ジャスモン酸メチルは、ザクロ（Punica Granatum L.）の葉で特徴的な加水分解型タンニン、ファボノイド、およびフィトオキシリピン応答を誘発しますパート2
Mar 18, 2022
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MeJAで処理したザクロの葉で脂質が遊離酪酸とフィトオキシリピンに変換された
フラボノイドとアントシアニンに加えて、脂質分子の変化は、MeJA誘導後72-時間のザクロの葉でも明らかでした（図5a）。 示差的に蓄積された102の代謝物のうち、23は脂質、酪酸、またはフィトオキシリピンでした（表S6）。蓄積の増加を示したモノアシルグリセロール（MAG）（18：4）異性体1とは対照的に、MAG（18： 1）異性体、MAG（18：3）異性体4、ガラクトシルモノアシルグリセロール（DGMG）（18：2）異性体、DGMG（18：2）異性体2、DGMG（18：2）異性体3、モノガラクトシルモノアシルグリセロール（MGMG）（18：2）異性体、およびMGMG（18：2）異性体2は、MeJAを葉に適用すると3-5倍減少しました（図5a;表S6）。リン脂質LysoPC 18： 0および18：1は、MeJA処理した葉で2倍を超える増加を示しました（表S6）。
外因性MeJAアプリケーションは、ザクロの葉でJAとイソロイシン（JA-Ile）のレベルをそれぞれ4倍と2倍に上昇させました（表S6）。 さまざまな非JA植物性オキシリピン、脂肪酸ヒドロペルオキシド、エポキシ脂肪酸、ヒドロキシ脂肪酸、ケト脂肪酸、およびアセチレン酪酸、特にMeJA処理した葉で増加しました（図5a;表S6）。 ザクロの種子油に豊富に含まれるPUFA（18：3）であるプニカ酸の蓄積の増加は、MeJAで処理した葉でも観察されました（表S6）。
図3フラボノイドとアントシアニンのレベルはメチルジャスモン酸（MeJA）アプリケーション。 処理後72-時間に収穫された、模擬処理された対照と比較して、MeJA処理されたザクロの葉の蓄積が増加、減少、および有意に変化しない（2倍のしきい値）代謝物は、緑、赤、それぞれと青。 液体クロマトグラフィー-エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析で検出されなかった経路中間体は黒で示されています。 破線の矢印は、複数の反応ステップを示しています。
MeJA処理ザクロの葉における酪酸修飾の候補LOXの生化学的特性化
酪酸代謝のフィトオキシリピンへの変化に関与する代謝遺伝子を探索するために、モックおよびMeJAで処理したザクロの葉のトランスクリプトームを分析して、リパーゼまたはLOXとして注釈が付けられたDEGを調べました.2つのリパーゼ遺伝子Pgr004895およびPgr001125は発現の増強を示しました24- hのMeJA処理後のトランスクリプトームで、リアルタイムqPCR分析によって発現の有意な増加が確認されました（図5b）。 一方、リパーゼPgr024441は、トランスクリプトーム解析で発現の低下を示しましたが、これはリアルタイムqPCRの結果では裏付けられませんでした（図5b）。 興味深いことに、推定LOXであるPgr025417の発現の上昇が、MeJA処理後の2- h、6- h、24- h、および72-hに収集された葉のトランスクリプトームで観察されました。 （図S1）。 リアルタイムqPCR分析はさらに、MeJA処理の2時間から72-時間後に収集された葉において、4-から20-倍の範囲でPgr025417の発現が継続的に増加することを示しました（図5c）。
Cistancheは免疫力を向上させることができます
推定LOX（Pgr 0 25417）がMeJA処理した葉のフィトオキシリピン産生の増加に関与していたかどうかを判断するために、その配列と活性を調べました。 Pgr025417のアミノ酸配列を分析したところ、大豆LOX L -1（Minor et al.1996）の活性部位の鉄原子を配位する残基に対応するHis、Asn、およびIle残基がPgr025417（図6a）。 さらに、PgrO25417は葉緑体に局在すると予測され（尤度確率0.9096）、シグナルペプチドは64〜65 aaの間で切断されます（図6a）。 注釈付きザクロゲノムで同定された11の推定LOX（786aaから970aa）のうち、5つの他のLOX：Pgr025413、Pgr025418、Pgr009839、Pgr016852、およびPgr013780は、Pgr025417および他の植物で特徴づけられるタイプIILOXのグループに加えて葉緑体であると予測されます（図6b）。 興味深いことに、Pgr008562、Pgr025678、Pgr018982、およびPgrO18980は、双子葉型I型LOXとクラスター化されています。 Pgr020032は他のタイプのILOXとより遠い関係にあります（図6b）。PgrO25417の酵素活性を決定するために、組換えタンパク質（906 aa、〜102 kDa;図6c）を基質としてリノール酸を使用してアッセイしました。 リノール酸の酸化生成物は、Pgr025417によって生成されました。これは、反応混合物に組換えタンパク質の量が増加した場合に、598 nmでの吸収が大きくなることで示されています（図6d）。
ザクロの葉における外因性MeJA適用に対する転写応答
To understand whether the changes in HTs,flavonoids, lipids, fatty acids, and phyto-oxylipins are regulated transcription-ally, transcriptomes of MeJA-and mock-treated pomegranate leaves collected at2-h,6-h,24-h,and72-h were compared and identified 34 transcription factors(TFs) that showed differen-tial expression (Log,FCl>1、調整済みP<0.05)(table 1);31="" of="" these="" tfs="" also="" exhibited="" significantly="" changed="" expression="" by="" real-time="" qpcr="" analysis="" (fig.7).="" notably,="" a="" zinc-finger="" tf="" pgr009895="" showed="" increased="" expression="" at="" three="" out="" of="" the="" four="" time="" points(2-h,24-h,and="" 72-h)(fig.7a).the="" expression="" of="" pgr002863(pcf5-like),pgr002859(bzip1)and="" pgr006935(auxin="" response="" factor)was="" increased,="" and="" pgro11269="" (myb)="" decreased="" upon="" meja="" elicitation="" at="" two="" time="" points(fig.="" 7a,="" b).both="" pgro09366(anthocyanin="" regu-latory="" c1="" protein/myb)and="" pgro03015(myb)displayed="" increased="" expression="" at="" 6-h,="" but="" decreased="" expression="" at="" 72-h="" (fig.="" 7b).the="" expression="" of="" 12="" tfs="" was="" enhanced="" at="" only="" one="" time="" point,including="" pgr009357(2-h),pgr027831="" (2-h),pgr023581(6-h),pgr009363(6-h),pgr000147="" (6-h),="" pgr021507(6-h),="" pgr021504(6-h),pgr020147(24-h),="" pgr025715(72-h),pgr023629(72-h),pgr015728(72-h),and="" pgr004388(72-h)(table="" 1;fig.7b,c).on="" the="" other="" hand,="" the="" expression="" of="" 12="" tfs="" was="" suppressed="" in="" meja-treated="" pomegranate="" leaves="" at="" one="" time="" point,="" including="" pgr013499="" (2-h),pgr023409="" (2-h),pgr017106(6-h),pgr010911(24-h),pgr017568(72-h),pgr024750(72-h),pgr004878(72-h)pgr002084(72-h),pgr008889(72-h),pgr004532(72-h),="" pgr020131="" (72-h),and="">
MeJA誘導時にフラボノイドおよび酪酸/フィトオキシリピン経路の調節に機能する可能性のある候補遺伝子の転写調節を評価するために、PlantRegMap（Tian et al.2020）を使用して候補遺伝子のプロモーター領域のTF結合部位を予測しました。 Myrtalesのザクロと密接に関連しているEucalyptusGrandisから生物情報学的に同定されたTF（表S7）。 PgrO25417（推定LOX）の場合、MYB（10 TFs.15サイト）およびWRKY（11 TFs、18サイト）の豊富な結合部位を含む65 TFの80の結合部位が特定されましたが、双極ジンクフィンガーTFの結合部位はありません（表S7）。 CHSとCHIはフラボノイドとアントシアニンの生合成経路の入り口に位置し、トランスクリプトームとリアルタイムqPCR分析（図S1と4）で遺伝子発現の低下を示したため、推定CHS（Pgr005566）とCHI（Pgr025966）のプロモーター推定上のTF結合部位についても分析された。 CHSの場合、76個のTFの104個の結合部位があり、MYB（20個のTF、23個の部位）とLH（13個のTF、23個の部位）が最も豊富なTFです（表S7）。 CHIの場合、78 TFの93の結合部位があり、bHLH（16 TF、23部位）とWRKY（13 TF、13部位）が最も豊富なTFです（表S7）。
討論
外因性MeJAアプリケーションによって誘発される独特の代謝変化は、MeJAに対するザクロの反応におけるHT、メチル化フラボン/フラボノール、およびフィトオキシリピンの機能を示唆しています。
MeJAは、植物のストレス応答を誘発する役割を示しています（Cheong and Choi2003）。 葉における2つのHT経路中間体-グルコガリンとペンタガロイルグルコースの蓄積は、MeJA適用後30- hで誘導され（図2b）、環境中の非生物的および生物的ストレスに応答して作用することを示唆しています。 この結果はまた、果実の皮の組織における非生物的ストレスからザクロを保護する際のHTの機能を裏付けています（Schwartz et al.2009; Habashi et al.2019）。 これに対応して、HT代謝物の蓄積、シキミ酸、およびHT生合成経路遺伝子の増加も発現の増加を示しました（図1）。 4つのブドウ（Vitis vinifera）SDHアイソフォームの以前の生化学的特性は、VvSDH3とVySDH4のみが3-デヒドロシキメートから没食子酸を生成できることを示しました（Bontpart et al.2016）。 トランスクリプトームおよびリアルタイムqPCR分析によると、WvSDH3のホモログであるPgSDH3_1およびPgSDH3_2は、VSDH4のホモログであるPgSDH4ではなく、MeJAによる誘導発現を示しました（図S1および1）。 。 この観察結果は、PgSDH3_1とPgSDH3_2がMeJA処理と環境ストレスに応答したHTの合成に関与している可能性が高いことを示唆しています。 さらに、MeJAアプリケーションによるHT生合成の関与段階を触媒する酵素をコードするPgUGT8423およびPgUGT84A24の発現の増強は、ストレス応答におけるHTの役割をさらにサポートします。
MeJA誘導後72-時間で、ザクロの葉でフラボノイドとアントシアニンの全体的な抑制が見られました（図3;表S6）。これは、他の多くの植物で観察されたこれらの化合物の蓄積の増加とは対照的です（Pandey et al.2016; De Geyter et al.2012; Shafiq et al.2011; Flores and Ruiz del Castillo 2014; Portu et al.2015）。 ただし、3つのメチル化フラボンとフラバノール：5- O-ヘキソシドを販売するジ-O-メチルケルセチン、およびクリソエリオールO-ヘキソシル-O-ヘキソシドは、非メチル化生合成前駆体の減少にもかかわらず、より高いレベルで蓄積されました（図3;表S6）。 モノ-およびジ-O-メチル化ケルセチンはナス科の種の毛状突起から分泌され、おそらく種特異的な方法で植物の防御に作用することが提案されています（WollenweberandDörr1995; Roda et al.2003）。 また、クリソベリル、ルテオリン、およびアピゲニンの配糖体が、ガシャモク（池草）への水生草食動物の摂食を阻止し、in vitroアッセイを行うことが示されました（Erhard et al.2007）。 メチル化の誘発された蓄積フラボン/フラボノールザクロの葉では、MeJAが誘発するストレス応答に関与している可能性があり、この樹種の傷、病原体、草食動物に対する防御に影響を与える可能性があることを示唆しています。
HT、フラボノイド、およびアントシアニンに加えて、追加の注目すべき代謝変化には、脂質からの遊離酪酸の動員およびMeJA適用後72-時間でのフィトオキシリピンの生合成が含まれます（図5a）。 MeJA誘導時のプニカ酸（18：3、cis -9、trans -11、cis -13）の3倍の増加は、3つの共役二重結合システムを持つこのPUFAの潜在的な役割を示唆しています。ザクロ植物のストレスシグナル伝達または直接的な化学的防御（表S6）。 MAG、MGMG、およびDGMGの同時減少は、プニカ酸が通常ザクロの葉のこれらのグリセロ脂質に結合する可能性があることも示唆しています（図5a;表S6）。 植物オキシリピンのうち、MeJAで処理したザクロの葉のJAおよびJA-Ileの上昇は、外因的に適用されたMeJAの脱メチル化によるJAの形成に起因する可能性があり、その後JA-Ileに変換されます（表S6）（Stuhlfelder et al .2004）。 また、MeJAがザクロにおけるJAとその誘導体の生合成を直接調節できることを示唆しているかもしれません。 フィトオキシリピンに由来する揮発性化合物は、創傷および病原体の攻撃に対するシグナル伝達応答に関与していると報告されています（Lim et al.2017）。 最近の研究では、非JAフィトオキシリピンの直接的な抗菌作用も明らかになっていますが、そのような機能のメカニズムの基礎はまだ不明です（Deboever et al.2020）。 ザクロでのフィトオキシリピンの誘導性生産は、他の植物での以前の観察を裏付けています。 これらのフィトオキシリピンが殺生物性であるか、ザクロの自然免疫応答を刺激するように機能するかどうかはまだ決定されていません。
MeJA誘導時の修飾フラボノイドおよびアントシアニン（フィトオキシリピンではない）代謝は、転写レベルで少なくとも部分的に調節されています
フラボノイドとアントシアニンの一般的な蓄積の減少と一致して、フラボノイドとアントシアニンの生合成の入り口に位置する2つの酵素であるCHSとCHIをコードする遺伝子は、MeJA処理した葉で発現の減少を示しました（図4）。 興味深いことに、トウモロコシMYB TFアントシアニン調節タンパク質C1のザクロホモログ（PgrO09366）は、最初は6- hでMeJA処理葉でアップレギュレーションされましたが、72- hでMeJA処理葉でダウンレギュレーションされました（表1 ;図7b）。 トウモロコシMYBTFPのザクロホモログ（PgrO10911）は、24- hでMeJA処理した葉でダウンレギュレーションされました（表1;図7c）。 トウモロコシの研究で実証されているように、Clは、CHS（C2）、ジヒドロフラボノールレダクターゼ（A1）、アントシアニジン3- O-グルコシルトランスフェラーゼ（BZ1）、ロイコアントシアニジンジオキシゲナーゼ（ A2）（Lesnick and Chandler 1998; Sainz et al.1997; Quattrocchio et al.1993）。 一方、PはA1の発現を制御しますが、BZ1は制御しません（Grotewold et al.1994）。トウモロコシでは、C1（MYB TF）はR（bHLH TF）と協調して働き、アントシアニン生合成遺伝子の発現を調節します（ Mol et al.1998; Goff et al.1992）。 bHLH TFであるPgr024750も、MeJA処理した葉で72- hにダウンレギュレーションされ、ザクロC1ホモログの潜在的なパートナーになる可能性があります（表1;図7c）。 さらに、MYBおよびbHLH TFの結合部位は、バイオインフォマティクス分析により、推定ザクロCHSおよびCHIのプロモーター領域で同定されました（表S7）。 まとめると、これらの結果は、フラボノイドとアントシアニンの全体的な減少が、初期段階の生合成遺伝子の転写制御によって少なくとも部分的に達成されることを示唆しています。
MeJAで処理した葉では、いくつかのグリセロ脂質の減少が観察されました（図5）。 ただし、植物脂質生合成の「マスター」レギュレーターと見なされているAPETALA2（AP2）ファミリーTFであるArabidopsis Wrinkled1（ArWRI1）のザクロホモログ（GenBankアクセッション番号：XP_031374952およびXP_031374953） （Cernac and Benning 2004）、モックおよびMeJAで処理した葉で同様に発現しました（データは示していません）。 MeJA誘導に応答するTFの機能的特徴（表1;図7）は、ザクロの葉における脂質代謝の調節的役割を明らかにする可能性があります。
外因性MeJAの適用後に発現が継続的に増加し、脂肪酸酸化を触媒し、葉緑体に局在すると予測されたザクロLOX（Pgr025417）（図5cおよび6）。 したがって、Pgr025417は、この細胞内区画で起こるJA生合成に関与している可能性があります（図6）。 ザクロの11の推定LOXのうち、5つは細胞質ゾル（タイプI）で、6つはクロロプラスチック（タイプII）です（図6b）。 非JAフィトオキシリピンはサイトゾルで合成されるため（Ponce de Le6n et al.2015）、MeJA誘導時に1つまたは複数のタイプILOXがPUFAから非JAフィトオキシリピンへの変換に関与している可能性があります。 MeJA処理葉における遺伝子発現の持続的な増加を伴うLOX（Pgr025417）が、非JAフィトオキシリピンとは異なる細胞内区画に位置することを考慮すると、MeJA誘導非JAフィトオキシリピンの生成に関与する酵素がありそうです。転写的に調節されない。
外因性MeJAアプリケーションはザクロの葉で転写応答を誘発しました
シロイヌナズナでの最近の研究では、MYC（bHLH）、エチレン応答因子（ERF）、およびMYBファミリーTFが豊富な複雑な調節ネットワークが初期のMeJA誘導転写応答に関与していることが明らかになりました（Hickman et al.2017）。 Pgr013499（2- h）、PgrO00147（6- h）、PgrO21504（6- h）を含むERF TF、およびPgrO09357（2- h）を含むMYBTFのホモログ）、Pgr009366（6- h）、Pgr003015（6- h）、およびPgr011269（6- h）は、初期の時点で収集されたMeJA処理葉でさまざまな発現を示すTFの1つでした。 （表1;図7）。 上記のように、トウモロコシのフラボノイドとアントシアニン調節タンパク質C1とP（MYB TF）のザクロ同族体、およびbHLH TFは発現の低下を示し、フラボノイドとアントシアニンの全体的な減少を制御できる可能性があります。 さらに、LOX（PgrO25417）のプロモーター領域には、WRKY、MYB、およびbZIP TFの結合部位が含まれています（表S7）。これは、MeJAアプリケーションに応答してこれらのTFファミリーに属する発現差のあるTFによって制御される可能性があることを示唆しています。 。
MeJA処理した葉の遺伝子発現と代謝産物の比較分析により、果実の多様なフェノール経路の調査が容易になります
MeJAアプリケーションに対するザクロの葉の代謝および転写応答を理解することは、植物の健康と生産性（すなわち果実生産）の改善に明らかに関連しています。 さらに、MeJAで処理された葉の遺伝子発現と代謝産物の比較分析は、葉と果実の両方の組織に存在するHT、フラボノイド、およびアントシアニン経路の調節を解明する機会も提供します（Bar-Ya'akov et al.2019 ）。 フェノール化合物HT、フラボノイド、およびアントシアニンは、ザクロ果実の人間の健康に有益な活動に大きく貢献しますが、それらの生産と蓄積の制御は、ザクロ（フラボノイドとアントシアニンの場合）または任意の植物種（HTの場合）で広く調査されていません）。 たとえば、MeJAを適用したザクロの果実に関する以前の研究では、これらの代謝物に関連する構造遺伝子または調節遺伝子の発現を調査せずに、収穫後の果実のアントシアニンとフラボノイドのレベルを決定しました（Koushesh Saba and Zarei 2019; Garcia-Pastor et al.2020 ）。 一方、現在の研究では、HT、フラボノイド、およびアントシアニン生合成遺伝子と同様の発現パターンを持つMeJAおよび模擬処理された葉で差次的発現を示したTF（例：MYB TF）が明らかになりました（図7;表1） 。 これらのTFは、HT、フラボノイド、およびアントシアニン経路の調節に関与している可能性があるため、今後さらに調査する必要があります。
私たちの研究は、MeJAで処理されたザクロの葉のメチル化フラボノイドの特定の増加と他のフラボノイドの一般的な減少を明らかにし、病原体からザクロの葉を守ることにおけるメチル化フラボノイドの潜在的な役割を示唆していることは注目に値します（図3;表S6）。 MeJAで処理されたザクロ果実に関する以前の報告では、個々のフラボノイド分子を定量化せずに総フラボノイド含有量のみが決定されましたが、フラボノイド蓄積の増強が示されました（Koushesh Saba and Zarei2019）。 そのため、葉と果実組織のフラボノイド変化を並べて比較できるようにするには、MeJAで処理したザクロ果実のより詳細な分析が必要です。 MeJA適用後のザクロ果実のアントシアニンの増加とは対照的に（Garcia-Pastor et al.2020）、アントシアニンのレベルはMeJA処理した葉で減少しました（図3;表S6）。 この格差は、病原体の攻撃時にアントシアニンが葉や果実の組織で果たす明確な役割が原因である可能性があります。 実際、葉と果実におけるアントシアニンの蓄積の違いは、さまざまなザクロ組織におけるMeJA応答を調べる必要性を強調しています。
結びの言葉
私たちの研究は、外因性MeJAの適用によって引き起こされる、ザクロの葉のHT、フラボノイド、アントシアニン、およびフィトオキシリピンの独特の代謝変化を明らかにしました。 トランスクリプトームおよび生化学的分析は、複数のフラボノイドおよびアントシアニンの抑制が少なくとも部分的に転写レベルで起こる一方で、非JAフィトオキシリピンの生合成の増加は転写的に制御されない可能性が高いことを示唆しました。 この作業は、HT、フラボノイド、およびアントシアニン代謝の調節アーキテクチャ、MeJAアプリケーションに対するザクロの葉の代謝応答のオーケストレーション、およびシグナル伝達および/または直接的な化学的防御において誘導された蓄積を伴う代謝物が果たす役割に関するさらなる調査を促します。
著者の貢献声明LCとLTが研究を考案しました。LCとWSが実験を行いました。 LC、WS、LTがデータを分析しました。LC、WS、LTが原稿を書きました。 すべての著者が最終原稿を読み、承認しました。
補足情報オンライン版には、https：//doi.org/10.1007/s00425-021-03735-9で入手可能な補足資料が含まれています。
謝辞この研究で使用したザクロの種子を提供してくれた攀枝花農林科学アカデミーの同僚に感謝します。 また、バウチャー標本の識別と記録に協力してくれた上海辰山植物園のBinjieGe博士にも感謝します。
資金提供この作業は、助成金14DZ2260400の下で上海市の科学技術委員会と、助成金G172403およびG182403の下で上海造園および都市外観管理局の科学研究のための特別基金によって支援されました。
データと資料の入手可能性現在の研究中に生成および分析されたトランスクリプトームデータセットは、NCBIのSequence Read Archive（SRA）でアクセッション番号PRJNA600139で入手できます。現在の研究中に生成および分析された代謝物プロファイリングデータセットは、この公開に含まれています。記事とその補足ファイル。
この記事はPlanta（2021）254:89https://doi.org/10.1007/s00425-021-03735-9から抜粋したものです。