パートⅠQi Sui Zhu Shui 石膏は AQP1 と MAPK シグナル伝達を阻害し、肝硬変性腹水によって引き起こされる肝損傷を軽減します
May 12, 2023
概要
1. 目的
現在のところ、現代医学では肝硬変性腹水に対する特別な治療法はありません。 Qi Sui Zhu Shui 石膏 (QSZSP) は腹水に使用されています。 この研究の目的は、肝硬変性腹水の治療における QSZSP の作用機序とアクアポリン 1 (AQP1) との関係を調査することでした。
2. 方法
24 匹のラットを 4 つのグループに分け、各グループに 6 匹のラットを割り当てました。 四塩化炭素・オリーブオイルを造形に注入。 対照群とモデル群はブランクゲル石膏（2cm×2cm）で治療され、QSZSP低用量群はQi Sui Zhu Shui石膏（1cm×1cm）で治療され、QSZSP高用量群はQiで治療される。水朱水石膏（2cm×2cm）。 体重および腹囲の変化を測定し、HE染色により肝臓、腎臓および腹膜の病理組織学的変化を観察し、肝機能に関連する生化学的指標を検出し、AQP1発現およびMAPK経路の活性化の変化を検出した。肝臓、腎臓、腹膜組織の組織は、IHC 染色とウェスタンブロットで評価されました。
3. 結果
四塩化炭素肝油を１週間注射した後、モデル群のラットの体重はゆっくりと増加し、モデルラットの腹囲は時間の経過とともに増加し続けた。 肝硬変腹水モデルの構築から 16 週間後、肝臓、腎臓、腹膜が著しく損傷し、ラットの血清 TBiL、AST、ALT、Cr、BUN、K、Na、Ca レベルが有意に高くなりました ( P < 0.001) および ALB レベルは対照群よりも有意に低かった (P < 0.001)。 4週間の治療後、肝臓、腎臓、腹膜の損傷は改善しました。 モデル群よりも、TBiL、AST、ALT、Cr、BUN、K、Na、Ca レベルが有意に低く (P < 0.001)、ALB レベルが有意に高かった (P < 0.001)。 AQP1、p-ERK、p-JNK、および p-p38 のプラス e タンパク質発現は、肝臓、腎臓、および腹膜で阻害されることが判明しました。
4. 結論
QSZSP は、肝臓、腹膜、腎臓における AQP1 および MAPK シグナル伝達経路のタンパク質発現を阻害し、肝硬変性腹水による肝臓、腎臓、腹膜損傷を軽減し、腹囲の異常な成長を軽減します。
キーワード
AQP1、MAPKシグナル伝達、肝損傷、腹水、カンクサのサプリメント.
序章
肝硬変は、さまざまな病原因子が肝臓組織に持続的または反復的に作用することにより、肝細胞の変性、壊死、再生、線維組織の増殖などの一連の病理学的変化によって引き起こされる一般的な臨床疾患であり、主に肝臓の症状として現れます。機能低下[1]。 肝硬変の世界的な有病率は不明です。 米国における肝硬変の有病率は約 0.15% ～ 0.27% です [2]。 69% の人は自分が肝硬変であることを知らず、糖尿病、アルコール乱用、C 型肝炎と B 型肝炎、男性であること、高齢であることはすべて肝硬変と関連しています [3]。 病因に関係なく、肝硬変患者の 50% が肝硬変性心筋症を発症します [4]。 2017 年の米国人口動態統計報告書では、成人人口の 1.8% に相当する約 450 万人の成人が慢性肝疾患と肝硬変を患っていると報告しています。 慢性肝疾患と肝硬変により41,473人が死亡した[5]。
腹水は肝硬変の最も顕著な臨床症状です。 腹腔内の異常な体液の蓄積です。 代償性肝硬変患者の約60％は、診断後10年以内に異常な腹水貯留を発症する 肝硬変性腹水、特に難治性腹水の発生率が高く、予後が不良であるため、多くの致命的な合併症を引き起こす可能性があり、肝硬変患者の生活の質と生存率に深刻な影響を与える[7]。 肝臓がん症例の 90% は肝硬変の存在と関連しています [8]。
伝統的な中国医学 (TCM) には悪性腫瘍を阻止または遅延させる効果があり、毒性は低い[9]。 漢方薬の長期使用は、慢性B型肝炎患者の肝硬変のリスクを軽減する可能性があります[10]。 Qi Sui Zhu Shui 石膏 (QSZSP) は、レンゲ、カンスイ、オークランディエ、ポリア、ヘルバ レオンリ、サルビア ミルティオルリザエ、および皮皮アレカエで構成されています。 以前の臨床研究では、肝硬変性腹水患者のQSZSP補助療法により、QSZSPによる3ヶ月の連続治療後に尿量の改善、24時間尿中ナトリウム排泄、クレアチニンおよび総ビリルビンレベルの低下、アルブミン含有量の増加、腹水再発率の改善が見られたことが判明しました。 [11]。 QSZSP と肝硬変腹水に関する研究はほとんどありません。 QSZSP の成分と肝硬変に関する研究の歴史の中で、肝硬変腹水の一次治療に対するアジュバントとしての Xiaozhang Tie は安全です [12]。 Salviae miltiorrhizae は肝硬変と門脈圧亢進症を大幅に改善します [13]。 肝硬変性腹水の治療における QSZSP の作用物質については、さらなる研究が必要です。
その後、CHIP28 はアクアポリンと名前が変更されました [14、15]。 13 個のアクアポリン (AQP0-AQP12) が同定されています [16-18]。 アクアポリンには 3 つのアイソフォームがあります。 最初のサブタイプは水分子のみを輸送し、2 番目のサブタイプは水分子、尿素、グリセロールなどを輸送し、3 番目のサブタイプはエネルギー消費や制御なしに輸送チャネルを継続的に開きます [19-21]。 アクアポリン 1 (AQP1) は最初のサブタイプに属し、四量体として存在し、水分子のみが膜を通過して輸送できるようにし、独立した水チャネルです [22、23]。 肝臓、腹膜、腎臓は密接に接触している臓器であり、AQP1 はたまたま肝臓、腹膜、腎臓に分布しています [24]。 人体の水分含有量は体重の 70% であり、腹腔内での異常な水分の生成、吸収、排泄は腹水形成の重要な要因です [19]。 AQP1 は、水分子の輸送のみに関与するアクアポリンの 1 つです。 肝硬変における腹水は肝臓での体液の蓄積の増加につながり、過剰な体液は腹膜に移動しますが、腹膜では十分な水分が再吸収されず、最終的には腎臓による水分の再吸収の増加につながるため、AQP1は研究すべき重要な中間体である可能性があります。腹水の代謝。
最初は、肝硬変により肝機能が低下し、腹腔および胸腔内の体液の蓄積が増加し、腹水が形成されます[25]。 腹水は肝硬変でよく発生します[6]。 腹水は、腹腔内の異常な体液の蓄積です [6]。 肝硬変性腹水は腎機能障害を引き起こす可能性があります[26]。 末梢動脈血管拡張仮説では、腎臓は腹水の 5 つの段階すべてに関与しています [27]。 肝臓、腹膜、腎臓における AQP1 発現を関連付けることで、肝硬変腹水における「肝臓 - 腹膜 - 腎臓」軸を提案し、それが肝硬変腹水の形成に重要な役割を果たしていることを示唆します。 AQP1 はグリア細胞の MEK1/2 阻害剤によって調節されていることが報告されています [28]。 前立腺がん細胞では、AQP1 タンパク質の発現レベルは p38MAPK によって制御されています [29]。 ヒト胸膜中皮細胞では、ペプチドグリカンは AQP1 タンパク質発現の p38 MAPK 制御を阻害します [30]。 したがって、MAPK 経路は、「肝臓-腹膜-腎臓」軸における AQP1 変化の方向となるでしょう。
肝硬変性腹水の治療における QSZSP の役割および AQP1 との関係はまだ報告されていません。 「肝臓・腹膜・腎臓」軸は、アクアポリンを共通物質基盤とする水分代謝の機能軸であり、腹膜液の「産生・吸収・排出」に関与し、腹膜の形成に重要な役割を果たしていると考えられます。肝硬変性腹水のこと。 MAPK 経路は、AQP1 の QSZSP 制御を媒介する可能性があります。 したがって、この研究では、肝硬変性腹水のラットを QSZSP で in vitro で治療し、肝臓、腎臓、腹膜の組織病理学的変化を観察し、肝臓、腎臓、腹膜における AQP1 発現と MAPK 経路の活性化の変化を評価しました。肝硬変性腹水の治療における QSZSP の効果とそのメカニズムを解明するための組織の研究。
カンカンキエキス
材料と方法
1. 摂政。
使用した試薬は次のとおりです: Macklin の四塩化炭素 (C805332)、Yihai Kerry Golden Dragon Fish Cereals, Oils and Foodstuffs Co., Ltd. (中国) のオリーブ油、National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co. のキシレンおよび無水エタノール。 Ltd. (中国)、Solarbio (中国) のエオシン (E8090) および中性樹脂 (G8590)、Service のヘマトキシリン (G1004)。
2. Qi Sui Zhu Shui 石膏プロセス。
Qi Sui Zhu Shui 石膏は、Radix Astragali、Radix Kansui、Radix Aucklandiae、Poria、Herba Leonuri、Radix Salviae miltiorrhizae、および Pericarpium Arecae で構成されています。 上記7種類の漢方薬は、2010年版『中国薬局方』の規定に基づき、広西中医薬大学第一付属病院から購入したものです。
Radix Astragali、Poria、Herba Leonuri の各 1 g に 12 ml の水を加え、30 分間浸し、水還流抽出を各回 1.5 時間で 3 回繰り返し、抽出物を合わせて濾過します。 。 85% エタノール 6 ml を、Radix Kansui、Radix Aucklandiae、Radix Salviae miltiorrhizae、および Pericarpium Arecae の各 1 g に加え、30 分間浸漬し、水還流抽出を各回 1.5 時間で 2 回繰り返し、抽出物を合わせます。濾過された。 上記２つの抽出物を合わせ、真空乾燥して乾燥粉末を調製した。 ベースは、60 パーセントのアクリル酸ナトリウム、30 パーセントのカルボマー、10 パーセントのグリシン酸アルミニウム、および 6 倍のグリセリンで構成されています。 浸透促進剤は、50 パーセントのアゾンと 50 パーセントのプロピレングリコールで構成されています。 基剤、浸透促進剤、乾燥粉末を混合します。 QSZSPを製造するコーター（RK-200、天津瑞康八部製薬生物技術有限公司）を使用します。 ヒドロゲルペーストは、RK-200 ヒドロゲルコーティング機 (Tianjin Ruikang Babu Pharmaceutical Biotechnology Co.) によって調製されます。 この製品の各錠剤には、レンゲに含まれるレンゲ メチラーゼ (C41H68O14) が 0.6932 mg 以上、カンスイに含まれるユーフォルビア グランディス ジエノール (C30H50O) が 1.4766 mg 以上含まれています。
3. 動物。
三峡大学の動物、雄ラット 24 匹、体重 200 ～ 250 g を、特定の病原体が存在しない条件 (特定病原体フリー、SPF) で飼育しました。 飼育環境は 22 ～ 26 度、相対湿度 50% ～ 60% です。 モデリングは2週間後に始まります。 四塩化炭素とオリーブ油を４：６の割合で、腹腔内注射量を３ｍＬ／ｋｇ体重とし、注射を週２回（４日と７日）、１１週間行った。 対照群には、等張性のオリーブオイルを腹腔内注射しました。 各注射の前に体重と腹囲を測定します。 期間中、75パーセントの医療用アルコールを含む蒸留水を使用して、ラット用の濃度10パーセントの飲料水を調製した。 最後に、治療後 4 週間以内に、ラットの体重 (表 1) と腹囲 (表 2) を週に 2 回、15 週間測定しました。
4. 処理とサンプリング。
24 匹のラットを 4 つのグループに分け、各グループに 6 匹のラットを置き、すべてのラットの腹部を脱毛し、脱毛領域は 3 cm × 3 cm でした。 対照群（Con）は、空のゲル石膏（2 cm × 2 cm）で治療されます。 モデルグループ（Mod）、ブランクゲル石膏（2cm×2cm）。 QSZSP 低用量グループ、Qi Sui Zhu Shui 石膏 (1 cm × 1 cm)。 QSZSP 高用量グループ、Qi Sui Zhu Shui 石膏 (2 cm × 2 cm)。 これらを、脱毛したラットの腹部皮膚に、1日1回、6時間、4週間適用した。 肝硬変の逆転を防ぐために、治療中は四塩化炭素とオリーブオイルを週に1回背中に皮下注射しました。 4 週間後、動物は麻酔と瀉血によって屠殺されました。 動物が死亡していない場合は、ペントバルビタールナトリウムの過剰摂取（100 mg/kg）で動物を麻酔して死亡させた。 麻酔後、動物は呼吸も心拍もなく死亡した。 腹水を採取するには濾紙法が使用されます。 腹部大動脈から血液を採取し、遠心分離して血清を採取します。 適量の肝臓組織、腎臓組織、腹膜組織を切り出し、4% パラホルムアルデヒドで固定します。 また、肝臓、腹膜、腎臓の組織は-80度の超低温冷蔵庫に保管した。 ラットの固定肝臓、腎臓、腹膜組織を脱水し、ワックスに包埋しました。 切片を-20度で凍結し、厚さ3μmに切断し、ウォーターバスを使用して切片を引き伸ばし、切片をスライドに貼り付け、切片をバックアップのために4度で保管した。
カンサス粉末
5. ヘマトキシリンおよびエオシン (HE) 染色。
切片をヘマトキシリン溶液中で４分間染色し、続いて水道の流水で２分間１５秒間洗い流した。 次いで、切片をエオシン溶液で３分間対比染色した。 洗浄は、それぞれ 80 パーセントと 95 パーセントのエタノールで 30 秒間実行されました。 次いで、切片をキシレン中で３秒間洗浄し、中性バルサムでマウントした。 染色後、顕微鏡を使用して切片を観察し、Leica Application Suite を使用してサンプルの関連部分を収集および分析しました。
6. 生化学分析。
血清サンプルを 4 度で解凍した後、血清サンプルを深セン Mindray BS420 自動生化学分析装置で検出し、TBiL、AST、ALT、ALB、Cr、BUN、K、Na、Ca 濃度を深セン馬類分析装置で測定しました。深セン、中国）マッチング生化学キット。
7. 免疫組織化学的染色。
肝臓、腹膜、腎臓組織における AQP1 のタンパク質発現を免疫組織化学によって検査しました。 スライドを 65 度で 1 時間焼き、キシレンに 30 分間浸し、勾配アルコールで水和しました。 1 mM Tris-EDTA 緩衝液 (G1203、Servicebio) を 125 度、103 kPa で 18 分間修復に使用し、3 パーセント H2O2 (National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd.、中国) で 10 分間インキュベートし、 10% ヤギ血清 (SL038、Solarbio) で 30 分間、一次抗体 AQP1 (PAB45863、Bioswamp)、腹膜希釈 1:250、肝臓および腎臓希釈 1:400 で 4℃で一晩滴定しました。 切片を4℃から室温に移し、45分間放置した。 Max Vision TM HRPPolymer 抗ウサギ二次抗体 (KIT-5020、MXB) で 37 度で 60 分間処理しました。 切片の色が変わるまで DAB (DA1010、Solarbio) で処理します。 ヘマトキシリン 3 分、75 パーセント アルコール 5 分、85 パーセント アルコール 5 分、95 パーセント アルコール 5 分、100 パーセント アルコール 10 分、キシレン 10 分間、切片を順番に浸します。 中性樹脂シール部。 Leica Application Suite 画像システムを使用して、サンプルの関連部分をキャプチャしました。 核はヘマトキシリンで青色に染色され、DAB は陽性の茶色がかった黄色を示しました。
8. ウェスタンブロット。
肝臓、腹膜、腎臓組織における p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2/3、p-JNK1/2/3、および AQP1 のタンパク質レベルをウェスタンブロットによって分析しました。 。 組織サンプルをプロテアーゼ阻害剤を含むRIPA溶解物（R0010、Solarbio）中で4℃でホモジナイズし、12000gで15分間遠心分離しました。 タンパク質の濃度はBCAタンパク質アッセイキット(PC0020、Solarbio)を使用して測定した。 タンパク質（２０μｇ）を１２パーセントのドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ポリフッ化ビニリデン膜（ＩＰＶＨ０００１０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に転写した。 メンブレンを、トリス緩衝生理食塩水中、5% スキムミルクで室温で 2 時間ブロックし、p-ERK1/2 (ab214036)、JNK1/2/3 (ab208035)、p-JNK1/2/ に対する一次抗体とともにインキュベートしました。 3 (ab76572)、および p-p38 (ab47363) (Abcam (UK) から)、および ERK1/2 (MAB37123)、p38 (PAB37381)、AQP1 (PAB45863)、および GAPDH (PAB36269) (Bioswamp (中国) から）、4 で一晩程度 。 GAPDH 抗体 (PAB36269、Bioswamp) を内部標準として選択しました。 一次抗体の希釈率はすべて 1:1000 です。 次いで、膜をトリス緩衝生理食塩水で洗浄し、ヤギ抗ウサギIgG二次抗体(SAB43714、Bioswamp、1:20000)中で室温で2時間インキュベートした。 免疫反応性は、Immobileon Western HRP (WBKLS0500、Millipore) を使用した比色反応によって視覚化されました。 膜を自動化学発光分析装置(Tanon 5200、Tanon)でスキャンした。
9. 統計分析。
統計分析は、SPSS 23.0 ソフトウェアを使用して実行されました。 すべてのデータは平均値 ± 標準偏差 (SD) として表されました。 2 つのグループ間の比較は、独立サンプルの t 検定を使用して行われました。 一元配置分散分析を使用して 3 つ以上のグループ間の差異を比較し、事後フィッシャーの最小有意差 (LSD) 検定を個々のグループの比較に使用しました。 P < 0.05 の値は統計的に有意であるとみなされました。
シスタンケの効果
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ロン・ジェン・チャン 1 イン・リウ 1 ミン・リー 2 ヨン・リン・ファン 3 およびジェン・ヘン・ソン 3
1 中国、南寧市、広西中医薬大学第一附属病院肝臓科
2 中国、南寧市、広西中医薬大学第一附属病院医学検査部
3 中国、南寧の広西中医薬大学肝臓内科
