メラニンの脱色のための美白剤として天然メディエーターを使用するラッカーゼメディエーターシステム パート 1
Apr 27, 2023
概要： 本研究では、メラニン脱色のための美白剤として、天然メディエーターを用いたラッカーゼメディエーターシステム（LMS）を開発しました。 合成メディエーターの代わりに 7 種類の天然メディエーターが使用され、ラッカーゼの低い酸化還元電位とラッカーゼの活性部位へのメラニンのアクセスの制限を克服することに成功しました。 Trametes versicolor (lacT) および Myceliophthora Thermophila (lacM) 由来のラッカーゼのメラニン脱色活性は、低い細胞毒性を示すアセトシリンゴン、シリンアルデヒド、アセトバニロンなどの天然メディエーターを使用すると大幅に強化されました。 天然メディエーターのメトキシ基とケトン基は、メラニンの脱色に重要な役割を果たします。 アセトシリンゴンをメディエーターとして使用した場合、メラニン脱色に対する lacT と lacM の特異性定数は、それぞれ 247 と 334 増加しました。 レースとアセトシリンゴンを使用した LMS は、セルロース ハイドロゲル フィルムに存在するメラニンを脱色することもでき、皮膚の状態を模倣します。 さらに、LMS は、チロシンの酸化によって調製される合成ユーメラニン類似体だけでなく、黒色腫細胞によって生成される天然メラニンも脱色できます。
関連する研究によると、カンクン「寿命を延ばす奇跡のハーブ」として知られる一般的なハーブです。 その主成分は、シスタノシドなど様々な効果があります。抗酸化物質, 抗炎症薬、 と免疫機能の促進。 シスタンシュとのメカニズム美白カンクサの抗酸化作用にあり配糖体. メラニン人間の皮膚では、次の物質によって触媒されるチロシンの酸化によって生成されます。チロシナーゼ、酸化反応には酸素の関与が必要なため、体内の酸素フリーラジカルはメラニン生成に影響を与える重要な要素になります。 カンクサが含まれていますシスタノシド、抗酸化物質であり、体内のフリーラジカルの生成を減らすことができます。メラニンの生成を抑制します。
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1. はじめに
ラッカーゼ (EC 1.10.3.2、ベンゼンジオール: 二酸素酸化還元酵素) は、分子酸素の還元によるラジカル触媒反応機構を介して、さまざまなフェノール化合物および非フェノール化合物の酸化を触媒する多銅タンパク質です [1,2]。 ラッカーゼは、染料 [3,4]、医薬品 [5,6]、除草剤 [7]、脱リグニン [8-10] などの生分解プロセスの生体触媒として使用されています。 ラッカーゼは、染料前駆体と有機化合物の重合を触媒するためにも使用されています [11]。 特に、低い基質特異性、最終的な電子受容体としての酸素の使用、副生成物としての水の生成、過酸化物の需要がない（または生成されない）などの魅力的な特性により、バイオテクノロジーやバイオテクノロジーの分野で興味深いものとなっています。環境分野 [1、11、12]。
活性部位の 4 つの銅イオンがラッカーゼの触媒活性に関与しています。 「青色」銅 (T1 サイト) は基板を酸化し、三核銅クラスター (T2/T3) が T1 サイトから電子を受け取って分子状酸素を還元します [1,12,13]。 特に、T1 サイト Cu の酸化還元電位は、ラッカーゼの触媒能力を決定する主要な要因と考えられています [14]。 ラッカーゼは、マンガン ペルオキシダーゼやリグニン ペルオキシダーゼなどのリグニン分解性ペルオキシダーゼ (1 V 以上) と比較して、比較的低い酸化還元電位 (0.4 ～ 0.8 V) を持っています。 ラッカーゼは、酸化還元電位が 1.3 V を超える非フェノール性基質を直接酸化することはできません [13、14]。 したがって、ラッカーゼの限界を克服するには、2,20 -アジノビス(3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホネート) (ABTS)、{ {24}}ヒドロキシベンゾトリアゾール (HOBt)、ビオルル酸 (VLA)、N-ヒドロキシフタルイミド (HPI)、N-ヒドロキシアセトアニリド (NHA)、および TEMPO は、酸化還元メディエーターとして機能することが示唆されています [15-17]。
これらのメディエーターは、さまざまな酸化経路を介して嵩高い化合物の酸化を可能にします。 ラッカーゼ-ABTS システムは、電子移動 (ET) 機構を介してカチオン性 ABTS ラジカルを生成することで基質を酸化します。 HOBt、VLA、HPI、または NHA を含む LMS は、水素原子移動 (HAT) 機構を介してニトロキシル ラジカルを生成します [1、12、17]。 さらに、TEMPO やその類似体などのメディエーターは、イオン経路を介して反応してオキソアンモニウム イオンを生成します [1、12、18]。 これらのメディエーターを使用すると、染料の分解 [3,4]、薬剤の分解 [5,6]、リグニンの分解 [8-10] など、さまざまな用途で幅広い化合物を酸化できます。 それにもかかわらず、合成メディエーターの産業分野での応用は、その潜在的な毒性、高コスト、および酵素不活化効果により制限されてきました。 最近、天然メディエーターとしてのリグニン由来のフェノール分子 (例、シリンアルデヒド、アセトシリンゴン、バニリン、アセトバニロン、メチルバニレート、フェルラ酸、シナピン酸、p-クマリン酸など) が合成メディエーターに代わる研究が行われています [1,12]。 。 天然メディエーターの利点は、天然および再生可能な資源から得られるため、低コストで毒性が低いことです[19]。
メラニンは、メラノサイトによるチロシンの酸化重合によるメラニン生成によって生成される天然色素のグループです。 天然メラニンは、ユーメラニン、フェオメラニン、オールメラニン、フェオメラニン、ニューロメラニンの 5 つのカテゴリーに分類できます [20]。 最近、メラニンまたはメラニン前駆体を使用したさまざまな医療および電気化学的応用が研究されています [20,21]。 人間の肌の色は主にメラニンの存在によって決まります。 化粧品業界では、美白剤の開発のために、酵素を使用したメラニンの直接脱色が提案されています。 メラニンを脱色するために、いくつかのペルオキシダーゼが研究されています。 ウーら。 は、合成メラニンが P. クリソスポリウム由来のリグニンペルオキシダーゼによって直接脱色できることを示しました [22]。 Kenako グループと Mohorˇciˇc グループは、真菌 (Sporotrichum pruinose および Phlebia radiata) から単離されたマンガンペルオキシダーゼによるメラニンの酵素的脱色も報告しました [23,24]。 キムら。 は、マンガンペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、およびラッカーゼを含む粗酵素混合物がメラニン色素脱失活性を示したことを報告しました[25]。 ペルオキシダーゼがメラニンを脱色する際には、皮膚を刺激する可能性のある補因子として過酸化水素 (H2O2) が必要になります。 したがって、H2O2の使用を減らすために、グルコースオキシダーゼまたはラッカーゼが酵素組み合わせシステムに導入されました[26、27]。 ラッカーゼは過酸化水素を使用せずにメラニンを脱色できます。 Khammuang と Sarnthima は、シイタケの Lév 由来のラッカーゼが、ABTS、バニリン、バニリン酸をメディエーターとして使用するメラニン脱色活性を示したと報告しました [28]。
2。材料と方法
2.1. 材料
2.2. LMSによるメラニン脱色
飽和メラニン溶液（１．４ｍｇ／ｍＬ）は、３ｍｇの合成メラニンを１．３ｍＬの１｛｝｝ｍＭ ＮａＯＨに溶解することによって調製した。 この溶液を 8500 rpm で 5 分間遠心分離して未溶解のメラニンを除去し、上清を 0.1 M クエン酸リン酸緩衝液 (pH 3、4、 5、5.5、6、または 7) を使用し、LMS の基質溶液として使用されます。 基質溶液中のメラニンの濃度は 63 μg/mL であり、分光光度法により 475 nm で確認されました。 1.5 mL エッペンドルフチューブ内で、0.8 mL のメラニン基質溶液を 0.1 mL メディエーター溶液 (0 ～ 1 mM) と混合しました。 メラニン脱色反応は、120 rpm の振盪水浴中、25 °C でメラニンとメディエーターの混合物に 0.1 mL のラッカーゼ溶液 (15.8 μg (0.6 U) lacT または 19.2 μg (1.8 U) lacM) を添加することによって開始されました。 。 反応後、反応液を遠心分離し、上清の475nmにおける吸光度を測定した。 脱色収率 (パーセント) は、次の式を使用して計算されました。
脱色 (パーセント) {{0}} (A0 − At)/A0 × 100、(1)
2.3. LMSによるメラニン脱色速度論的研究
2.4. 天然メディエーターの細胞毒性
B16F10 黒色腫細胞株 (Korea Cell Line Bank、ソウル、韓国) を使用して、LMS に対する天然メディエーターの細胞毒性を測定しました。 ニュートラルレッド (NR) アッセイは、メディエーターの細胞毒性を測定するために実行されました [29]。 NR は生細胞リソソームの生存率を測定します。 3 × 104 細胞の濃度の黒色腫細胞を 96- ウェルプレートの各ウェルに分注しました。 24 時間の培養後、細胞を天然メディエーター (1、2、5、10、22、および 46 mM) で処理しました。 さらに 2 日間培養した後、DMEM に溶解した 50 μg/mL NR 溶液で細胞を処理し、3 時間インキュベートしました。 上清を吸引除去した後、NR 脱着溶液 (1% 氷酢酸、49% エタノール、および 50% 蒸留水) を使用して色を抽出しました。 抽出プロセス後、540 nm での吸光度の変化を測定しました。
2.5. メラニン/セルロースハイドロゲルフィルムの調製と脱色
メラニン/セルロースフィルムに対するLMSの脱色活性を測定するために、調製したハイドロゲルフィルムを1×2cmのシートに切断した。 ヒドロゲルフィルムを 4 mL の 0.1 M クエン酸リン酸緩衝液 (pH 5.5) に浸漬しました。 続いて、0.5 mLの1 mM アセトシリンゴンおよび0.5 mLのレース溶液(2.5 U)を緩衝液に加えた。 脱色反応は、水浴中で振盪しながら、120μm、25℃で3時間実施した。 反応後、フィルムを蒸留水で洗浄し、キュベットの内側に貼り付け、UV/Vis 分光光度計を使用して 400 ～ 800 nm の範囲でスペクトルの変化を測定しました。 lacM またはメディエーターを使用しない対照反応も同じ条件下で実施しました。 この反応条件下では、フィルムからのメラニンの放出やメラニン／セルロースフィルムの色の変化は検出されなかった。 さらに、LMSによる脱色反応後のメラニン/セルロースフィルムの色パラメータ（L*、a*、b*値）の変化も比色計（KONICA MI NOLTA、東京、日本）を使用して記録しました。 ΔL (メトリック明度差)、ΔE (総色差)、YI (黄色度指数)、および WI (白色度指数) の値は、次の方程式を使用して取得されました [30–32]。
2.6. 天然メラニンの調製
天然メラニンは、B16F10 黒色腫細胞から得られました。 細胞をαメラノサイト刺激ホルモンで処理してメラニンを生成させました。 4 日間のインキュベーション後、トリプシン-EDTA を使用して細胞を捕捉し、10 分間超音波処理しました。 8000 rpmで10分間遠心分離することによって上清を得て、その後6 M HClを使用してpH 1.5に調整した。 溶液を 100 °C で 4 時間煮沸して、残留タンパク質画分を加水分解しました。 天然メラニンを含む溶液をアセトン、続いてクロロホルムとエタノールで洗浄し、その後脱イオン水で洗浄して、細胞、培地成分、タンパク質画分などの残留物を除去しました[33,34]。 全ての洗浄工程を２回以上行った。 最後に、天然メラニンを凍結乾燥によって取得し、LMS の基質として使用しました。
3。結果と考察
3.1. LMSによるメラニン脱色に対するメディエーターの効果
LMS によるメラニン脱色反応に対するさまざまなメディエーターの影響を、カワラタケ (lacT) とサーモフィラ M. サーモフィラ (lacM) の 2 つのラッカーゼを使用して調べました (図 1)。メラニン脱色のためのメディエーターなしで lacT を使用した場合、5 時間の反応後の脱色収率はわずか 1% でした。 HOBt を lacT のメディエーターとして使用した場合、脱色収率は 5 時間の反応後にわずかに 2 パーセントに増加しました。 フェノール化合物または非フェノール化合物のラッカーゼ触媒酸化において、HOBt、ABTS、VLA、TEMPO などのさまざまな合成メディエーターを使用すると、反応速度が大幅に向上しました [10,15]。 ラッカーゼの活性部位への標的化合物のアクセスが立体障害によって制限されている場合、ラッカーゼによって形成されるメディエーターラジカルは、電子伝達または水素原子伝達機構によって標的化合物を効率的に酸化できます[12]。 HOBt は、その高い酸化還元電位 (1.1 V) により、LMS で最も一般的に使用される合成メディエーターの 1 つです [6]。 しかし、HOBt は潜在的な細胞毒性とラッカーゼを不活化する能力があるため、優れた化粧品成分ではありません。 そこで、LMS によるメラニン脱色反応のために、アセトシリンゴン、シリンアルデヒド、p-クマリン酸、バニリン、バニリン酸、バニリルアルコール、アセトバニロンの 7 つの天然メディエーターを選択しました。 興味深いことに、天然メディエーターはすべて、欠乏によるメラニン脱色に関して HOBt よりも効率的なメディエーターとして機能します。 アセトシリンゴン、シリンアルデヒド、および p-クマリン酸を使用した場合、5 時間の反応後の脱色収率はそれぞれ 28 パーセント、22 パーセント、および 18 パーセントでした。 これらの結果は、LMS によるメラニン脱色反応に対する天然メディエーターの有用性を示しています。 LMS 内のメディエーターはラッカーゼによりメディエーター ラジカルに酸化され、メディエーター ラジカルはメラニンの酸化と脱色を引き起こします。 平衡状態に達することができる十分な反応時間の間、メラニン脱色のためのメディエーターなしで欠色を使用した場合、24時間の反応後の脱色収率は7パーセントでした。 バニリン酸を除く天然メディエーターは、反応 24 時間後に lacT によるメラニン脱色に関して HOBt よりも効率的なメディエーターとして機能します。 バニリン酸をメディエーターとして使用した24時間反応後の脱色収率は、5時間反応後の脱色収率よりも低かった。 これは、バニリン酸の酸化ラジカル形態の安定性が低いことが原因である可能性があります。 アセトシリンゴン、シリンアルデヒド、およびアセトバニロンを使用した場合、24 時間の反応後の脱色収率はそれぞれ 34 パーセント、30 パーセント、および 31 パーセントでした。 p-クマリン酸はアセトバニロンよりも初期反応速度を高めるのに効果的でしたが、アセトバニロンは平衡状態でp-クマリン酸よりも高い脱色収率をもたらしました。
lacM を使用した LMS による脱色反応に対するメディエーターの効果も、lacT を使用した LMS によって得られた効果と非常に類似していました。 メラニン脱色のためのメディエーターを使用せずにレースを使用した場合、5 時間の反応後の脱色収率はわずか 2% でした。 lacM のメディエーターとしての HOBt は、5 時間の反応中に脱色収率を向上させませんでした。 p-クマル酸とバニリンを除くすべての天然メディエーターは、lacM によるメラニン脱色の効率的なメディエーターとして機能しました。 アセトシリンゴンとシリンアルデヒドを使用した場合、5 時間の反応後の脱色収率はそれぞれ 25 パーセントと 22 パーセントでした。 p-クマリン酸とバニリンはそれぞれの効率的なメディエーターとして使用されましたが、レースを使用したLMSの脱色速度を効率的に高めることはできませんでした。 これは、p-クマリン酸およびバニリンに対する lacM の基質特異性が低いことが原因である可能性があります。 lacM と p-クマリン酸およびバニリンとの 24 時間の反応後の脱色収率は、lacT によって得られたものと同様でした。 これは、酸化型の p-クマル酸とバニリンが、lacM による酸化速度が lacT による酸化速度よりもはるかに低いにもかかわらず、メラニンを効率的に脱色できることを示しています。 メディエーターを含まない lacM を十分な反応時間中のメラニン脱色に使用した場合、24 時間の反応後の脱色収率は 5 パーセントでした。 バニリン酸を除く天然メディエーターも、反応 24 時間後の lacM によるメラニン脱色に関して、HOBt よりも効率的なメディエーターとして機能します。 アセトシリンゴン、シリンアルデヒド、およびアセトバニロンを lacM のメディエーターとして使用した場合、24 時間の反応後の脱色収率はそれぞれ 34 パーセント、28 パーセント、および 31 パーセントでした。 バニリン酸をlacTとlacMの両方のメディエーターとして使用した場合、脱色収率が最も低くなりました。 これは、バニリン酸の酸化ラジカル形態の安定性が低いことが原因である可能性があります。 Khammuang と Sarnthima は、バニリンとバニリン酸が、レンティヌス・ポリカーパスのラッカーゼを使用したメラニン脱色のメディエーターとして使用できることを報告しました[28]。 しかし、lacTおよびレースのメディエーターとして使用した場合、メラニンに対する脱色活性はアセトシリンゴンよりもはるかに低かった。
これらの結果は、天然メディエーターが HOBt よりも LMS によるメラニン脱色に効率的であることを示しています。 HOBt は、その高い酸化還元電位と HOBt の N OH 基の触媒的役割により、ラッカーゼの効率的な合成メディエーターと考えられています [5]。 標的基質を酸化するメディエーターの効率は、メディエーターの酸化還元電位ではなく、安定したラジカルを形成する能力と、かさばるアルキル置換基によって引き起こされる立体障害に大きく依存します[19、35]。 HOBt の酸化中間体の安定性が低いことは、サイクリック ボルタンメトリーによって確認されています [6]。 したがって、HOBt を用いた LMS による脱色収率が低いのは、ラッカーゼの反応条件下での HOBt の安定性が低いことが原因である可能性があります。 シリンアルデヒドの酸化還元電位は HOBt よりも低いものの、シリンアルデヒドは HOBt よりも比較的高い安定性を示しました [6]。
図 2 に示すように、この研究で使用される天然メディエーターは、ベンゼン環上の異なる位置にさまざまな置換基 (例、ヒドロキシル、メトキシ、カルボキシル、ケトン、またはアルデヒド) を持っています [12,19]。 2 つのメトキシ基を持つメディエーター (アセトシリンゴンとシリンアルデヒド) は、1 つのメトキシ基を持つメディエーターよりも高い脱色率を示しました。 メトキシ基を持たないp-クマル酸による脱色率はラッカーゼの種類に依存した。 lacT を含む p-クマル酸は、1 つのメトキシ基を含むものよりも高い脱色速度を示しましたが、lacM を含む p-クマル酸は、5 時間の反応で最も低い脱色速度を示しました。 フィラートら。 らはまた、天然メディエーターを用いた真菌ラッカーゼによるフレキソインクの脱色についても同様の結果を示した[36]。 環内に 2 つのメトキシ置換基を持つフェノール系天然メディエーター (アセトシリンゴン、メチルシリンジ、およびシリンアルデヒド) は、メトキシ基を持たない p-クマル酸よりも速くラッカーゼによって酸化されました。 これは、メトキシ基が、p-クマル酸の側鎖の二重結合よりも電子供与体として重要な役割を果たしていることを示しています。 メトキシ基を 1 つ持つメディエーターを比較すると、アセトバニロン > バニリン > バニリルアルコール > バニリン酸の順に脱色収率が増加しました。 ケトン基を有するアセトバニロンは、アルデヒド基、水酸基、カルボキシル基を有するメディエーターよりも高い脱色率と収率を示しました。 また、ケトン基を有するアセトシリンゴンは、アルデヒド基を有するシリンアルデヒドよりも高い脱色率および収率を示した。
以下の実験では、LMSがメラニンを脱色するためのメディエーターとして、高いメラニン脱色能力を示すアセトシリンゴン、シリンアルデヒド、アセトバニロンを選択しました。 LMS による脱色反応に対するメディエーターの影響を経時的に調査しました (図 S1)。 lacT とアセトシリンゴン、シリンアルデヒド、およびアセトバニロンを使用した脱色反応では、1 時間の反応後にそれぞれ 21 パーセント、18 パーセント、および 1 パーセントの脱色収率が得られました。 lacM とアセトシリンゴンおよびシリンアルデヒドを使用した脱色反応では、1 時間の反応後にそれぞれ 19 パーセントおよび 18 パーセントの脱色収率が得られました。 同じメディエーターを使用した場合、どちらのラッカーゼも同様の反応プロファイルを示しました。 アセトシリンゴンとシリンアルデヒドは、初期反応中の脱色速度を大幅に高めました。 これらの結果は、ジメトキシ基を含むアセトシリンゴンおよびシリンアルデヒドが、メトキシ基を 1 つ含むアセトバニロンよりも LMS による脱色の初期速度を高めるのに効果的であることを示しています。 フィラートら。 また、メディエーターの環構造内のメトキシ基が基質の酸化の促進剤として作用することも報告した[36]。 一方、アセトバニロンによる 24 時間反応後の脱色収率は、シリンアルデヒドによる脱色収率と同様でしたが、アセトバニロンは反応速度を適度に高めました。
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