ヒト腎臓疾患のゼブラフィッシュ モデルを生成および評価する方法パート 1
Apr 24, 2023
概要
腎臓関連疾患は世界中で何百万人もの人々に影響を与えています。 慢性腎臓病（CKD）患者を対象とした調査では、腎臓病の負担が年々増加していることが明らかになりました。 2017 年の世界疾病負荷（GBD）調査では、CKD が世界で 12 番目に多い死因としてランク付けされました。 したがって、腎臓病の原因の特定、正確な診断方法、および新しい治療法の開発は非常に重要です。 人間の病気を忠実に再現したモデル生物は、病気の過程を理解する上で重要な役割を果たし、その治療法を見つけるための貴重な基盤を提供します。 ゼブラフィッシュは、ヒトの腎臓病の発症、病態生理学、分子的側面を研究するための優れたモデルです。 このレビューでは、ヒト腎臓病の病態生理学をより深く理解するためにゼブラフィッシュで実行できるさまざまな遺伝子操作および実験操作を要約します。 これらの方法が腎臓病を治療する潜在的な治療法の開発に役立つことを我々は示唆しています。
関連する研究によると、カンクンは、さまざまな病気の治療に何世紀にもわたって使用されてきた伝統的な中国のハーブです。 抗炎症作用、老化防止作用、抗酸化作用があることが科学的に証明されています。 研究によると、シスタンシェは腎臓病に苦しむ患者にとって有益であることが示されています。 カンクサの有効成分は、炎症を軽減し、腎機能を改善し、損傷した腎細胞を回復することが知られています。 したがって、腎疾患の治療計画にシスタンシュを組み込むことは、患者の状態管理において大きな利益をもたらす可能性があります。 シスタンケはタンパク尿を減らし、BUN とクレアチニンのレベルを下げ、さらなる腎臓損傷のリスクを軽減します。 さらに、カンクサはコレステロールとトリグリセリドのレベルを下げるのにも役立ちますが、これは次のような症状に苦しむ患者にとって危険である可能性があります。腎臓病。
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デビッド・デン
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キーワード:CKD、AKI、ヒト腎臓病、前腎、腎病理のゼブラフィッシュモデル
序章
腎臓は脊椎動物の重要な器官の 1 つで、老廃物を除去し、血液の pH、イオン、代謝産物の濃度を生理学的範囲内に維持します。 腎臓は、赤血球の生成を調節し、骨がカルシウムを吸収するのを助けるビタミンDを活性化するエリスロポエチンを分泌します。 人間の各腎臓には約 100 万個のネフロンがあり、これらはこの臓器の構造的および機能単位です。 その結果、ネフロンの欠陥は腎臓の構造と機能に影響を与えます。 腎臓の機能不全は、遺伝子変異、感染症、怪我、薬剤、または環境中の有毒化合物への曝露が原因で発生する可能性があります。 糖尿病、心血管疾患、高血圧などの慢性疾患は、腎臓疾患の負担に大きく寄与しています (Levey et al., 2010)。 腎機能の障害は、他の臓器系でも合併症のリスクを高めます (Thomas et al., 2008)。 腎臓病の一般的な種類とその原因を表 1 にまとめます。
腎臓病
腎臓疾患は、世界全体の疾患負担のかなりの部分に寄与しています。 世界中で約 7 億 5,000 万人が腎臓関連疾患に苦しんでいます (Crews et al., 2019)。 その中で最も一般的なのは CKD であり、世界的な有病率は 13.4 パーセントです (Hill et al., 2016)。 2010 年の GBD 研究では、CKD が世界の主な死因の 18 位にランク付けされましたが、2017 年には世界最大の死亡原因として 12 位に急上昇しました (Jha et al., 2013; Carney, 2020)。 2017年のGBD研究によると、世界中で約6億9,750万人のCKD症例が報告され、そのうち120万人が死亡した。 CKDによる死亡者数は、最悪のシナリオでは2040年までに400万人に増加すると推定されている(Foreman et al., 2018)。 CKD 患者の 3 分の 1 は、中国とインドの 2 か国に住んでいます (Bikbov et al., 2020)。 正確なデータ収集システムが不足しているため、インド国民における CKD の状況は不明です。 2017 年にインドでは約 1 億 1,500 万人の CKD 症例が報告されました (Bikbov et al., 2020)。 インド人に最も多い病気は糖尿病と高血圧です (Geldsetzer et al., 2018)。 インド医学研究評議会 (ICMR) の報告書によると、都市成人人口における糖尿病と高血圧の有病率はそれぞれ 28 パーセントと 21.4 パーセントです (Varma、2015)。 CKD の 40 パーセントから 60 パーセントの間で、これらの合併症が原因で症例が発生し、その数は急速に増加しています (Rajapurkar et al., 2012)。 国際腎臓学会の腎臓病データセンターは、インド国民における CDK の有病率が 16.8% であると報告しました (Ene-Iordache et al., 2016)。 CKD の原因はインド各地で異なります。 アーンドラ・プラデーシュ州、オリッサ州、ゴアでは、慢性間質性腎症として知られる未知の病因による高レベルのCKDが報告されている（Varughese and Abraham、2018）。 CKD患者の数は世界中で驚くべき速度で増加しているため、一般的な腎臓病の根本原因を徹底的に分析し、予防と治療のためのより良い方法を見つけることが急務となっています。 人間の生理機能や病状を模倣できるモデル生物は、上記の問題に対処するための大きな手段となる可能性があります。 ゼブラフィッシュは、発生や疾患を研究するための有用なモデルとなり、新しい治療標的や薬剤を同定するための有望な方法を提供します。 このレビューでは、ゼブラフィッシュでヒトの腎臓病を再現するさまざまな方法と、これらのモデルを疾患の病原性とその根底にある分子機構を理解するためにどのように使用できるかについて議論しました。 これにより、腎疾患の管理と治癒のための新しい治療アプローチが生み出される可能性があります。
ヒトとゼブラフィッシュの腎臓の類似点
哺乳類の腎臓の発達は、胚形成中に前腎、中腎、後腎という 3 つの異なる構造を通じて起こるため、独特です。 最初の 2 つの構造は哺乳類では一過性であり、後腎のみが生涯を通じて存続します (Smyth et al., 2017; Jain, 2014)。 前腎は、両生類や魚類などの下等脊椎動物の胚発生中の機能的な腎臓であり、後期には機能的な腎臓として中腎に置き換えられます（Tahara et al., 1993; Diep et al., 2015）。 表 2 は、ヒト、マウス、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュのさまざまな形態の腎臓の持続時間を示しています。
腎臓全体の複雑さは高次の形態に進むにつれて増加しますが、ネフロンはあらゆる種類の腎臓の構造的および機能的単位です。 各ネフロンは、血液をろ過する腎小体、溶質を吸収して分泌する尿細管、排泄のために不要な老廃物を収集する集合管の 3 つの部分で構成されています。 尿細管上皮は、特定の機能を実行するためにさまざまなセグメントにパターン化されています。 あらゆる形態の腎臓のネフロンは、同様のセグメント化パターンを持っています (Desgrange and Cereghini、2015)。 ゼブラフィッシュの前腎および中腎のネフロンの分節構成は、図1に示すように、哺乳類の後腎に似ています。ゼブラフィッシュの前腎尿細管は、近位曲折尿細管（PCT）、近位直管尿細管（PST）、および遠位初期尿細管（DE）に分けられます。 ）および遠位後期（DL）尿細管。これらは哺乳類の後腎ネフロンの分節パターンに類似しています。 ゼブラフィッシュは、カルシウム恒常性を維持するスタニウス小体 (CS) と呼ばれる内分泌腺を持っています (Krishnamurthy、1976)。 CS は、DE セグメントと DL セグメントの間の腎上皮細胞の分化転換によって形成され、尿細管から徐々に分離し、成魚の腎臓の表面の後腹膜に位置する対の CS 腺を形成します (Roberts and Ellis、2012; Naylor)ら、2018)。 ゼブラフィッシュと哺乳類のネフロンの主な違いの 1 つは、ゼブラフィッシュにはヘンレのループが存在しないことです。ヘンレのループは、水を節約するための髄質浸透圧勾配を生成する逆流倍数として機能します。 ゼブラフィッシュは淡水魚であるため、このセグメントは何の有用性もありません（Elmonem et al., 2018）。 各体節は、脊椎動物間で保存されている、異なる細胞型と体節特異的な遺伝子発現を持っています (Verlander, 1998; Desgrange and Cereghini, 2015)。 すべての種類の腎臓は同様の発達経路をたどります。 ネフロンの発達には次の 4 つの段階が連続して関与します。 A: 腎臓原基を形成するための中間中胚葉の誘導、B: 腎管の上皮化と成長、C: 特殊なセグメントへのネフロンのパターン化、および D: 血液濾過のためのネフロンの血管新生 (Drummond、2003)。
ヒト腎疾患のゼブラフィッシュモデルを作成する方法
ゼブラフィッシュは 1 対の前腎を持ち、受精後 12 時間 (hpf) 後に形成され始め、48 hpf までに完全に機能するようになります。 全ゲノム配列の利用可能性、少なくとも 1 つのゼブラフィッシュ オーソログを持つヒト遺伝子の 71%、取り扱いの容易さ、透明な胚、短い世代時間、効率的な遺伝子操作技術、トランスジェニック魚の生成方法とその迅速なスクリーニングにより、ゼブラフィッシュは、腎臓の異常を研究する（Howe et al., 2013; Poureetezadi and Wingert, 2016）。 成体のゼブラフィッシュの重要な特徴の 1 つは、腎損傷に応答して新腎形成のプロセスによって新しいネフロンを再生する能力です (Chambers and Wingert、2016)。 表 3 は、ゼブラフィッシュと、マウスやアフリカツメガエルなどの他の一般的なモデル生物との比較を示しています。 ゼブラフィッシュの遺伝子操作により、このモデル生物を使用することで腎臓の発達と機能の新しい遺伝的要素を同定できることが示されました（Poureetezadi and Wingert、2016）。 ヒト腎臓病のゼブラフィッシュ モデルを作成するには、いくつかの方法があります。
順方向遺伝学
フォワードジェネティクススクリーニングは、目的の表現型に関連する遺伝子を同定するために使用されます (Lawson and Wolfe、2011)。 化学的突然変異誘発と挿入的突然変異誘発の両方が順遺伝学スクリーニングで使用されます (Patton and Zon、2001)。 化学的突然変異誘発は、成人男性をメタンスルホン酸エチル (EMS)、ニトロソウレアエチル (ENU) などの化学的突然変異原、またはガンマ線などの物理的突然変異原で処理して、生殖細胞にいくつかの突然変異を生成する 3 世代ベースのスクリーニングです (Varshney とバージェス、2014)。 次に、突然変異を持った魚を野生型のメスと交配して、生成された突然変異の固有の対立遺伝子を含む F1 魚を生成します。 F1 の魚を異系交配して F2 保因者を生成し、その後内交雑して F3 世代のホモ接合変異体を取得します。 次いで、所望の表現型を有する子孫が単離され、変異遺伝子を同定するための遺伝子マッピングおよび配列決定に使用される(Patton and Zon, 2001)。 一倍体やホモ接合性二倍体の使用など、このスクリーニングの他のバリエーションは、表現型と原因となる遺伝子変異を同定するのに必要な時間と労力を削減するのに役立ちます (Patton and Zon, 2001 によって詳細に議論されています)。 対象の臓器で蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックレポーター株を従来のフォワードジェネティックスクリーニングと組み合わせて、対象の変異体を簡単にスクリーニングできます。 ENU ベースの突然変異誘発スクリーニングにより、レチノイン酸 (RA) 欠損ゼブラフィッシュ胚と同様の形態学的およびネフロン分節欠陥を示す電球 (lib) 突然変異ゼブラフィッシュが同定されました。 lib 変異体は aldh1a2 のヌクレオチド 174 で C から A への転移を有することが判明し、これにより 58 アミノ酸長の切断されたタンパク質が合成され、その結果、aldh1a2 の機能が失われ、レチンアルデヒドからの RA の合成に影響を与えると予測されています。 aldh1a2 および DEAB (レチノイン酸合成阻害剤) 処理胚の触媒ドメインに点突然変異を有する lib, ネックレス (nls) 変異体の分析により、RA のレベルがセグメント特異的な転写因子の空間的発現を変化させることによってネフロンの分節化を調節することが明らかになりました (Wingert およびDavidson、2011; Begemann et al.、2001; Mullins et al.、1994)。 Zeppelinと呼ばれる別の変異体は、有足細胞の発生の調節因子としてbrac2を同定するのに役立った(Kroeger et al., 2017)。
挿入突然変異誘発は、異なるゲノム遺伝子座にランダムに DNA を挿入するために使用されるトランスポゾンまたは抗ウイルスに基づく方法であり、この外来 DNA は突然変異遺伝子の同定に役立ちます (Amsterdam et al., 1999)。 MIT のホプキンス研究所は、レトロウイルス ベクターを使用してゼブラフィッシュ胚における挿入突然変異誘発スクリーニングを実施しました。 彼らは、糸球体尿細管領域における嚢胞を示す欠陥のある腎臓の表現型に関連する12の遺伝子を同定し、そのうちの4つは繊毛形成に関連していた(Sun et al., 2004)。 順遺伝学アプローチの欠点は、スクリーニングプロセスが煩雑で時間がかかることです。 しかし、新しい配列決定技術の進歩により、順遺伝学アプローチはより効率的になりました。
プログラム可能なヌクレアーゼを使用した遺伝子ノックアウト
ゼブラフィッシュをモデル生物として使用する主な利点の 1 つは、CRISPR/Cas、TALEN、ZFN などの効率的なゲノム編集技術が利用できることです (Sertori et al., 2016)。 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromicrepeat)/Cas9 は、ゼブラフィッシュで最も多用途で一般的に使用されているゲノム編集技術です。 CRISPR RNA (crRNA) とトランス活性化 crRNA (tracrRNA) のキメラはシングルガイド RNA (sgRNA) として設計され、Cas9 タンパク質/mRNA とともに 1 細胞段階のゼブラフィッシュ胚に注入されます (Varshney et al. 、2016）。 sgRNA は、ゲノム内のプロトスペーサー隣接モチーフ (PAM) NGG 配列に隣接する 20 bp の標的 DNA 配列に結合し、Cas9 は標的 DNA 配列に二本鎖切断を生成します。 これは、好ましくは、非相同末端結合によって修復される。これは、コード配列の読み枠の変化につながるランダムな挿入/欠失（インデル）の生成をもたらし、その結果、エラーが発生しやすい修復メカニズムである。目的の遺伝子の機能。 近年、CRISPRベースのゲノム編集技術の有効性を高めるための高度な方法論が開発されています（Liu et al., 2019）。 一度に 2 つ以上の sgRNA を使用して、DNA の大きな断片を削除することが可能です (Kim and Zhang、2020)。 単一のゼブラフィッシュ胚において複数の遺伝子を同時に効率的に標的とすることも可能である(Shah et al., 2016)。 CRISPR/Cas9 テクノロジーを使用して、ヒトの腎臓病を再現するゼブラフィッシュ変異体を作製するために多くの研究が行われています。 CRISPRを介した毛様体膜タンパク質Arl13bのノックアウトは、「ジュベール症候群」を模倣する変異体の生成をもたらした(Cantagrel et al., 2008)。 ヒト ELMO1 遺伝子の変異が糖尿病性腎症の一因となることが報告されています。 elmo1変異体ゼブラフィッシュは、より大きな糸球体、欠損足細胞、より短い首、過濾過など、pdx1遺伝子のノックダウンによって生成された高血糖胚に見られる表現型を示し、したがってこの遺伝子の保存された機能が強調されています（Sharma et al.、2016）。 変異型 magi2a ゼブラフィッシュは、MAGI2 に変異がある人々にも観察されるステロイド抵抗性ネフローゼ症候群を示します (Jobst-Schwan et al., 2019)。 これらの観察は、ゼブラフィッシュがヒトの腎臓病をモデル化する生物として適切であることを強調しています。
ゼブラフィッシュ変異体を生成する別の方法は、ゲノム編集に基づく転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ (TALEN) です。 この技術では、DNA 結合ドメイン TALE はモノマーで構成され、各モノマーは DNA 配列内の特定のヌクレオチドに結合する 34 アミノ酸残基のタンデム反復で構成されます。 これらの TALE 配列は、宿主細胞内の遺伝子の転写を変化させる病原性細菌 Xanthomonas に由来します (Boch and Bonas、2010)。 TALEN ターゲティング構築物は、核局在化シグナル、DNA 結合ドメイン、およびカルボキシル末端の FokI ヌクレアーゼ ドメインから構成されます。 TALEN は、12 ～ 25 bp のスペーサー配列によって分離された DNA の反対側の鎖に結合部位が位置し、ペアで機能します。 構築物は核内の標的部位に結合し、二本鎖切断を生成し、その後、非相同末端結合によって修復されます (Liu et al., 2014)。 CRISPR または TALEN によって生成された変異ゼブラフィッシュは、目的の遺伝子の損失を補う遺伝子を活性化する可能性があるため、遺伝子機能を明らかにすることが困難になります (Rossi et al., 2015)。 ただし、次世代シーケンス (NGS) 法を使用したトランスクリプトーム解析によってこれらの代償遺伝子を同定することは可能であり、これは目的の遺伝子の機能を同定するのに役立ちます。 遺伝子の機能喪失を補う遺伝子および分子経路の同定は、重篤な疾患を引き起こす遺伝子変異に対する新たな治療法の発見に役立ちます (El-Brolosy and Stainier、2017)。
モルフォリノアンチセンスオリゴを用いた遺伝子ノックダウン
モルホリノは、DNA または RNA オリゴマーと比較して比較的安定な非アニオン性オリゴヌクレオチドです (Summerton、1999)。 モルホリノ アンチセンス オリゴヌクレオチドは、標的タンパク質の翻訳開始部位で mRNA に結合し、その翻訳をブロックします。 別のタイプのモルフォリノ アンチセンス オリゴは、スプライシング ジャンクションを標的にし、プレ mRNA スプライシングをブロックすることができます (Summerton、1999)。 モルホリノ アンチセンス オリゴの効果は一時的であり、目的の遺伝子の発生初期の役割を研究するために使用できます。 モルフォリノ アンチセンス オリゴの注入はゼブラフィッシュ胚の 1-4 細胞段階で行われ、その効果は受精後 3-5 日まで確認できます (pdf) (Bill et al., 2009)。 モルフォリノ アンチセンス オリゴヌクレオチドは、オフターゲット効果を示すことがよくあります (Robu et al., 2007)。 レスキュー実験などの対照実験は、このアンチセンス オリゴの標的にできない mRNA とともにモルフォリノを注入して、その特異性を確認することによって実行する必要があります (Eisen and Smith、2008)。 光活性化モルホリノが開発されており、その活性は UV 曝露によって空間的および時間的に制御できます (Tallafuss et al., 2012)。 ヒトの腎臓病を理解するために、モルフォリノ アンチセンス オリゴを介した遺伝子ノックダウンを使用して数多くの研究が行われています。 例えば、ネフロシスチン-3遺伝子のノックダウンは、ネフロン結石症型-3疾患と同様の方法で、ゼブラフィッシュ胚における嚢胞の形成と水頭症を引き起こした(Zhou et al., 2010)。
多くの生命を脅かす感染症の治療に一般的に使用されるアミノグリコシド系抗生物質は、腎毒性および聴器毒性効果があることで知られています (Mingeot-Leclercq および Tulkens、1999)。 ゲンタマイシンは、ゼブラフィッシュに急性腎障害 (AKI) を誘発する可能性がある一般的に使用される抗生物質です。 ゲンタマイシンは刷子縁上皮の平坦化、尿細管上皮の喪失、糸球体構造の変形、リソソーム性リン脂質症、尿細管内腔における白血球または細胞破片の蓄積を引き起こし、これはヒトにおけるゲンタマイシンの過剰摂取を模倣します（Cianciolo Cosentino et al., 2010）。 ゼブラフィッシュは、損傷したネフロンを再生して置き換えることができます。 ゲンタマイシン傷害は、ゼブラフィッシュの腎再生を研究するために使用できます（Kamei et al.、2015）。 ゲンタマイシン損傷は再生反応を誘導し、腎臓幹細胞が特定、増殖、分化の段階を経て新しいネフロンを生成するように促します。 成魚ではネフロンが再生されるまでに約 14 ～ 21 日かかります (Diep et al., 2011; McCampbell et al., 2015)。 腫瘍を治療するための化学療法薬として使用されるシスプラチンも、ゼブラフィッシュで観察されたように、腎毒性作用を有する(Hentschel et al., 2005)。 エチマイシンは、ゼブラフィッシュ胚における低い腎毒性と聴器毒性を模倣しながら使用できる別のアミノグリコシドです（Shao et al.、2020）。 したがって、これらの抗生物質の助けを借りて、AKI と腎臓の再生をゼブラフィッシュで研究することができます。
腎臓への機械的損傷
ゼブラフィッシュの前腎は、切除、刺し傷、または冷凍傷害によって物理的に損傷を受ける可能性があります。 外科的損傷は、細いピンセットを使用して前腎の目的の領域を刺し、AKI モデルを作成することによって実行できます。 この技術は、総排出腔に近い前腎管を損傷するために使用され、体液の流れが損なわれ、30 分以内に嚢胞形成が引き起こされました (Kramer-Zucker、2005)。 前腎における体液流量の減少により、体液流入部位に背圧が発生し、尿細管内腔の拡張と嚢胞形成が引き起こされることが判明しました。 別の研究グループは、ピンセットを使用して遠位集合管付近の領域をつまみ取ることにより、50 hpfで前腎尿細管、または12-月齢のゼブラフィッシュの中腎尿細管に閉塞を作成しました（Hellman et al., 2010）。 彼らは、尿細管の瘢痕化が繊毛の拍動速度の増加と、脂質生成遺伝子の発現を調節するfoxj1a転写因子の上方制御につながることを発見した。 これは、前腎尿細管の損傷により、ネフロンの恒常性を維持するために繊毛に基づく機械感覚シグナルが生成されることを示唆しています。
レーザー誘発性腎損傷
レーザー媒介細胞アブレーションは、腎損傷を研究し、ゼブラフィッシュの AKI を模倣するためのツールとして使用されます。 Johnson et al., (2011) は、レーザー媒介アブレーションとそれに続く再生ネフロンの追跡の方法について説明しています。 彼らは、ゼブラフィッシュ胚の体幹体節に40 kDaのデキストラン-FITCを48-55 hpfで注入して近位尿細管上皮細胞を標識し、その後、72 hpfでのレーザー媒介アブレーションの標的としました。 次に、切除された胚にローダミン デキストランを再注入して、近位尿細管上皮細胞を追跡しました。 彼らは、完全に発達した近位尿細管がレーザー媒介アブレーション後 7 日目に形成されたことを発見した (Johnson et al., 2011)。 別の選択肢は、腎臓特異的トランスジェニック株を使用して、レーザー媒介アブレーションのための細胞を同定し、隣接する細胞の挙動をモニターすることである。 波長 405 nm の紫色レーザー光を使用して、Tg(atp1a1a.4:GFP) ゼブラフィッシュの前腎尿細管を標的にしました (Palmyre et al., 2014)。 GFP 励起スペクトルは青から紫の光の範囲にあるため、GFP は 405 nm レーザー光を吸収し、エネルギーシンクとして機能し、標的上皮細胞に傷害を引き起こす可能性があります。 この実験により、細胞遊走が損傷した上皮の主な反応であることが発見されました。 集団的な細胞遊走は機械的伸長を引き起こし、損傷した尿細管を修復するために細胞増殖の刺激を与えました。 ゼブラフィッシュの前腎尿細管が再生能力を獲得する時期を決定するために、Yakulov et al., (2018)は2-フォトンレーザーを使用してTg(cldn2b:lyn-GFP)の前腎尿細管の一部を切除しました。異なる時点で胚を観察し、再生プロセスを追跡しました。 彼らは、2-日齢の胚の前腎尿細管の切除は移動反応によって迅速に修復されたが、1-日齢の胚にはこの能力がないことを発見した。 彼らは、損傷したゼブラフィッシュ胚の遺伝子発現プロファイリングを実施し、cxcr4bと雲母がこの修復プロセスに関与していることを発見した(Yakulov et al., 2018)。
化学遺伝学
小さな生理活性分子を使用すると、タンパク質の機能を妨害し、その生物学的役割を理解できます。 タンパク質の機能を調べるために、多数の化学ライブラリーが市販されているか、カスタムメイドすることができます。 これらの小分子ライブラリーには、キナーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、核内受容体、および器官の発達と機能に関与するシグナル伝達経路の役割を特定するために使用できるリガンドが含まれます (Kawasaki and Nghiem、2007)。 過去数十年で、ゼブラフィッシュは、ハイスループットの化学スクリーニングおよび表現型スコアリングのための強力な脊椎動物モデル生物として浮上しました（Kaufman et al.、2009）。 Cao et al., (2009) は、化学スクリーニングアプローチを使用して、pkd2 (PKD の原因遺伝子) および ift172 (繊毛形成に関与する遺伝子) の変異によって引き起こされる表現型を逆転させることができる化合物を同定しました。 彼らは、汎ヒストン脱アセチル化酵素（汎HDAC）阻害剤トリコスタチンA（TSA）とクラスI特異的HDAC阻害剤バルプロ酸（VPA）がpkd2ノックアウトモデルにおける腎嚢胞形成を抑制できることを発見した（Cao et al., 2009） ）。 したがって、化学遺伝学は、病状を逆転または抑制できる新薬候補を特定するための有用なツールとなり得ます。
遺伝的に誘発可能な腎損傷モデル
遺伝的に誘導可能な組織切除モデルは、前腎の特定のセグメントで NTR の発現を駆動する選択したプロモーターの制御下で細菌性ニトロレダクターゼ (NTR) が発現されるゼブラフィッシュで使用できます。 NTR はメトロニダゾールを、NTR 発現細胞の死を引き起こす可能性がある細胞傷害性代謝産物に変換します (Curado et al., 2008)。 Zhou と Hildebrandt (2012) は、この技術を使用して、Tg(pod: NTR-mCherry) ゼブラフィッシュ系統のポドシン プロモーターの制御下で NTR を発現させることにより足細胞の損傷を誘導しました。 彼らはまた、Tg(pod: NTR-mCherry) 系統とともにタンパク尿のトレーサーとして VDBP-GFP (GFP タグ付きビタミン D 結合タンパク質) の二重トランスジェニック系統を開発しました。 メトロニダゾールによる治療は有足細胞の損傷を引き起こし、全身浮腫と近位尿細管での VDBP-GFP の蓄積を引き起こし、ヒトのネフローゼ症候群の表現型を模倣しました (Zhou および Hildebrandt、2012)。
ゼブラフィッシュの前腎の発達と機能を評価する方法
ゼブラフィッシュを使用してヒト腎臓病モデルを作成する方法を説明しました。 別の生物を使用した疾患モデルの作成は最初のステップであり、ヒトに見られる疾患のさまざまな側面を忠実に再現する能力を評価する必要があります。 ゼブラフィッシュには、以下で説明するように、ヒトの腎臓病を理解するための代用として機能する能力を迅速に評価するために使用できる多くの利点があります。
形態学に基づくスクリーニング
ほとんどの場合、突然変異ゼブラフィッシュ胚は、野生型と比較して形態学的差異を示しますが、これは顕微鏡での観察によって容易に判断できます。 ゼブラフィッシュ胚の透明性と、重度の発育欠陥があっても最大 5 日間生存できる能力は、形態学に基づくスクリーニングにおける大きな利点です。 前腎に欠陥のあるゼブラフィッシュ胚で観察される一般的な形態学的変化には、心膜浮腫、前腎嚢胞、湾曲した体軸、および水頭症が含まれます (Poureetezadi and Wingert, 2016; Outtandy et al., 2019)。 浮腫は、腎臓の欠陥の一般的な兆候の 1 つであり、心臓の発達などの他の臓器の欠陥でも見られます (Hanke et al., 2013)。 腎臓欠損を有する変異体は、顕微鏡で容易に観察できるように、上皮細胞の他の増殖により嚢胞を発症する可能性がある(Zhao and Malicki, 2007; Yamaha et al., 2006)。 湾曲した体軸は、前腎繊毛欠損を有する変異体でよく見られます。 Locke (lok)、shen yantf214a(shy)、garbustm304 (grb)、zatortg238a (zar) などの変異ゼブラフィッシュは、湾曲した体軸を示す他の例です (Zhao および Malicki、2007)。 腎臓に欠陥をもつゼブラフィッシュ変異体は、同じ胚に複数の形態学的欠陥を示します。 2 つのポリシスチン遺伝子 pkd1a および pkd1b のノックダウンにより、口腔湾曲体軸、水頭症、軟骨、および前腎嚢胞の頻度が低い頭蓋顔面欠損が引き起こされました (Mangos et al., 2010)。 繊毛が欠損している鞭毛内輸送タンパク質ift57、ift88、およびift172の変異体は、腹側に湾曲した体軸を持っていた(Lunt et al., 2009)。 したがって、腎臓に欠陥のあるゼブラフィッシュ変異体は、容易に識別できる多くの形態学的特徴を示します。
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