神経保護効果とプロシアニジンのinvitroおよびinvivoでのメカニズムパート2
Mar 21, 2022
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3.ディスカッション
多くの研究により、PCは強力なラジカル除去および抗酸化活性を示すことが示されています] 25-27 I、およびROSの過剰産生および/または抗酸化防御システムの障害によって引き起こされる酸化ストレスは、神経変性疾患において重要な役割を果たします[ -6、28,29]。 ただし、酸化的損傷に関するPCの神経保護効果とメカニズムはまだ不明です。 したがって、この研究では、神経保護におけるPCの効果とメカニズムを研究しました。
本研究では、適切な濃度のPCは、GSH-Px、CAT、SODなどの抗酸化酵素のレベルを改善しましたが、H、Oのみを使用した測定と比較して、酸化的損傷のモデルではROSとMDAのレベルを低下させました。 これらの現在の発見は、食事による低PCサプリメントが離乳した子豚のGSH-Px、CAT、およびSODの活動を改善できることを示唆した以前の研究と一致していました[30]。 別の研究では、PCがCATおよびSODの活動を大幅に増加させ、MDAの含有量を減少させ、ヤギの精子の質を改善することも示唆されました[31]。
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Nrf2/ARE経路は重要な抗酸化経路です[32-34]。 通常、Nrf2は細胞質に存在し、抑制性タンパク質であるKeap135,36に結合します]。 H2O2が刺激されると、Nrf2はKeap1から解離し、内因性の抗酸化防御システムを開始し、その後核に移行します[34,37,38]。 次に、AREと相互作用して、GCLC、GCLM、NOO1、HO -139、40]などの一連の細胞保護および抗酸化遺伝子を活性化します。 酸化ストレスに応答して、H-O2刺激中に見られる変化と同様に、Nrf2は細胞質ゾルのKeap1から解離し、次に核に移行し、ARE配列に結合して凍結保護遺伝子の転写を活性化します[41,42]。 PCの適切な濃度は、PC12細胞のH、O2-損傷条件下でNrf2の核局在化を促進することを観察しました。 さらに、適切な濃度のPCは、NOO1、HO -1、GCLM、およびGCLCの発現レベルを著しくアップレギュレーションしました。これらはすべて、フリーラジカルと酸化分子を排除するように直接作用します[43]。 したがって、これらの結果は、PCの適切な濃度がNrf2/ARE経路のレベルを増加させることを示しました。 次に、Nrf2 siRNAを介したNfr2遺伝子サイレンシングを使用して、H、O2-によって誘発される酸化的損傷に対するPCを介した神経保護におけるNrf2/ARE活性化の役割をさらに評価しました。 Nrf 2- siRNAをトランスフェクトした細胞は、Nrf2発現の著しい減少を示しました。 同時に、Nrf2ノックアウトはPCを介したH2Oに対する保護を無効にし、細胞生存率の障害を治療し、Nrf2ノックアウトはPCの抗酸化作用も無効にすることを発見しました。 これらの発見は、Nrf2/ARE経路の活性化の改善が神経保護に寄与することを示唆した以前の研究と一致していました[44]。 したがって、現在の結果は、Nrf2/ARE経路が神経変性の予防のためのPCの薬理学的標的を表す可能性があることを示しています。
4.材料と方法4.1。 化学薬品および試薬
H2O2はHUSHI（HUSHI、上海、中国）から購入しました。 CCK -8、NACはBeyotime（Beyotime、上海、中国）から購入しました。 PC、2'、7 /-ジクロロフルオレセインジアセテート、MDA、GSH-Px、SOD診断キット、およびCAT診断キットはSolarbio（Solarbio、北京、中国）から購入しました。RNAiPlus、gDNA消しゴム付きPrimeScript RT試薬キット、およびSYBR Premix Ex Tag IIは、タカラ（タカラ、滋賀、日本）から購入しました。 Nrf 2- siRNA、control-siRNA、およびlipofectamine 2000は、GenePharma（GenePharma、上海、中国）から入手しました。 次の一次抗体および対応する二次抗体は、Proteintech（Proteintech、武漢、中国）から入手しました：Nrf2、HO -1、GCLC、GCLM、NAD（P）H：NQO1、ラミンB、およびGAPDH。
4.2。 細胞培養
PC12細胞は、National Collection of AuthenticatedCellCulturesから入手しました。 細胞は、10％ウシ胎児血清とペニシリン-ストレプトマイシン（100 U / mL; 100 ug / mL）を添加したDMEM培地で、5％CO2の37度の加湿インキュベーターで維持されました。
4.3。 細胞生存率アッセイ
PC12細胞を1×104細胞/ウェルの密度で96-ウェルプレートに播種しました。 細胞を異なる濃度のPCまたはNAC（20μM）に24時間曝露した後、200μMのH2O2とともに24時間インキュベートしました。 次に、10μLのCCK -8溶液を各ウェルに加え、1時間インキュベートした後、450nmで吸光度を測定しました。
4.4。 魚のメンテナンス
動物使用の倫理的承認は、浙江大学実験動物センター（ZJU20200125）の動物保護使用委員会によって付与されました。 成体ゼブラフィッシュ（Daniorerio、AB株）は、浙江大学の実験動物センターから入手し、14 /10-hの明/暗サイクル下で28±1Cに維持しました[21J。 魚はアルテミアノープリウスを1日2回与えられました。 胚を生成するために、成体のゼブラフィッシュを1：1のオス：メスの比率で飼育水槽に一晩入れました。 翌朝ライトがオンになってから2時間以内に産卵がトリガーされました。 胚は28度の胚水中で育てられました[45]。
4.5。 ROS測定
インビボでのROS産生を測定するために、受精後3日目のゼブラフィッシュ幼生（AB株）（pdf）を、300μMのH、Oの非存在下または存在下で、NAC（30μM）またはさまざまな濃度のPCに4日間曝露しました。日々。 続いて、7 pdfで、異なる処理グループを20 uMの2'、7'-ジクロロフルオレセインジアセテート溶液で処理した24-ウェルプレート（グループあたり10ゼブラフィッシュの幼虫）に移し、 28.5℃の暗闇[46]。 次に、幼虫を胚培地で3回洗浄して、過剰の2'7'-ジクロロフルオレセインジアセテートを除去した。 次に、染色された幼虫をオリンパスレーザー走査型共焦点顕微鏡で観察および画像化した。 個々の幼虫の蛍光強度は、Image]ソフトウェアを介して定量化されました。
インビトロでのROS産生を測定するために、PC12細胞を2×10*細胞/ウェルの密度で6-ウェルプレートに播種しました。 細胞を異なる濃度のPCまたはNAC（20 uM）に24時間曝露し、次に200uMのHOとともに24時間インキュベートしました。 細胞を10μMの2'、7'-ジクロロフルオレセインジアセテート溶液とともに暗所で30分間インキュベートしました。 その後、色素溶液を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄した。 次に、細胞をオリンパスレーザー走査型共焦点顕微鏡で観察および画像化した。 細胞の蛍光強度は、Image]ソフトウェアを介して定量化されました。
4.6。MDA、GSH-Px、SOD、およびCATの評価
ゼブラフィッシュの幼生（AB株）at3 pdfを、300 uMのH2Oの非存在下または存在下で、NAC（30μM）またはさまざまな濃度のPCに4日間曝露しました。 7 dpfのゼブラフィッシュをテトラカインで麻酔し、氷上で安楽死させた後にホモジナイズしました。 MDA、GSH-Px、CAT、およびSODは、製造元の指示に従って同時に分析されました。 各実験には20匹の幼虫が含まれ、測定された各指標は3回繰り返されました。
PC12細胞を2×10*細胞/ウェルの密度で6-ウェルプレートに播種しました。 細胞をさまざまな濃度のPCまたはNAC（20 uM）に24時間曝露した後、200uMのH2Oとともに24時間インキュベートしました。 次に、PC12細胞を収集し、溶解バッファーとともにインキュベートしました。 MDA、GSH-Px、SOD、およびCATの活性は、各メーカーのプロトコルに従って、対応するアッセイキットを使用して測定されました。 測定された各インデックスは、3回繰り返されました。
4.7。トータルRNA抽出、逆転写、および定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応
3 dpfのゼブラフィッシュ幼生（AB株）を、300 uMのH、Oの非存在下または存在下で、NAC（30μM）またはさまざまな濃度のPCに4日間曝露しました。 処理後、RNAisoを使用して、製造元の指示に従ってRNAを抽出しました。 RNAは、GDNAイレーサーを備えたPrimeScript RT Kitを使用して、製造元の指示に従って逆転写されました（Takara、滋賀、日本）。 Applied Biosystems Vi -7リアルタイムPCRシステムを使用して定量的リアルタイムPCRを実行しました。SYBRPremixExTaqIIを使用したリアルタイムPCRシステム-アクチンを参照遺伝子として使用し、相対的な遺伝子発現を2-AACtを使用して計算しました。方法。 使用したプライマー配列を表1に示します。
4.8。 Nrf2siRNAトランスフェクション
Nrf2-siRNAを使用してNrf2をノックダウンしました。 PC12細胞を6-ウェル培養プレートに播種し、Lipofectamine 2000を使用して、製造元の指示に従ってNrf 2- siRNA（80 nM）またはコントロールsiRNAをトランスフェクトしました。
4.9。全細胞、細胞質、および核タンパク質の調製
全細胞タンパク質を抽出するために、細胞を収集し、1パーセントのPMSFと1パーセントのプロテアーゼ阻害剤カクテルを含むRIPA溶解バッファーとともに氷上で30分間インキュベートしました。 細胞溶解物を遠心分離し、上清を収集して保存した。 細胞内分画の準備のために、細胞サンプルは核および細胞質タンパク質抽出キットを使用して処理されました。 タンパク質含有量は、BCAアッセイを使用してアッセイされました。 4.10。ウエスタンブロッティング
等分したタンパク質サンプルをSDS-PAGEで分離し、ポリフッ化ビニリデン膜に転写しました。 次に、ブロットを次の一次抗体とインキュベートしました：Nrf2、Keapl、HO -1、NQO1、GCLC、GCLM、Lamin B、またはGAPDH。次に、メンブレンをTBSTで5分間洗浄しました。 これを5回繰り返した。 その後、ブロットをペルオキシダーゼ標識二次抗体でインキュベートしました。 最後に、ECL-plusウエスタンブロッティング検出試薬を使用してタンパク質バンドを可視化しました。
4.11。運動行動アッセイ
3 pdfのゼブラフィッシュ幼生（AB株）を、300μMのHOの非存在下または存在下で、NAC（30μM）またはさまざまな濃度のPCに4日間曝露しました。 その後、7 pdfで、これらの処理された幼虫を24-ウェルプレートにプレーティングしました（ウェルごとに1匹の魚、グループごとに12匹の幼虫）。 Any-maze 4.73を使用して、ゼブラフィッシュの幼生の自発運動を測定し、10分間の総移動距離を計算しました[47]。
4.12。統計分析
データは、少なくとも3回の独立した実験の平均±標準偏差（SD）として示されています。 一元配置分散分析（ANOVA）とダンカンの多重範囲検定を使用して統計的有意性を決定し、pの場合に差が有意であると見なされました。<0.05. statistical="" analyses="" were="" performed="" via="" spss,="" version="">
5。結論
結論として、現在の調査結果は、PCがNrf2/ARE経路とその下流の解毒酵素および抗酸化酵素を活性化することによって神経保護効果を発揮することを示しています。 まとめると、PCは神経変性疾患を予防する効果があるかもしれません。
著者の貢献：概念化、JCandJZ。（Jiajin Zhu）; 方法論、JC; ソフトウェア、YC; 検証、YZ。、JZ（Jiawen Zhao）およびHY; 正式な分析、JC; 調査、YC; リソース、JZ（iajin Zhu）; データキュレーション、JC; 執筆—元のドラフトの準備、JC; 執筆—レビューと編集、JZ。（iajin Zhu）; 視覚化、JC; 監督、DL; プロジェクト管理、JZ（Jiajin Zhu）; 資金調達、JZ（Jiajin Zhu）。 すべての著者は、出版された原稿を読み、同意しました。
資金：この研究は外部からの資金提供を受けていません。
倫理委員会の声明：この研究はヘルシンキ宣言のガイドラインに従って実施され、浙江大学実験動物センターの動物保護使用委員会の倫理委員会（ZJU20200125）によって承認されました。 インフォームドコンセント声明：該当なし。
データ可用性ステートメント：データは記事に含まれています。 利害の対立：著者は利害の対立を宣言しません。
サンプルの入手可能性：化合物のサンプルは著者から入手できません。
この記事は、Molecules 2021、26、2963から抽出されています。https：//doi.org/10.3390/molecules26102963 https://www.mdpi.com/journal/molecules
