脳虚血と虚血・再灌流障害におけるマイトファジーⅠ

虚血性脳卒中は、死亡率と罹患率が高い深刻な脳血管疾患です。 近年、血栓溶解および血栓切除術に基づく再灌流治療は、虚血性脳卒中患者の主要な管理であり、再開通時間枠は 24 時間以上に延長されています。 ただし、時間枠の延長に伴い、再灌流療法後の虚血/再灌流 (I/R) 損傷のリスクは、患者の転帰にとって大きな課題となります。 I/R 損傷は、通常、ミトコンドリアの機能不全に関連する代謝の需要と供給の不均衡による神経細胞死につながります。 マイトファジーは、過剰な活性酸素種 (ROS) の生成とそれに続く細胞死を防ぐために、損傷または機能不全のミトコンドリアを特定のオートファジーで除去するプロセスを指す、選択的オートファジーの一種です。 最近の進歩は、脳虚血における mitophagy の保護的役割が主に I/R 損傷におけるその神経保護効果に関連していることを示唆しています。 このレビューでは、特に虚血性脳卒中および I/R 損傷の病態生理学におけるミトコンドリアのダイナミクスとミトファジーの関与について説明し、ミトファジー調節の治療の可能性と、神経保護の時間枠延長のための補助的アプローチとしてミトファジー関連の介入を使用する可能性に焦点を当てています。虚血性脳卒中の後。

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キーワード：マイトファジー、ミトコンドリア機能障害、虚血性脳卒中、虚血・再灌流障害（I/R障害）、再疎通療法、治療域

のはじめに

脳卒中は、脳梗塞や出血によって引き起こされる脳血液循環障害の突然の発症です (Shi et al., 2021)。 影響を受ける脳の領域に応じて、患者はさまざまな症状を呈する可能性があり、その中で最も一般的な症状は、体の片側の急激な衰弱と話す能力の低下です (Nor et al., 2005)。 アメリカ心臓協会 (AHA) によると、脳卒中は死亡原因の第 5 位です。 およそ 795 人000が、毎年新たに脳卒中または再発する脳卒中に苦しんでいます (Virani Salim et al., 2020)。 脳卒中には、虚血性脳卒中と出血性脳卒中の 2 つの主要なタイプがあります。 虚血性脳卒中では、動脈内の破裂したアテローム硬化性プラークの周囲に形成された血栓によって血流がブロックされますが、出血性脳卒中は通常、血管の破裂によって引き起こされる出血が原因です。

虚血性脳卒中は、全脳卒中症例の約 87% を占めます。 そのため、研究や臨床現場で大きな注目を集めています。 血流が遮断されると、酸素と栄養素が不足し、脳の虚血カスケードが引き起こされます。 アデノシン三リン酸 (ATP) の生成が中断され、エネルギー依存性の高い脆弱な脳細胞にとって致命的な状況になることがよくあります。 詳細には、ATP 生成の失敗により、ナトリウム チャネルを含む ATP 依存性イオン チャネルの活性が弱まり、細胞内の高浸透圧が引き起こされる可能性があります (Deb et al., 2010)。 また、虚血中の嫌気性呼吸の増加は、副産物の乳酸を生成し、代謝性アシドーシスにつながります。 イオンバランスの激しい変化は、細胞傷害性浮腫を引き起こし、グルタミン酸受容体活性を破壊し、最終的に DNA や構造タンパク質に損傷を与えたり、細胞死に至ることさえあります (Nishizawa, 2001; Deb et al., 2010)。 ニューロンの不可逆的な神経病理学的変化は、通常、虚血後 20 ～ 30 分以内に発生します (Ordy et al., 1993)。

神経細胞が損傷する前に血流と酸素を虚血領域に回復させることを目的とする再灌流治療は、診療所における虚血性脳卒中患者の主要な管理です。 静脈内組織プラスミノーゲン活性化因子 (IV tPA) は、急性脳卒中を治療するための唯一の FDA 承認の血栓溶解剤です。 以前の証拠は、虚血後 3 時間以内に投与された場合にのみ有意な臨床的改善を示すことを示唆しています (Kwiatkowski et al., 1999)。 2017 年に実施された別の無作為化試験研究では、6 時間以内の静脈内療法が依然として安全性の懸念よりも有効であることが示されました (Berkhemer et al., 2014)。 動脈から血栓症を除去する外科的処置である機械的血栓切除術は、一般的に使用されるもう 1 つの再灌流療法です。 血栓除去術は、脳卒中後の障害を軽減するのに効果的ですが、その有効性と安全性は脳卒中発症後 8 時間以内にしか確保できません (Jovin et al., 2015)。 近年、再疎通の遅延に焦点を当てた 2 つの質の高い臨床試験では、脳卒中発症後 24 時間以降に再灌流治療を行うと、選択された患者の予後がいくらか改善され、特定の患者集団では治療ウィンドウが 24 時間まで延長されることが示されています。 (Ragoschke-Schumm と Walter、2018 年)。

ただし、現在のすべての治療には、脳組織をさらに損傷する可能性のある治療域外で投与すると、頭蓋内出血 (ICH) のリスクが高まるという大きな制限があります。 再灌流療法後のこの損傷は、虚血/再灌流 (I/R) 損傷と呼ばれ、再酸素化による活性酸素種 (ROS) の生成、カルシウム過負荷、および組織損傷を伴うプロセスです。 したがって、神経保護を提供しながら虚血性脳卒中後の再灌流時間枠を延長することは、疾患管理にとって非常に重要です。 オートファジーは、細胞の恒常性を維持するために、不要または損傷したオルガネラやタンパク質を分解する自然なプロセスです。 オートファジーは、脳細胞が酸素と栄養不足のリスクにさらされる虚血性脳卒中後に活性化される可能性があります。 より具体的には、酸素-グルコース欠乏は、AMPK 経路の活性化因子である AMP/ATP 比の増加を刺激します (Oakhill et al., 2011; Jiang et al., 2018)。 したがって、AMPK 経路のアップレギュレーションは、Ser 317 および Ser 777 のリン酸化による ULK 複合体の直接的な活性化、または mTOR の活性の阻害による ULK の間接的な活性化を介してオートファジーを開始できます。これは、mTOR が Ulk1 の Ser 757 をリン酸化し、 Ulk1 と AMPK の相互作用 (Egan et al., 2011; Kim J. et al., 2011)。

以前の研究では、虚血性脳卒中後のオートファジーの役割に関して物議を醸す結果が示されています。 いくつかの研究は、オートファジーが神経保護を提供し、ニューロン、グリア、および内皮細胞への虚血性損傷を大幅に減少させることにより、臨床転帰を改善することを示しています (Papadakis et al., 2013; Jiang et al., 2015; Dai et al., 2017)。 一方、過剰なオートファジーが脳細胞に有害である可能性を示唆する他の発見もある (Li et al., 2017; Mo et al., 2020)。 まとめると、物議を醸す証拠にもかかわらず、中等度のオートファジーは保護的であり、過剰なオートファジーは虚血中の細胞死に寄与する可能性があることが一般的に合意されています (Mo et al., 2020)。

虚血プレコンディショニング (IPC) は、短期間の血管閉塞と再灌流を使用して胎児の虚血イベントと再開通を防ぐ戦略であり、損傷したオルガネラを標的とする適応オートファジーをトリガーし、急性虚血性脳卒中の酸化ストレスを緩和することにより、脳内の神経保護プログラムを活性化できます ( Yang et al., 2020; Ajoolabady et al., 2021)。 さらに、再疎通の開始時に虚血によって中断された短い期間の再灌流を適用することによって不適応オートファジーを減少させる脳虚血ポストコンディショニングは、再灌流損傷を抑制するために誘導されており、虚血性脳卒中の治療におけるその保護的役割を示しています (VintenJohansen、2017; Ajoolabady et al 、2021年）。 選択的オートファジーの一種であるマイトファジーは、機能不全のミトコンドリアを取り除くことができます。 ミトコンドリアは、細胞のエネルギー産生、カルシウム恒常性の維持、および ROS 調節において中心的な役割を果たします。 ミトコンドリアの機能不全は、酸化ストレスと細胞損傷を増加させる可能性があります (Liu, 1999; Indo et al., 2007)。

Mitophagy は主に、損傷したミトコンドリアのクリアランスを通じて、ミトコンドリアの品質管理として機能します。 哺乳動物では、機能不全のミトコンドリアは、PINK1- パーキン依存性ユビキチン化経路またはマイトファジー受容体の活性化のいずれかを介して除去されるため、ミトコンドリアからの ROS 生成が減少し (Lemasters、2005)、好ましくないニッチから細胞が保護されます (Huang et al 、2011)。

虚血性脳卒中の状態では、機能不全のミトコンドリアがシトクロム c を含むアポトーシス促進因子の放出を増加させ、患部の細胞死を誘発します (Jürgensmeier et al., 1998; Lemasters, 2005)。 マイトファジーは、最初の虚血段階とその後の再灌流段階で異なる影響を与える可能性があることに注意してください。 研究は、マイトファジーが主に再灌流段階でその保護的役割を発揮することを示しています (Kumar et al., 2016)。

近年、急性脳卒中における mitophagy の役割が広く研究されています。 ほとんどの研究は、複数のメカニズムを介して再灌流障害を軽減する上での mitophagy の神経保護の役割を示しています。 このレビューでは、虚血性脳卒中および I/R 損傷における mitophagy の役割を要約し、虚血性脳卒中管理の補助的アプローチとして mitophagy 関連の介入を提案しています。 再疎通の遅延とそれに mitophagy の潜在的な関与に関する最新情報も議論されました。

Mイトコンドリアとマイトファジー

ミトコンドリアは、主にエネルギー生産を担う重要な細胞小器官です。 しかし、損傷したミトコンドリアは、有害な ROS や、H2O2 やペルオキシナイトライトなどの他の酸化剤を細胞質に放出し、タンパク質、核酸、および膜に損傷を与えます (Zhou et al., 2011)。 さらに悪いことに、ミトコンドリア膜間スペースタンパク質であるシトクロム c は、重度のミトコンドリア損傷下で放出され、カスパーゼカスケードと最終的なアポトーシスを引き起こします (Ott et al., 2002)。

したがって、細胞の生存には、損傷したミトコンドリアの急速な分解が必要です。 マイトファジーは、損傷したミトコンドリアまたは老化したミトコンドリアがファゴフォアによって選択的に包まれ、リソソーム分解を受けて細胞の恒常性を維持し、細胞のアポトーシスを防ぐプロセスです。 マイトファジーは、小胞体から分離された膜構造であるファゴフォアの形成から始まります。 次にファゴフォアは、LC3 アダプターまたは LC3 受容体を介して損傷したミトコンドリアを認識し、常染色体分解のために損傷したミトコンドリアを飲み込みます。 現在、マイトファジー経路は、ユビキチン媒介経路と受容体媒介経路の 2 つの主要なタイプで構成されています (図 1)。

ユビキチン媒介経路

PTEN 誘導推定キナーゼ タンパク質 1 (PINK1) およびパーキンを介したユビキチン化経路は、最もよく特徴付けられたマイトファジー メカニズムの一部です。 健康なミトコンドリアでは、セリン/スレオニンキナーゼである PINK1 が細胞質から継続的に取り込まれ、ミトコンドリア プロテアーゼであるミトコンドリア プロセッシング ペプチダーゼ (MPP) およびプレセニリン関連菱形 (PARL) によって切断されます (Greene et al., 2012)。 虚血性脳卒中になると、ミトコンドリア膜が脱分極し、PINK1 の取り込みが妨げられ、ミトコンドリア膜に PINK1 が蓄積されます。 その結果、全長 PINK1 のキナーゼ活性は E3 リガーゼ Parkin のリン酸化を誘導し、これが Parkin の酵素機能を活性化し、いくつかのミトコンドリアタンパク質のユビキチン化をもたらします (Kazlauskaite et al., 2015)。 一方、PINK1 はユビキチンをリン酸化し、リン酸化ユビキチンとパーキンの結合をもたらし、リガーゼ活性がさらに向上します (Koyano et al., 2014; Kazlauskaite et al., 2015)。

パーキンが活性化されると、ユビキチン部分が OMM タンパク質に結合し、それによってマイトファジーが誘導されます。 MFN1 などの一部のユビキチン化ミトコンドリアタンパク質は分解され、ミトコンドリアの分裂とマイトファジーに不可欠です (Tanaka et al., 2010)。 他のユビキチン化タンパク質は、オプチニューリン (OPTN) や核ドットタンパク質 52 (NDP52) などのオートファジーアダプタータンパク質をリクルートし、LC3- 相互作用領域 (LIR) モチーフによってマークされたミトコンドリアをオートファゴソームに固定し、それによってミトファジーが開始されます (Lazarouら、2015)。 さらに、PINK1 は、パーキンとは独立して OPTN と NDP52 をリクルートでき、ファゴフォアの合成と伸長を媒介するために、unc51- 様オートファジー活性化キナーゼ 1 (ULK1) などのいくつかのオートファジー開始因子をリクルートします (Wong and Holzbaur, 2014;ラザロウら、2015)。 他にもいくつかの E3 リガーゼがマイトファジーを開始することが発見されています。 いくつかのメカニズムは PINK1/Parkin を介した mitophagy に関連しており、いくつかは Parkin とは無関係です。 たとえば、ミトコンドリアのユビキチン リガーゼ 1 (MUL1) の過剰発現は、ユビキチン化によるミトフシンの分解を媒介し、PINK1/パーキン変異表現型を救済します (Yun et al., 2014)。

成熟ニューロンでは、MUL1 は ER とミトコンドリアの接触にも重要であり、MUL1 が存在しないとミトコンドリアの Ca2+ 恒常性が損なわれ、ER からの Ca2+ の摂取が減少します。 これにより、カルシニューリンが活性化され、Drp1 が活性化され、ミトコンドリアの分裂が誘導されます。 断片化したミトコンドリアは膜電位を失い、PINK1/Parkin を介したマイトファジーが誘導されます (Puri et al., 2019)。 全長 PINK1 が存在する場合、別の E3 リガーゼ、欠席相同体 (SIAH) -1 の 7 は、シンフィリン -1 によって動員されます。 SIAH-1 は、パーキンとは無関係に、ミトコンドリアタンパク質のユビキチン化を通じてマイトファジーを促進します (Szargel et al., 2016)。 PINK1-Parkin を介したユビキチン化の利点に加えて、正しい mitophagy には deubiquitinase が不可欠です。 パーキンの脱ユビキチン化はユビキチン特異的ペプチダーゼ 8 (USP8) によって直接行われますが (Durcan et al., 2014)、USP15 はパーキンの基質を脱ユビキチン化してマイトファジーを阻害します (Cornelissen et al., 2014)。 USP30、USP35、および USP33 (Bingol et al., 2014; Wang Y. et al., 2015; Niu et al., 2020) などの他のいくつかの脱ユビキチナーゼは、ミトコンドリア膜からユビキチン鎖を除去することにより、ユビキチンを介したミトファジーに対抗します。 . したがって、マイトファジーの調節のために、ユビキチン化と脱ユビキチン化の間の微調整されたバランスが確立されます。

受容体媒介経路

マイトファジーの代替経路は、マイトファジー受容体シグナル伝達によるものです。 現在、複数のマイトファジー受容体が哺乳動物細胞で同定されており (Ren et al., 2018)、オートファジー メディエーター LC3 の直接結合とその後のファゴソーム貪食のための少なくとも 1 つの LIR を含んでいます。 赤血球のミトコンドリアの代謝回転における重要な受容体は、BCL2 相互作用タンパク質 3- 様 (BINP3- L、NIX としても知られる) と名付けられた OMM タンパク質です (Sandoval et al., 2008)。 赤血球の成熟中に転写がアップレギュレートされ、ミトコンドリアがクリアされます。 低酸素状態では、BINP3-L がそのホモログである BNIP3 とともに誘導され、OPA1 の分解と DRP1 の動員を通じてマイトファジーが促進されます。これは、フォークヘッド ボックス O3 (FOXO3) と低酸素誘導因子 (HIF) によって転写的に調節されます。 、それによってミトコンドリア分裂を誘導し、ミトコンドリア融合を阻害します（Sowter et al。、2001; Mammucari et al。、2007）。

さらに、LC3 への結合親和性は、ストレス条件下での LIR のリン酸化によってさらに改善されます (Rogov et al., 2017)。 もう 1 つの重要なマイトファジー受容体は、1 を含む FUN14 ドメイン (FUNDC1) であり、低酸素条件下でマイトファジーを媒介します (Liu et al., 2012)。 FUNDC1 の活性は、そのリン酸化状態によって調節されます。 非ストレス状態では、Tyr18 での Src および Ser13 でのカゼインキナーゼ II (CK2) のリン酸化によって抑制されます (Chen et al., 2014)。 低酸素下では、PGAM5 ホスファターゼが FUNDC1 を脱リン酸化し、FUNDC1 の LIR モチーフを活性化し、マイトファジーを誘導します。 さらに、FUNDC1 は Drp1 をリクルートし、ストレス下で OPA1 との物理的結合を破壊し (ミトコンドリアのダイナミクスにとって重要)、それによってミトコンドリアの分裂を誘導し、ミトコンドリアの融合を阻害します (Chen et al., 2016)。

さらに、他にも複数のミトファジー受容体があります。 ミトコンドリア外膜では、BCL 2 Like 13 (BCL2L13) および FKBP プロリルイソメラーゼ 8 (FKBP8) が、パーキンとは無関係に LIR モチーフを介して LC3 に結合することにより、マイトファジーを媒介することが示されています (Murakawa et al., 2015; Bhujabal et al., 2017)。 プロヒビチン 2 (PHB2) やカルジオリピンなど、一部の受容体も IMM に存在します。 OMM が脱分極または損傷すると、PHB2 は LC3 と相互作用してマイトファジーを直接促進します (Wei et al., 2017)。 ただし、OMM 破裂時の PHB2 の枯渇は、PARL の活性化を介して PINK1 を不安定化し、したがって全長 PGAM5 の切断につながります (Yan et al., 2020)。 これにより、PINK1 の安定化に関与する PGAM5- が無効になり、PINK1/パーキン依存性マイトファジーが阻害されます。 最近、リン脂質であるカルジオリピンもマイトファジー受容体として同定され、その一次合成は IMM で行われます。 OMM の破裂に遭遇すると、カルジオリピンが OMM に放出され、LC3 と相互作用して、ミトコンドリアの飲み込みをもたらすシグナル伝達カスケードを引き起こします (Chu et al., 2013)。

ミトコンドリアのダイナミクスとマイトファジーとの関係

外部環境に適応するために、ミトコンドリアは内膜と外膜の両方を融合するか、分裂していくつかのミトコンドリアに分かれます。 ミトコンドリアのダイナミクスにおけるこれら 2 つの重要なプロセスは、融合と分裂と呼ばれます。 細胞ストレスに直面すると、部分的に損傷したミトコンドリアを修復することでエネルギー生産を確保するために融合が促進されます (Youle and van der Bliek, 2012)。ミトコンドリアの「健康な部分」であり、マイトファジー中の不要な損失を減らします。 ミトコンドリアの質に応じて、融合または分裂のいずれかが活性化され、他方が阻害されます (Twig et al., 2008)。

哺乳動物細胞では、GTPase である MFN1、MFN2、および OPA1 がミトコンドリアの融合を仲介します (Wu et al., 2019)。 これらのタンパク質は、多くの場合、その効力を制御するために転写後に修飾されます。 MFN1 については、細胞外調節キナーゼ (ERK) が Thr562 でリン酸化し、融合を抑制することができます。 MFN1 は、分解のために MARCH 5 によってユビキチン化されることもあります (Park et al., 2014)。 マイトジェン活性化プロテインキナーゼ 8 (MAPK8、JNK としても知られる) は、E3 リガーゼ Parkin (Gegg et al., 2010)、HUWE1 (Leboucher et al., 2012)、およびミトコンドリアのユビキチンリガーゼによるその後のユビキチン化のために、ストレス下で Ser27 で MFN2 をリン酸化します。膜関連 RING-CH (MARCH 5) (Sugiura et al., 2013)。 MFN1 と MFN2 は USP30 によって脱ユビキチン化される可能性があり、それを阻害すると MFN1/2 が非分解的にユビキチン化されます (Yue et al., 2014)。

OPA1 については、ミトコンドリア内シグナルに応答する YME1L および OMA1 のプロテアーゼ活性の変化によって調節されます (Griparic et al., 2007; Head et al., 2009)。 ミトコンドリアの分裂は、主に細胞質タンパク質である DRP1 によって調節されており、その動員は MFF などのミトコンドリアの分裂因子によって媒介されます。 DRP1 は、その活性を阻害する Ser637 および Ser656 でプロテインキナーゼ A によってリン酸化される可能性があります。 DRP1 の脱リン酸化は、カルシウム依存性タンパク質ホスファターゼ カルシニューリンまたはタンパク質ホスファターゼ 2A (PP2A) によって媒介され、ストレス下で断片化が促進されます (Chang and Blackstone、2007; Cribbs and Strack、2007)。

さらに、エネルギーを感知するアデノシン一リン酸 (AMP) 活性化プロテインキナーゼ (AMPK) は、エネルギー ストレス下で MFF をリン酸化し、Drp1 を動員してミトコンドリアの分裂を促進します (Toyama et al., 2016)。 複数のマイトファジータンパク質が分裂を促進し、マイトファジーを促進することがわかっているため、マイトファジーはミトコンドリアのダイナミクスと密接に関連しています。 例えば、リン酸化されたパーキンは分解のために MFN1 と MFN2 をユビキチン化することができ、これによりミトコンドリアの融合が減少し、断片化が促進され、マイトファジーが開始されます (Tanaka et al., 2010)。 マイトファジーの間、MFN2 は PINK1 によってリン酸化され、さらなるマイトファジーのためにパーキンを動員します (Chen and Dorn, 2013)。

カンカ神経保護効果

カンカは、その神経保護特性で知られる植物抽出物であり、その作用機序には、抗酸化作用、抗炎症作用、および抗アポトーシス作用が関与すると考えられています。 Cistanche の神経保護効果に関連するいくつかの関連するテストとアプリケーション ケースがあります。

1. in vitro 研究: in vitro 研究では、カンカ抽出物が酸化ストレスと炎症を軽減することにより、ニューロンをストレスによる損傷から保護することが示されています。

2. 動物研究: 動物研究は、Cistanche が脳虚血、外傷性脳損傷、および神経毒曝露によって引き起こされる神経損傷から保護できることを実証しました。

3. ヒトでの研究: ヒトにおけるシスタンケの神経保護効果に関する臨床的証拠は限られていますが、いくつかの研究では、認知機能を改善し、加齢に伴う記憶力の低下を軽減する可能性があることが示唆されています.

Luoan Shen1†、Qinyi Gan1†、Youcheng Yang1、Cesar Reis2、Zheng Zhang1、Shanshan Xu3、Tongyu Zhang4 *、Chengmei Sun1,3 *

1 Zhejiang University-University of Edinburgh Institute, School of Medicine, Zhejiang University, Haining, China,

2 VA Loma Linda Healthcare System、ロマリンダ大学、ロマリンダ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国、

3 Institute for Advanced Study, Shenzhen University, Shenzhen, China, 4 Department of Neurosurgery, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, Beijing, China