概要：この研究は、シクロヘテロフィリンのメラニン合成阻害効果を明らかにするために行われました。 B16F10 細胞株に対するシクロヘテロフィリンの阻害効果を解明するために、細胞生存率、メッセンジャーリボ核酸 (mRNA) 発現、チロシナーゼ活性アッセイ、およびメラニン生成アッセイを測定しました。 チロシナーゼ関連タンパク質 1 (TYRP1)/TYRP2/チロシナーゼ (TYR)/小眼球症関連転写因子 (MITF) mRNA 発現およびメラニン含有量に対するシクロヘテロフィリンの影響を測定しました。 定量的リアルタイムRT-PCRにより、シクロヘテロフィリンは、-MSH処理B16F10細胞よりもTYRP1/TYRP2/TYR/MITF遺伝子のmRNA発現レベルおよびメラニン生成量を減少させることが示された。 チロシナーゼ活性アッセイにより、シクロヘテロフィリンが B16F10 細胞におけるメラニン生成を減少させることが明らかになりました。 これらのデータは、シクロヘテロフィリンが B16F10 細胞の美白効果を高めることを示しています。 したがって、シクロヘテロフィリンは皮膚を白くするための強力な成分です。 したがって、機能性材料の開発のためのシクロヘテロフィリンの作用機序についてのさらなる研究が検討されるべきである。

関連する研究によると、カンサスは「寿命を延ばす奇跡のハーブ」として知られる一般的なハーブです。 主成分はシスタノシドで、抗酸化作用、抗炎症作用、免疫機能促進作用などさまざまな作用があります。 シスタンケと美白のメカニズムは、シスタンケ配糖体の抗酸化作用にあります。 人間の皮膚のメラニンはチロシナーゼによるチロシンの酸化によって生成されますが、その酸化反応には酸素の関与が必要なため、体内の酸素フリーラジカルがメラニン生成に影響を与える重要な因子となります。 シスタンケには抗酸化物質であるシスタノシドが含まれており、体内のフリーラジカルの生成を減らし、メラニンの生成を抑制します。

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1. はじめに

皮膚の色は血液中のヘモグロビン、表皮層のメラニン色素、皮下組織のβカロテンによって決まります。 このうち、皮膚の色は主にメラニン色素の量と分布によって決まります[1]。 メラニンは、基底層に存在するメラノサイト内のメラノソームから合成される色素です。 紫外線（UV）を吸収または散乱し、皮膚細胞や皮膚組織へのダメージを抑える効果があります。 しかし、メラニンが過剰に蓄積すると、シミ・そばかす・色素沈着の原因となることがあります。 色素沈着過剰を引き起こすことが知られています[2、3]。

メラニン色素は、外因性老化を引き起こす代表的な刺激物です。 紫外線にさらされたメラノサイトのメラニン形成によって生成され、肌の色を暗くして紫外線から肌を守る有益な機能があります。 メラニン色素はユーメラニン（黒色）とフェオメラニン（赤茶色）から構成されます[4,5]。 メラニンは、アミノ酸の一種であるL-チロシンを基質としてL-ドーパ（3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン）を介して生成され、さらに主要酵素チロシナーゼ（TYR）によってドーパキノンに酸化されます。チロシナーゼ関連タンパク質-1 (TYRP1)、およびTYRP2。 DOPA-キノンは、スルフヒドリル基の存在下でさらに酸化されて赤黄色のフェオメラニンになります。 スルフヒドリル基が枯渇すると、DOPA キノンも脱炭酸、酸化され、触媒作用を受けてユーメラニンになります [4,5]。 チロシナーゼ酵素はメラニン生成に関与する重要な酵素であり、代表的な美白素材である甘草エキス、ナラエキス、アルブチン、コウジ酸はチロシナーゼ酵素の活性を阻害することが知られています[6,7]。 特にアルブチンは、メラニンの原料であるL-チロシンや、Cu2plusによりチロシナーゼの活性部位に結合したコウジ酸と競合的に反応し、チロシナーゼの活性を阻害する役割を果たしています。 コウジ酸やアルブチンは強い美白効果があることが知られていますが、皮膚刺激などの安全性の問題による副作用も報告されています[8,9]。 天然由来の機能性材料の開発など、新たな有効材料を発見するために多くの研究が行われている[8,9]。

プレニルフラボンの一種であるシクロヘテロフィリン（C30H30O7）は、Artocarpus heterophyllus に豊富に含まれており、抗炎症作用、抗血小板活性、抗酸化作用などの薬理学的および生物学的機能があることが報告されています [10-13]。 さらに、UV-A によって誘発されるヒトの真皮線維芽細胞に対して抗酸化作用と老化防止作用があることが報告されています [14,15]。

このように、シクロヘテロフィリンは様々な疾患に効果があることが報告されているが、シクロヘテロフィリンによるメラニン生成への影響​​については研究されていない。 本研究では、マウス由来のメラノーマ細胞株であるB16F10細胞におけるメラニン生成機構に関連するマーカーTYRP1、TYRP2、TYR、MITFの発現に対するシクロヘテロフィリンの影響を調べました。

2. 結果と考察

CCK{{0}} アッセイは、B16F10 細胞株におけるシクロヘテロフィリンの細胞毒性を測定するために実行されました。 細胞生存率を測定するために、さまざまな濃度のシクロヘテロフィリンを添加しました (図 1)。 20μg/mL以上の濃度で処理した場合、B16F10細胞の生存率が対照群に比べて有意に低下することが確認された。 シクロヘテロフィリンを 10 μg/mL の濃度で添加した場合、B16F10 細胞の生存率は対照群と同様でした。 したがって、追加の実験ではシクロヘテロフィリンを 10、1、および 0.1 μg/mL の濃度で添加しました。

チロシナーゼ酵素はL-チロシンと反応してL-ドーパを生成し、最終的にL-ドーパはチロシナーゼによりドーパキノンを介してメラニン色素を生成します。これはメラニン生成を制御する重要な酵素として知られています[4,5]。 この実験では、チロシナーゼ酵素活性の阻害の程度を評価するためのポジティブコントロールとしてコウジ酸を使用しました。 チロシナーゼ酵素活性の阻害の程度は、10、1、および 0.1 μg/mL の濃度のシクロヘテロフィリンで処理することによって確認されました。 シクロヘテロフィリンにより、濃度依存的にチロシナーゼ酵素活性が阻害されることが確認されました（図２）。 10、1、0.1 μg/mLの濃度のシクロヘテロフィリン処理群では、チロシナーゼ酵素の阻害効果がそれぞれ58.0、27.4、16.9パーセントであることが確認されました。

紫外線が表皮の角化細胞を刺激して、メラノサイトを刺激するホルモンである-メラノサイト刺激ホルモン（-MSH）の発現を誘導し、細胞外に分泌され、分泌された-MSHがメラノサイトを刺激します。 メラノコルチン 1 受容体 (MC1R) に結合することにより、細胞内のメラニン合成に関連するシグナル伝達を誘導し、メラニン色素の生成を引き起こします [5]。 この実験では、B16F10 細胞でメラニン生成を誘導するために、200 nM -MSH を使用して B16F10 細胞でメラニン生成を誘導しました [16]。 -MSH処理したB16F10細胞におけるシクロヘテロフィリン処理により、-MSH処理により増加するマーカーであるTYRP1、TYRP2、TYR、MITF遺伝子の発現量をリアルタイムRT-PCRにより測定した。 B16F10 細胞をシクロヘテロフィリンで処理し、リアルタイム RT-PCR によってマーカーの発現を確認しました。 その結果、シクロヘテロフィリン投与群では、-MSH投与群と比較して、TYRP1、TYRP2、TYR、MITFの発現が有意に低下していることが確認された。 具体的には、10 μg/mL のシクロヘテロフィリンで処理した実験グループでは、TYRP1、TYRP2、TYR、および MITF 遺伝子の発現がそれぞれ 53.3、26.6、58、および 34 パーセント減少しました (図 3)。 1 μg/mL シクロヘテロフィリン処理群ではマーカーの発現が有意に低下していることが確認され、0.1 μg/mL シクロヘテロフィリン処理群でも同様に TYRP1 および TYRP2 遺伝子の発現が低下していることが確認されました。

シクロヘテロフィリン処理によりメラニン生成に関連するマーカーのmRNA発現量が低下することを確認した後、B16F10細胞におけるメラニン色素の生成が大幅に減少したかどうかを確認するためにメラニン色素の生成速度を確認しました（図4）。 。 シクロヘテロフィリンをそれぞれ10、1、0.1μg/mLの濃度で処理したB16F10細胞株を採取し、メラニン生成の程度を確認した。 その結果、10μg/mLおよび1μg/mLの濃度のシクロヘテロフィリンにより、メラニン色素の生成が顕著に減少することが確認された（図4A）。 また、シクロヘテロフィリン処理条件では、対照群に比べてメラニン色素の生成が減少していることが確認された（図４Ｂ）。 10 μg/mL および 1 μg/mL のシクロヘテロフィリンを添加すると、メラニン色素の生成率はそれぞれ 44.6 パーセントと 37.8 パーセント減少し、対照群と比較して大幅に減少しました (図 4B)。 これらの結果は、メラニン生成関連マーカーの mRNA 発現レベルに関するリアルタイム RT-PCR の実験結果と一致する傾向があります。

アスコルビン酸などの抗酸化物質は、ユーメラニン生成過程の中間物質であるドーパキノンをL-ドーパに還元することでメラニン色素の合成を阻害する重要な美白物質であることが知られている[16,17]。 シクロヘテロフィリンには抗酸化作用があることも報告されています[11,12]。 シクロヘテロフィリンはこの抗酸化作用により美白に効果がある可能性があることが示されています。 このDPPHラジカル消去アッセイによりin vitroでの抗酸化作用を確認した結果、高濃度のシクロヘテロフィリン下でポジティブコントロールであるアスコルビン酸と同等の抗酸化作用を有することが確認されました（図5）。 今後は、メラノサイトにおけるシクロヘテロフィリンの抗酸化作用や、カタラーゼ、SOD1、SOD2、SOD3などの抗酸化酵素の発現についてさらなる研究が行われる必要がある。

3. 材料と方法

3.1. 実験材料と細胞培養

B16F10 細胞株は Korea Cell Line Bank (韓国) から購入し、細胞培養培地はダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) に 10% のウシ胎児血清 (FBS、SFBU-0500、Equitech-bio、カービル、テキサス州、米国) を加えたものでした。 、LM 001–05、Welgene、慶山市、韓国）、および 1 パーセントのペニシリン/ストレプトマイシン（Gibco、15140–122、Waltham、MA、USA）を追加しました。 細胞は 37 °C、5% CO2 のインキュベーター内で培養されました [16]。 この実験で使用したシクロヘテロフィリンは、DMSO を使用して Artocarpus heterophyllus から抽出し、ChemFaces Co. (CFN97748、中国武漢、純度 98 パーセント以上) から購入しました。

3.2. 細胞生存率アッセイセル

生存率はCCK-8溶液（細胞計数キット; EZ-3000、EZ-Cytox、ソウル、DoGen）によって評価されました。 B16F10 細胞株を 2 × 104 細胞/96 ウェルプレートの密度で培地に播種しました。 24時間後、シクロヘテロフィリン(CFN97748、Chemfaces)を添加した。 シクロヘテロフィリンで処理したB16F10細胞株を24時間インキュベートし、CCK-8溶液を37℃のインキュベーター内で30分間添加した。 マイクロプレートリーダー (Epoch、Winooski、VT、USA、BioTek) を使用して 450 nm で吸光度を測定し、細胞のない対照群の吸光度に基づいて細胞生存率を計算しました [16]。

3.3. DPPH アッセイ

3.4. インビトロキノコチロシナーゼ活性

3.5. 定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (Q-RT-PCR)

全 RNA は、Trizol (15596018、米国カリフォルニア州カールズバッド、Thermo Fisher Scientific) を使用して単離されました。 RNAの濃度は分光光度法(BioTek)で測定した。 ReverTra Ace® 逆転写キット (Toyobo、FSQ101、大阪、日本) を使用して、4 マイクログラムの RNA を cDNA に逆転写しました。 逆転写は、合計 200 μL の cDNA 溶液に Tris-EDTA バッファー (pH 8.0) を添加することで停止しました。 TaqMan® Gene Expression Assay セットは Applied Biosystems から購入しました。 Q-RT-PCR は製造元の指示に従って実施されました。 簡単に説明すると、20 μL の Q-PCR 混合物には、10 μL 2× TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems、米国カリフォルニア州フォスターシティ)、1 μL 20× Taqman 発現アッセイ (Applied Biosystems)、および 50 ng cDNA が含まれていました。 Q-PCR 混合物を 95 °C で 20 秒間反応させ、StepOnePlus System (Applied Biosystems) を使用して 40 回のサイクル反応 (95 °C で 1 秒および 60 °C で 20 秒) を行いました。 Q-RT-PCR 分析で使用した TaqMan 発現アッセイの遺伝子識別番号を表 1 に示します。異なるサンプルからの cDNA 量の変動を正規化するために、ヒト GAPDH (Applied Biosystems) を使用しました。

3.6. メラニンコンテストアッセイ

メラニン色素の量を測定するために、細井の方法は部分的にモディフィールドであった [17]。 合計 1 × 105 個の B16F10 細胞を 60 mm 組織培養皿に接種しました。 細胞を 24 時間培養した後、200 nM のメラノサイト刺激ホルモン (-MSH; M4135、Sigma-Aldrich) およびシクロヘテロフィリン (10、1、0.1 μg/mL) を各濃度で 72 時間添加しました。 培地を除去した後、200 μL の NaOH (1N; S8045、Sigma-Aldrich) 溶液を加え、60 °C で 2 時間インキュベートしてメラニンを溶解しました。 吸光度は分光光度計(405nm、Epoch)を用いて測定した。 陽性対照として、100 μg/mL アルブチン (A4256、Sigma-Aldrich) を使用しました。 メラニン色素の生成の阻害は、-MSH 処理条件下で生成されたメラニンの量のパーセンテージとして表されました。 これは、3 つの独立した実験を独立して実行することによって実行されました。

3.7. 統計分析

4. 結論

日常生活で遭遇する紫外線は、ビタミンDの合成や殺菌などの有益な働きをする一方、活性酸素の連鎖反応により皮膚の弾力性の低下、シワ、色素沈着、紅斑、炎症などを引き起こす[18, 19]。 また、紫外線などの外的要因による外因性老化は、生体内の構成細胞の減少や劣化により組織が損傷すると、正常な組織の機能や再生を阻害します[20,21]。

この研究を通じて、B16F10 細胞を治療するためのシクロヘテロフィリンの適切な濃度を確認することができました。 図1に示すように、10μg/mLの濃度では細胞の生存率に影響を及ぼさないことが確認されました。チロシナーゼ酵素の活性阻害効果の測定結果により、シクロヘテロフィリン濃度が10、1、 0.1 μg/mL ではチロシナーゼ酵素の活性が大幅に低下しました (図 2)。 また、シクロヘテロフィリンは、-MSH処理条件と比較して、マーカー（TYRP1、TYRP2、TYR、MITF遺伝子）の発現を有意に低下させることが確認されました（図3）。 さらに、シクロヘテロフィリンがB16F10細胞におけるメラニン合成量を減少させることが確認されました（図4）。 これらの結果から、シクロヘテロフィリンは新たな美白候補としての可能性を示しています。

本研究は、シクロヘテロフィリンのメラニン合成抑制効果を初めて確認したものであり、紫外線による皮膚の老化を抑制できる可能性を示唆しています。 さらに、B16F10 細胞のシグナル伝達機構、美白に関与するシグナル伝達系、およびメラノサイトに存在するさまざまな抗酸化酵素に対するその効果をさらに詳しく調べる必要があると思われます。

参考文献

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