元の記事 カンカのシスタノシドは、酸化ストレスの抑制を介して、低酸素症による男性の生殖障害を改善します

序章

現在、世界中で生殖年齢の約 4,850 万組 (15%) のカップルが不妊症の影響を受けており [1]、そのうち 40-50% のケースが男性不妊症に起因しています [2]。そしてライフスタイル要因。 哺乳動物の精巣の低酸素圧に対する感受性が、ある種の男性不妊症の原因となることが示唆されています [3]。 以前の研究で実証されているように、精子形成は、低圧低酸素にさらされると損なわれ、減少します [4-7]。

根底にあるメカニズムを探究するために、低圧低酸素への曝露が活性酸素種（ROS）の産生を増加させることが研究で示されています[8、9]。 ROS は、男性の生殖器系で重要な役割を果たしています。 低レベルでは、精子受精能獲得、先体反応、および精子と卵母細胞の融合に必要です [10]。 しかし、過剰な ROS は精子の核/ミトコンドリア DNA 損傷および原形質膜過酸化損傷を誘発する可能性があり、これらは男性不妊のリスク増加の主要な病因要因となります [11, 12]。 したがって、低酸素誘導ROSの蓄積は、男性不妊の原因の1つである可能性があります。

シスタンチェス ハーバは、多年生の寄生性薬用植物で、乾燥地域に広く分布し [13]、その薬理学的活性のために広く使用されています [14-17]。 Cistanches Herba のすべての有効成分の中で、PhG は主要な有効成分と見なされてきました。 現在までに、34 種類の PhG がカンカン草から分離されています [13]。 Cistanches Herba から分離されたアクティブな PhG であるシスタノシド (Cis) は、その抗酸化作用で注目されています。

Cis の抗酸化作用と低酸素誘発男性不妊における ROS の役割を考慮すると、Cis は低酸素誘発男性不妊の治療薬候補と考えられています。 ただし、低酸素症による男性不妊症または関与するシグナル伝達経路の治療における、Cistanches Herba から抽出された Cis の抗酸化効果に対処した報告はほとんどありません。 この研究では、in vitro および in vivo の低酸素実験モデルが構築され、異なる Cis の効果成分が評価されました。

クリックテストステロンのシスタンケ

材料および方法

細胞培養および試薬

マウス精原細胞株 GC-1spg (GC-1) は、American Type Culture Collection (ATCC) から購入し、10% ウシ胎児血清、1% L-グルタミン (100 mM)、ペニシリン (100 U/mL)、およびストレプトマイシン (100 ug/mL) を 37 度で、5% CO2 の加湿インキュベーターで。 Cis (Cis-A、B、C、H) は Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (中国) から購入しました。

細胞生存率アッセイ

細胞生存率は、細胞計数キット{{0}}アッセイ（CCK-8）によってテストされました。 簡単に説明すると、GC-1 細胞を 96- ウェル プレートにウェルあたり 1.5 x 103 で播種し、37 度で 24 時間培養しました。 次に、細胞を異なる濃度（20パーセント、15パーセント、10パーセント、5パーセント）の酸素または異なる濃度（2μM、0.2μM、0.02μM）のCis（Cis-A、Cis-B、Cis- C、Cis-H) 必要な時間。 その後、上清を捨て、CCK-8 kit (Dojindo Japan) を用いて細胞生存率を検出した。 マイクロプレートリーダー（BioRad USA）を用いて各ウェルの吸光度を450nmで測定した。 最後に、次の式に従って細胞生存率を計算しました: 細胞生存率=(ODexperimental グループ - ODblank グループ)/(ODcontrol グループ - ODblank グループ) × 100 パーセント。

ウエスタンブロット分析

収穫された細胞または組織をRIPAバッファーでホモジナイズして、タンパク質を抽出しました（RIPA BeyotimeChina; Cocktail Roche Switzerland）。 上清を回収し、タンパク質の濃度をBCA法（Beyotime）でテストしました。 各サンプルから抽出した約 40 ug のタンパク質を SDS-PAGE で分離し、ニトロセルロース (NC) フィルター膜 (Beyotime China) にエレクトロトランスファーしました。 NC フィルター膜を 5% 脱脂乳で 1.5 時間ブロックし、特異的抗体 (抗 PARP 1:1000、抗カスパーゼ-3 1:1000、抗 Bcl-2 1:1000、抗 Bax 1 ：１０００、抗ＧＡＰＤＨ １：１０００；すべての抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡから購入した）４℃で一晩。 次に、すべてのNC膜を対応する西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体とともに室温で1.5時間インキュベートし、イメージングシステム（Tannon、中国）でイメージングしました。

細胞周期の検出

フローサイトメトリー アッセイ (FCM) を実行して、細胞周期を分析しました。 細胞を異なる条件下で72時間処理し、収穫した。 次いで細胞をＰＢＳで洗浄し、７５％エタノールで固定し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した。 各サンプルについて、1×10 4 個の細胞を収集し、フローサイトメトリー (FACS Calibur、BD Biosciences) で分析しました。 次に、G1/S/G2 期の細胞の割合と増殖指数 [Phase(S plus G2)/Phase(G1 plus S plus G2) × 100%] を計算しました。

気-67染色

細胞を共焦点皿で培養し、低酸素または異なるサブタイプのCisで72時間処理しました。 すべての細胞を 4% パラホルムアルデヒドで固定した後、それらを抗 Ki-67 抗体 (1:200、Cell Signaling Technology) と共にインキュベートしました。 次に、すべての細胞を、対応する CY-3- 結合抗ウサギ IgG 抗体 (1:200、Boster、中国) および DAPI 溶液 (1.0 ug/mL、Beyotime) とともにインキュベートしました。 蛍光は、Fluoview FV1000 共焦点顕微鏡 (オリンパス、日本) で観察されました。

ROSの検出

DCFH-DAを使用して細胞内ROSレベルを測定するためにFCMが導入されました。 懸濁細胞を6-ウェルプレートに播種し、さまざまな処理を行いました。 72時間の処理後、細胞を10μM DCFH-DA（Beyotime）を含む無血清DMEMに懸濁しました。 次に、励起波長 488 nm、発光波長 525 nm の Beckman Coulter Flow Cytometry System での蛍光活性化セルソーティングによって、ROS 含有量を測定しました [18]。

脂質過酸化（LPO）の測定

チオバルビツール酸反応性物質 (TBARS) アッセイは、LPO を検出するために実行されました。 すべての操作手順は、説明書 (Sigma USA) に従って実行されました。 濃度は、標準としてマロンジアルデヒドを使用して得られたモル吸光係数 1.56×105/(M・cm) を使用して計算されました。 結果は、MDA当量のnmol/タンパク質のmgとして表される。

酵素活性の測定

酵素活性は、グルタチオンレダクターゼ (GR)、グルタチオンペルオキシダーゼ (GPx)、およびスーパーオキシドジスムターゼ (SOD) を含むアッセイキットを使用してテストされました。 すべての操作手順は、提供された指示に従って実行されました (Nan Jing Jian Cheng Bioengineering Institute China)。

動物と実験プロトコル

成熟したオスの Wistar ラット (180-220 g、8 週齢) は、中国の西安にある第 4 軍事医科大学の動物センターから入手しました。 動物の使用許可は、大学倫理委員会から取得しました (参照番号: 20190506)。 動物実験は、実験動物の管理と使用に関する大学のガイドラインに従って実施されました。

すべてのラットは、実験開始前に約 1 週間順応させた。 順応後、ラットをランダムに 6 つのグループに分け、各グループに 5 匹の動物を割り当てました。 対照群のラットは常圧 (PO2: 20%、気圧: 101.3 kPa) で飼育し、モデル群とシス投与群のラットは低圧酸素室 (内圧 61.6 kPa) で飼育しました。 、海抜 4000 メートルの高さに相当; PO2: 14.55% ) 高地の低酸素環境をシミュレートします。 すべてのラットは、22 ± 2 度、12- 時間の自動明/暗サイクルの湿度条件で、プラスチック ケージ内の餌と水に自由にアクセスできました。 モデルおよびCis処置群のラットは低圧状態のままであったが、96時間ごとに正常圧状態に移され、その時点で餌と水が与えられ、ケージが掃除された。 低気圧から低気圧への移行時間は約 2 時間でした。 すべての治療グループは、対応するシス (8 mg/kg/d) で 8 週間経口胃管栄養法で治療されましたが、対照ラットとモデル ラットは同量の水で治療されました。

8 週間後、ラットを麻酔下で屠殺した。 精巣、精巣上体、および精嚢を分離して秤量し、以下の式に従って器官指数を計算した：（器官の重量／動物の重量）×１００パーセント。 その後、精巣上体の精子を採取し、その運動性と先体酵素活性を調べました。 同様に、精巣組織は、組織病理学的研究およびROS、LPO、および抗酸化酵素活性の検出のために収集されました。

生存精子率の評価

精巣上体を手術用ハサミで切開し、精子懸濁液を生理食塩水で調製した。 生存精子率を評価するために、5 μL の精子懸濁液を等量のエオシン Y 染色液と慎重に混合しました。 次に、精子を光学顕微鏡で数えました。 生きている精子率は、染色された精子 (死んだ精子) と染色されていない精子 (生きた精子) の両方を計算することによって評価されました。

精子先体酵素活性の測定

精子先体酵素活性アッセイは、精子先体酵素を評価するために利用された[19]。 各グループの結果は、次の式を使用して計算されました: 先体酵素活性 (μIU)=(ODExperiment グループ - ODBlank グループ)/(247.5×10) × 106。

統計分析

すべての定量的データは平均 ± SD として表され、SPSS 22.0 ソフトウェアを使用して分析されました。 独立スチューデントの t 検定を使用して、2 つのグループ間のデータを比較しました。 *P< 0.05 and **P < 0.01 were considered statistically significant differences.

結果

GC-1細胞に対する低酸素の影響

生殖細胞に対する低酸素の影響を決定するために、まず、1、3、5 について、異なる酸素濃度 (20 パーセント、15 パーセント、10 パーセント、および 5 パーセント) による低酸素処理後の細胞生存率の変化を調べました。 、および 7 日、それぞれ。 CCK-8 アッセイの結果は、対照群 (酸素濃度 20%) と比較して、低酸素状態にさらされた細胞が生存率の有意な低下を示したことを示しました (P < 0.01; 図 1A)。 さらに、それらの生存率は酸素濃度に反比例し、誘導時間とともにさらに減少しました。 過剰な細胞毒性効果を避けるために、10% の酸素濃度と 3- 日間の誘導時間が、その後の in vitro 実験の低酸素モデル基準として選択されました。

続いて、低酸素処理下でのGC{{0}}細胞の増殖変化をさらに評価するために、FCMおよび免疫蛍光染色を実施しました。 結果は、低酸素が G1 期で GC-1 細胞停止を誘発し、それによって S 期への細胞の侵入を減らし、DNA 複製を阻害することを示しました。 したがって、低酸素症は GC-1 細胞の増殖指数を大幅に低下させました (P < 0.01; 図 1B)。 正の Ki-67 染色は、増殖細胞のもう 1 つの特異的なバイオマーカーです。 したがって、低酸素処理の有無にかかわらず、Ki-67-陽性細胞の比率も調べました。 図 1C に示すように、対照群と比較して、低酸素治療は Ki-67- 陽性細胞を著しく減少させました。

次に、低酸素によって誘発される GC{{0}} 細胞生存率阻害のモードを調査することを目的としました。 文献で報告されているように、ROS のレベルは、ラットが低圧の低酸素環境にさらされると増加しました [8、20]。 したがって、GC-1 細胞の内因性 ROS レベルは、FCM アッセイを使用して測定されました。 結果は、通常の酸素グループと比較して、低酸素下でより高い ROS レベルを示しました (P < 0.01;図 1D)。 蓄積された ROS は顕著な DNA 障害を引き起こし、それが次に細胞アポトーシス経路の活性化を引き起こし、男性不妊のリスク増加の主要な病因因子である可能性があります [21、22]。 次に、TUNEL染色により、GC-1細胞に対する低酸素のアポトーシス活性化効果を検出しました。 図 1E に示すように、低酸素による治​​療は、対照群と比較して TUNEL 蛍光の増加をもたらし、モデル群でのアポトーシスの増加を示しています。

ROS による細胞損傷は通常 OS によって引き起こされるため、GC-1 細胞の OS をさらにテストしました。 図 1F に示すように、モデル グループの GC-1 細胞の LPO レベルは、対照群の GC-1 細胞の LPO レベルと比較して著しく増加しました。 これらの発見は、低酸素誘発性 GC-1 細胞損傷が、ROS 蓄積によって誘発される OS に関連している可能性があることを示唆しています。
in vitro での低酸素誘導 GC-1 細胞生存率に対する Cis の効果。

Cis が GC{{0}} 細胞の生存率に対する低酸素の阻害効果を防止できるかどうかを調べるために、CCK-8 アッセイを実施しました。 GC-1 細胞は、異なるサブタイプ (Cis-A、B、C、H) および濃度範囲 (0.02 μM、0.2 μM、2 μM) の Cis で処理されました。 72時間。 モデル グループと DMSO グループを比較すると、DMSO は GC-1 細胞の生存率を直接促進しないことが示されました (図 2A)。 ただし、Cis 処理により細胞生存率は著しく回復しました (P < 0.05)。

モデル グループと比較して、Cis-A、Cis-B、Cis-C、および Cis-H はすべて、低酸素による GC-1 細胞の生存率への損傷に対して特定の保護効果を示し、Cis-B は最も有意な保護効果を示しました。効果 (図 2A)。 0.2 μM でのシスの保護効果は、{{10}}.02 μM でのシスの保護効果よりも有意に高かったが、2 μM と0.2 μM は明らかではなく、Cis によって誘発された回復した GC-1 細胞生存率が 0.02-0 からの濃度範囲の用量依存的な増加を示したことを示しています。 2 μM (図 2A)。 したがって、実験の必要性に応じて、0.2 μMCis が次の in vitro 実験で最適な濃度として選択されました。 生殖細胞が実際にCisによって保護されているかどうかをさらに確認するために、FCMおよびKi-67染色を行い、Cis処理後のGC-1細胞の増殖の変化を評価しました。 Cis 処理により、G1 期の GC-1 細胞の割合が減少しました。 対照的に、より多くの細胞が S 期に入り、Cis 処理が生殖細胞増殖指数を増加させる可能性があることを示唆しています (P < 0.01; 図 2B)。 GC-1 細胞周期の統計を図 2Bb に示します。 Ki-67 染色の結果は、Cis-A、Cis-B、Cis-C、および Cis-H 処理により、低酸素誘導 GC の Ki-67- 陽性細胞比率が大幅に改善されたことも示しました{{40}。 } 細胞の in vitro (図 2C)。

Cis のメカニズムは、in vitro で生殖細胞を低酸素から保護します。

GC-1 細胞に対する Cis の保護効果が過剰な ROS の除去に関連しているかどうかを調べるために、蛍光色素 DCFH-DA を使用して各グループの ROS レベルを検出しました。 図 3A、および 3B に示すように、DMSO による処理は、モデル グループと比較して細胞内 ROS コンテンツまたは LPO レベルを変更しませんでした。 ただし、GC-1 細胞の ROS レベルは、Cis 処理群で著しく減少しました (図 3A)。 さらに、LPO の減少は、Cis にさらされた GC-1 細胞でも観察されました (図 3B)。

Cis が生殖細胞を低酸素損傷から保護するメカニズムをさらに調査するために、TUNEL 染色、およびウエスタンブロット分析を実行してアポトーシスを評価しました。 TUNEL 染色 (図 3C) は、モデルおよび DMSO グループで有意なアポトーシスを示しました。 ただし、Cis 処理で観察されたアポトーシス細胞は少なく、Cis 処理が GC-1 細胞のアポトーシスを減少させたことが示されました。 さらに、PARP、Caspase-3、Bax、および Bcl-2 の発現を測定して、分子メカニズムを裏付けました。 図 3D に示すように、カスパーゼ -3 と PARP は低酸素下の GC-1 細胞で活性化され、この活性化は Cis 処理によって阻害されました。 さらに、Bax/Bcl-2 の比率は対照群よりモデル群の方が高く、Cis 処理により Bax/Bcl-2 の比率が減少しました (図 3D)。 これらのデータは、Cis が低酸素による酸化損傷を軽減する潜在的な能力を持っていることを示しており、この保護効果は、ROS の蓄積を減らし、カスパーゼ関連のアポトーシス経路の活性化を阻害することによって達成される可能性があります。

OS を阻害する酵素メカニズムには、グルタチオンレダクターゼ (GR)、グルタチオンペルオキシダーゼ (GPx)、およびスーパーオキシドジスムターゼ (SOD) などのフリーラジカルスカベンジャーが関与します [23]。 OS を阻害する酵素メカニズムは、細胞や組織の酸化的損傷を防ぐ上で重要な役割を果たします [23]。 GC-1 細胞における低酸素誘導 OS の Cis 阻害の潜在的なメカニズムをさらに検証するために、GR、GPx、および SOD の活性を測定しました。 その結果、GR、GPx、および SOD の活動はすべて、対照群と比較して低酸素下で大幅に減少し (P < 0.01、図 3E)、Cis 治療によりそれらの活動が著しく回復したことが明らかになりました。低酸素にさらされた GC-1 細胞 (P < 0.05、図 3E) は、これらの化合物が強力な内因性抗酸化システムを活性化できることを示唆しています。

低圧低酸素誘発ラットにおける生殖に対するCisの影響。

雄ラットに対する低圧低酸素症の影響を判断するために、我々は最初に低圧低酸素症誘発ラットの精巣の形態学的変化をテストしました。 HE染色の結果、対照群では、基底膜から内腔まで様々な段階の正常な造精細胞が整然と並んでおり、成熟した精子が尿細管内腔に見られた(図4A)。 コントロールと比較して、精巣組織の病理学的変化がモデル群で観察され、精巣上皮細胞の基底膜が緩く配置され、精子形成上皮が非常に薄く、生殖細胞のレベルと数が著しく減少しました (図 4A)。 .

しかし、Cis による治療は、in vivo での低圧低酸素誘発性精巣損傷の組織学を著しく改善しました (図 4A)。 また、体重、精巣重量、精巣上体重量、精嚢重量を測定し、生殖器指数（生殖器/体重比）を算出しました。 図 4B-D に示すように、生殖器指数 (精巣、精巣上体、および精嚢腺) は、対照群よりもモデル群で著しく低かった (P < 0.01)。 しかし、ラットの生殖器指数に対する低圧低酸素症の影響は、Cis 処理で逆転しました (図 4B-D)。

次に、雄ラット精子の先体酵素活性と生存精子率も測定して、精巣機能障害を解明しました。 図 4E、4F に示すように、先体酵素活性と精子の運動性は、対照群よりもモデル群のラットの方が低かった (P < 0.01)。 ただし、モデル グループのラットと比較して、8 mg/kg/d Cis で処理したラットでは先体酵素活性が回復しました (P < 0.05) (図 4D)。

さらに、図 4Fに示すように、Cis による治療は生存精子率も高めました。 8 mg/kg/d Cis で処理されたラットはすべて、生存精子率の有意な増加を示しました (55.83 ± 6.03%、P < 0.05; 69.00 ± 2.29 パーセント、P < 0.01; 52.33 ± 3.40 パーセント、P< 0.05; and 53.67 ± 2.25%, P < 0.05 respectively) when compared with the model rats (43.83 ± 4.01%).

まとめると、これらの結果は、低圧低酸素環境が雄ラットの精巣の形態学的変化、生殖器官の体重減少、および精巣機能の損傷を引き起こし、Cisが低酸素による損傷から生殖器官を効果的に保護できることを示唆しています。

低圧低酸素誘発ラットの精巣におけるOSに対するCisの効果。

ラットの精巣におけるROSおよびLPOレベルを測定して、低圧低酸素誘導OSに対するCisの影響を分析しました。 ROS 分析は、コントロール グループと比較して、モデル グループの精巣の ROS レベルが大幅に増加したことを明らかにしました (P < 0.01 図 5A)。 逆に、LPO は精巣で劇的に上昇しました (P < 0.01) 正常酸素状態と比較して低圧低酸素下で (図 5B)。 ただし、Cis 治療は上記の変化を変更し (P < 0.05)、Cis-B は他の Cis よりも優れた効果を発揮しました (図 5A、5B)。 Cis は、in vivo での低圧低酸素条件下で OS を低下させることにより、精巣を保護するように思われました。

さらに、アポトーシス分析を行って、Cis が低圧性低酸素症による精巣機能障害から保護されるメカニズムをさらに評価しました。 TUNEL 染色の結果 (図 5C) は、対照群と比較してモデル群に有意なアポトーシスが存在することを示しました。 しかし、Cis (8 mg/kg/d) 処理後、アポトーシス細胞は少なくなりました (P < 0.05) (図 5C)。 ウエスタンブロットデータはまた、低酸素および低圧治療がカスパーゼ-3およびPARPの活性化をもたらし、精巣組織のBax/Bcl-2比を増加させ、アポトーシスの増加を示すことも示した(図5D)。 さらに、さまざまな種類のシス治療により、精巣組織のアポトーシスが大幅に減少しました (図 5D)。 同様に、精巣組織の IHC 分析でも同様の結果が得られました (補足図 1)。

低圧低酸素症によって引き起こされるシス減少OSのメカニズムを検証するために、精巣組織におけるGR、GPx、およびSODの活性をさらにテストしました。 図 5E に示すように、対照群と比較して、低圧低酸素治療は GR、GPx、および SOD 活動を大幅に減少させました (P < 0.01)。 ただし、Cis 処理は、低圧低酸素症で処理されたラットの精巣組織の酵素活性 (GR、GPx、および SOD) を回復しました (P < 0.05)。 結論として、Cis は、低圧低酸素条件下で強力な内因性抗酸化酵素防御メカニズムを活性化することにより、精巣を保護するように思われました。

議論

高地では、低気圧性低酸素症が男性の生殖器系を含む人間の複数のシステムに影響を与えることが知られています [4、20]。 最近の実験的調査は、低圧低酸素症が男性の生殖器系をどのように損なうかのメカニズムを理解することを目的としています。 この研究では、低酸素症による生殖障害に対するカンキクサからのシス抽出物の治療効果を調査しました。 結果は、シスが内因性抗酸化酵素の活性を高めることにより、低酸素誘導ROS蓄積とOSを減少させることにより、男性の生殖器系を低酸素損傷から保護する可能性があることを実証しました。

ROS は酸素由来のフリーラジカルであり、人間の生理学と病理学において重要な役割を果たします。 低用量の ROS は、精子の受精能獲得、先体反応、および精子と卵母細胞の融合に不可欠です [24、25]。 しかし、ROS の過剰な蓄積は、しばしば生殖細胞や間質細胞の損傷につながり、男性不妊につながります [26]。 ROS は、過酸化によって細胞膜、核酸、タンパク質、酵素、およびその他の生体高分子を容易に損傷する可能性があります。 さらに、抗酸化物質の保持能力を超えると、細胞や DNA に損傷を与える可能性もあります。 蓄積された証拠は、男性の生殖能力の病因におけるROSの極めて重要な役割を支持しています[27、28]。 ROS の産生は、酸素分圧によって調節されます。 低酸素条件下では、環境中の利用可能な酸素が減少し、血液粘度が増加するため、生体内の多くの酸素依存代謝プロセスに影響を与えます [29, 30]。 しかし、高地では大気圧が低いため、静脈還流が不十分になり、血流によって生物のすべての細胞に運ばれる酸素量が減少し、臓器や細胞の低酸素症がさらに増加し​​ます[29、30]。

したがって、高地への曝露は、酸素需要が血管供給を超えると、ROS の生成と蓄積を含む一連の低酸素生理学的反応を引き起こします。 前述のように、ROS の蓄積はさまざまな細胞内効果をもたらしますが、その中で最も重要なのは細胞内で OS を引き起こすことです。

OS は、酸化反応と還元反応の間の不均衡を指し、別の反応物から電子を受け取る過剰な酸化剤または分子の生成につながり、ROS を生成します [31、32]。 OS は、高地への曝露など、一連の内因性および外因性の要因によって引き起こされる可能性があることがよく理解されています。 精子は、細胞修復システムが不十分で、多価不飽和脂肪酸の原形質膜含有量が高いことを考えると、特に OS の影響を受けやすい細胞です [33]。 精巣および精巣上体組織も例外ではなく、低酸素状態にさらされたラットの円形精子細胞で重度の OS の存在が観察されている [4]。 OS は DNA の安定性に影響を与え、配偶子の遺伝物質の完全性を危険にさらします [34-36]。

しかし、男性の配偶子における高レベルの DNA 損傷は、アポトーシスシグナル伝達の活性化につながることが確認されており、その結果、精巣上体の精子数が減少し、欠陥のある細胞の割合が増加します [28, 37]。 現在の研究では、低酸素症は、アポトーシスの誘導と細胞周期の停止により、GC-1 細胞の生存率を大幅に低下させました。 さらに重要なことに、低酸素刺激後の FCM 分析によって ROS レベルの大幅な増加が示され、アポトーシス率の増加と、カスパーゼ -3、PARP、および Bax/Bcl-2 比の活性化の増加が示され、ROS が活性化できることが示されました。低酸素誘発性受精能損傷時にカスパーゼシグナル伝達経路を活性化することによるアポトーシス。 現在の調査結果は、低酸素症が過剰な ROS の蓄積につながり、生殖細胞に酸化的損傷を引き起こすことを実証しました。 したがって、低酸素症による生殖障害を軽減するための効果的なアプローチとして役立つ新しい抗酸化物質を特定することは意味があります。

OS から保護するために、主に酵素因子で構成される複雑な抗酸化システムが体内に存在します。 生理学的条件下では、ROS 含有量と抗酸化システムは一定のバランスを維持します。 しかし、ROS の過剰生産は精子の抗酸化システムを枯渇させ、OS につながり、精子の DNA 損傷を引き起こし、生殖能力と妊娠率を低下させます [23]。 したがって、男性の生殖器系における細胞レベルでの ROS の過剰産生および関連する有害な影響に対処するために、さまざまな抗酸化戦略がテストされています [23]。 現在、抗酸化活性を有する化合物の使用と精子機能の改善に関する文献は豊富です。 重要なことに、ほとんどの報告では、経口抗酸化物質摂取後の精子パラメーターの改善について説明しています。これには、精子の濃度と運動性の改善、または DNA 損傷の減少が含まれます [38]。 したがって、OS関連の問題による不妊症のために経口抗酸化剤を処方する泌尿器科医の数が増えています[39]。 これらの抗酸化物質には、主にカルニチン、ビタミン、亜鉛、メラトニン、および天然化合物が含まれます [23, 40]。

現在、薬物抽出技術の開発に伴い、これらの抗酸化物質が OS の破壊的な影響を軽減できるため、男性不妊症を軽減するために考慮される TCM 抽出物の数も増加しています [41]。 Yüce A.ら。 2013 年に、シナモンは精巣の酸化と抗酸化のバランスと精子の質に有益な効果があると報告されました [42]。 張 L ら。 は、クルクミンが患者の精子の運動性を大幅に改善し、H2O2 を減少させることを示しました [43]。 さらに、ブルーベリー、クロッカス サティバス、ザクロの種子、緑茶などの他のさまざまな植物抽出物も、抗酸化メカニズムによって生殖器系を保護することが示されています [27, 44-47]。 Cistanches Herba は、他の条件の中でも特に、不妊症の治療のための好ましい安全性プロファイルと幅広い薬効を持つ重要な TCM です [13]。 現代の薬理学的研究は、カンカン草が抗酸化、抗炎症、肝保護、および抗神経変性疾患活性などのさまざまな活性を有することを示しています [13, 48]. したがって、Cistanches Herba からの抽出物、分画、または化合物は、不妊症の治療のための潜在的な抗酸化機能を持っている可能性があります。

繁殖力を改善する植物の活性物質には、PhG、サポニン、酸素化揮発性化合物、アルカロイドなどのさまざまな化学基が含まれます [41]。 PhG の薬理学的活性研究は、PhG が抗酸化、抗放射線神経保護、性機能増強などの幅広い生物活性を示すことを示しています [49, 50]。 その中でも抗酸化作用が徐々に注目されています。 PhG のいくつかの単一成分または画分は、さまざまな化学物質によって誘発される生殖細胞のアポトーシスを阻害することが報告されており、in vitro でのそれらの抗酸化能力は、いくつかの動物モデルで in vivo でも実証されています [51、52]。 これらの結果は、PhG が男性不妊治療の魅力的な候補となり得ることを示しています。 Cis は、Cistanches Herba から分離できるアクティブな PhG です。

本研究では、低酸素処理細胞またはラットモデルに対するCisの影響を調査し、根底にある分子メカニズムを調査しました。 Cis は、GC-1 細胞の低酸素による生存率の低下とアポトーシスの増加に対して保護活性を示し、in vivo でのラットの生殖器系における低酸素による損傷に対する保護効果も示しました。 GR、GPx、および SOD の比活性は、Cis で処理した精巣または GC-1 細胞で有意に増加しましたが、正常酸素圧グループと比較して、低酸素下での GR、GPx、および SOD 活性の有意な減少が観察されました。 シスは、抗酸化酵素の活性を高めることにより、低酸素条件下で精巣と GC-1 細胞を保護するように思われました。

酵素抗酸化物質は、主にスーパーオキシド アニオンを除去することによって機能し、脂質の過酸化と DNA 損傷を防ぎ、不妊を防ぎます。 酵素的抗酸化メカニズムは、酸化的損傷を防ぐ上で重要な役割を果たします [23]。 OS に対する酵素メカニズムは、フリーラジカルスカベンジャーと、GR、GPx、SOD などのグルタチオン依存性酵素で構成されています [12]。 抗酸化酵素は、男性の生殖器系に不可欠であることがよく理解されています. 現在の研究では、低圧低酸素下での抗酸化酵素活性の低下の効果は、モデルグループのROSとLPOの増加を伴い、これは以前の報告と一致しています[12]。

しかし、Cis の投与により、GC-1 細胞とラットの精巣における抗酸化酵素活性が回復し、以前に示唆されたように、低圧低酸素による損傷を防ぐために Cistanches Herba を投与する戦略を立てることが可能になりました。 現在の結果は、Cisによる治療がラットの低酸素誘発性生殖細胞損傷を部分的に減少させることを示しましたが、その生殖保護効果の全体像を解明するにはさらなる調査が必要です. たとえば、Cis の特定のメカニズムは、抗酸化酵素の活性に影響を与えます。 さらに、シスは低酸素症によって引き起こされた生殖障害から部分的にしか回復しないため、他のメカニズムも適切であるかどうかという問題があります。 最後に、Cis が生殖細胞に対して直接的な増殖促進効果を持っているかどうかも考慮する必要があります。

結論

一般に、この研究の発見は、低酸素症による男性の生殖障害の治療のための抗酸化剤としてのシスの可能性を強調しています。 シスは、抗酸化酵素活性を回復し、ROS 誘導 OS を減少させ、同時に細胞生存率を増加させ、アポトーシスを減少させることにより、低酸素による男性の生殖障害から保護することができます。 重要なことに、この研究で研究されたCisサブタイプ（Cis-A、Cis-B、Cis-C、およびCis-H）はすべて、生殖器系に対して一定の保護効果を示し、Cis-Bは最も顕著な効果を示しました. したがって、正確な根本的なメカニズムについてはさらに調査する必要がありますが、Cisは低酸素症による男性の生殖障害の治療に適した抗酸化物質の候補である可能性があると推測しています.

謝辞

この研究は、中国国立自然科学基金 (番号 81672535; 82002686) と中国人民解放軍 (医療科学研究基金; 第 16QNP114) からの助成金によって支えられました。

利益相反の開示

なし。

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Fengqi Yan1*、Xiaoliang Dou1*、Guangfeng Zhu1*、Mingyuan Xia1、Yahui Liu3、Xiaozi Liu3、Guojun Wu2、He Wang1、Bo Zhang1、Qiuju Shao4、Yong Wang

1 泌尿器科、唐都病院、第四軍医大学、西安 710038、陝西省、中国; 2 泌尿器科および腎臓科の病院、西安人民病院、西安 710100、陝西省、中国; 3 基礎医学研究所、第四軍医大学、西安 710032、陝西省、中国。 4 放射線治療科、唐都病院、第 4 軍医大学、西安 710038、陝西、中国。 * 同等の貢献者。

2020 年 9 月 1 日受領。 2021 年 1 月 18 日受理。 Epub 2021 年 5 月 15 日; 2021 年 5 月 30 日公開

要約: 低酸素症が男性不妊の原因であり、低酸素症が酸化ストレス (OS) に関連している可能性があることを示す証拠が増えています。 シスタノシド (Cis) は、カンカン草から抽出できるフェニルエタノイド配糖体化合物で、さまざまな生物学的機能を持っています。 この研究は、低酸素症によって誘発される生殖障害に対するCisの保護効果を調査し、特定の根本的なメカニズムを調査することを目的としていました。 細胞および動物の低酸素実験モデルが構築され、オスの生殖器系に対するシスのさまざまなサブタイプの保護効果が、in vitro および in vivo の両方で評価されました。 結果は、低酸素が細胞周期の停止とアポトーシスの活性化を通じて GC-1 細胞の生存率を大幅に低下させることを示しており、これは OS の増加と関連していました。 さらに、Cis は、in vitro と in vivo の両方で強力な抗酸化効果を示し、抗酸化酵素活性を大幅に回復させ、活性酸素種 (ROS) レベルをダウンレギュレートしながら、細胞の生存率を高め、アポトーシスを減少させました。 重要なことに、ここで研究されたCisサブタイプ（Cis-A、Cis-B、Cis-C、およびCis-H）はすべて、特定の抗酸化効果を示し、その中でCis-Bの効果が最も重要でした。 この研究は、Cis が精巣および GC-1 細胞の抗酸化酵素活性に影響を与えることにより、低酸素症による OS の有害な影響を著しく軽減することを示しています。

キーワード: シスタノシド, 低気圧性低酸素症, 男性不妊症, 酸化ストレス, 生殖保護

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