および活性マーカー特性を備えたピークに対して定義されました。 したがって、スペクトル効果関係分析後のHPLCフィンガープリントのMCとMPの間では、図7に示すように、ピーク2（シトシン）、4（不明）、および14（不明）がMPとMCの違いの重要な差異マーカーでした。
結論
結論として、本研究では、MPおよびMCの化学的フィンガープリントのためにHPLC法を提案した。 HPLCフィンガープリント、PCA、およびGASやMLRAなどのスペクトル効果関係分析を組み合わせることにより、2つの近縁種のオビゲンセイの化学的および薬理学的特性を区別できます。 これは、重要なディファレンシャルマーカーとしてのピーク2（シトシン）、4（不明）、および14（不明）の化合物が、MPとMCを区別する上で支配的な役割を果たしたことを示しています。 ピーク4と14の構造は、他のテクノロジーで特定する必要があります。 統計、ケモメトリックス分析、およびスペクトル効果関係分析と組み合わせたHPLCフィンガープリントの方法は、マーカー成分の発見またはQCの促進に効率的であることが実証されました。漢方薬。
参考文献
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