リポ多糖誘発性の肺上皮細胞の炎症とアポトーシスに対するオウゴニンの保護効果とその考えられるメカニズム
Mar 18, 2022
コンタクトtina.xiang@wecistanche.com
概要
バックグラウンド：オウゴニン（5、7-ジヒドロキシ-8-メトキシフラボン）は、コガネバナの根から抽出された天然のジヒドロキシルフラボノイドです。 この論文は、緩和におけるオウゴニンの作用機序を調査することを目的とした。炎症とアポトーシス急性肺損傷（ALI）で。
材料および方法：リポ多糖（LPS）を使用して、AL1のinvitroモデルを確立しました。 ウォゴニン処理後、LPS誘導A549細胞の細胞生存率とアポトーシスをそれぞれCCK -8、TUNELassays、およびアクリジンオレンジ/臭化エチジウム二重染色で測定し、炎症性サイトカインと酸化ストレスマーカーは、RT-qPCR、ELISAアッセイ、ウエスタンブロット分析、および市販のキットによって推定されました。 関与するタンパク質の発現を評価するためにウエスタンブロットも実施した。 続いて、サーチュイン1（SIRT1）を介した高移動度グループボックス1タンパク質（HMGB1）の脱アセチル化に対するオウゴニンの影響を調べました。 SIRT1阻害剤EX527を使用して、LPS刺激下のA549細胞におけるSIRT1-を介したHMGB1脱アセチル化に対するオウゴニンの調節効果を評価しました。
結果：LPSは、A549細胞の炎症、酸化ストレス、およびアポトーシスを誘発しましたが、これはオウゴニンによって廃止されました。 また、オウゴニンがHMGB1の脱アセチル化を促進し、SIRT1の発現がアップレギュレートされることもわかりました。 ただし、SIRT1阻害剤EX527は、LPS誘導A549細胞の炎症とアポトーシスに対するオウゴニンの保護効果を部分的に逆転させました。
結論：オウゴニンは、SIRT 1-を介したHMGB1脱アセチル化により、LPS誘導A549細胞の炎症とアポトーシスを軽減しました。これは、オウゴニンがALIに保護効果を発揮し、オウゴニンをすべての治療。
キーワード：急性肺損傷、オウゴニン、炎症、SIRT1、HMGB1脱アセチル化
バックグラウンド
急性肺損傷（AL）は、敗血症、肺炎、外傷、急性膵炎などの病的状態の結果として臨床的に記録されています[1]。 集中治療室に入院し、高い死亡率を示す患者によく見られます[2]。 ALIから生き残った人々は通常、生活の質の低下に直面しています[3]。 ALの病態生理を理解することで成果が得られたものの、現在の治療法の治療効果は限られており、患者とその家族の期待に応えることはできません[4]。 したがって、ALLの治療のための新しい治療法または標的を特定することは非常に緊急である。 構造を図1Aに示すウォゴニン（5、7-ジヒドロキシ-8-メトキシフラボン）は、コガネバナの根から抽出された天然のジヒドロキシルフラボノイドです[5]。 その重要な抗炎症特性と炎症性疾患の治療への応用は、多くの研究によって広く報告されています。 たとえば、オウゴニンは、マウスの肺浮腫を潜在的に改善し、p38マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）およびc-Jun NH（2）末端キナーゼ（INKリン酸化[6 ]。オウゴニンはまた、LPS誘発性好中球浸潤、炎症誘発性サイトカインの産生、接着分子の発現を減少させ、マウスにおけるLPS誘発性ALを抑制しました[7]。ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ（PPARy）を介したNF-KB経路によるオウゴニン治療の結果[8]。新たな研究は、オウゴニンが盲腸結紮および穿刺（CLP）誘発性の高移動度グループボックス1タンパク質（HMGB1）を減少させることを示した産生とHMGB1-依存性炎症、および敗血症関連の罹患率と肺損傷のリスクの低下[9]。LPS誘発性のinvitroおよびinvivo ALIモデルでは、HMGB1と ウリナスタチンを介した他の炎症性メディエーターは、明らかにALIの症状を緩和しました[10]。 また、以前の研究では、LPSによって誘発されたヒト肺上皮細胞（A549）がALIのinvitroモデルとして広く使用されていることが確認されています[11-13]。 アデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼ（AMPK）の下流エフェクターであるサーチュイン1（SIRT1）は、アディポネクチン放出の調節に重要な役割を果たすことが示唆されています[14]。 オウゴニンの補給はAMPKのリン酸化とSIRT1の発現を著しく増加させましたが、AMPKまたはSIRT1の阻害は、アディポネクチンの産生または放出に対するオウゴニンの影響を減少させました[14]。 SIRT 1-変調HMGB1脱アセチル化は、敗血症によって引き起こされる急性腎障害を抑制することが以前に報告されました[15]。
本研究では、オウゴニンの作用機序を調査することを目的とした。炎症とアポトーシスLPSによって誘発されたヒト肺上皮細胞の分析。これは、オウゴニンによるALIの治療に関するより包括的な洞察を提供する可能性があります。
結果
LPS誘導A549細胞の生存率とアポトーシスに対するオウゴニンの効果
ALIに対するオウゴニンの効果を観察するために、我々は最初に、正常なA549細胞の生存率がオウゴニンによって損傷を受ける可能性があるかどうかを推測しました。 図1Bに示すように、オウゴニンは何の処理も受けずにA549細胞に害を及ぼさず、O、5、10、および20μMの濃度でのA549細胞におけるオウゴニン処理の安全性を示唆しています。 LPSを24時間刺激した後、A549細胞の生存率は著しく損傷し、濃度依存的にオウゴニンによって打ち消されました（図1C）。 さらに、LDHアッセイの結果は、LPS処理A549細胞におけるLDH活性の有意な増加が、オウゴニンの用量を増やした後に減少したことを示しました（図1D）。 次に、LPS誘導A549細胞のアポトーシスに対するオウゴニンの効果をテストしました。 図2Aに示されているように、TUNEL染色は、LPS曝露が対照群と比較してA549細胞のアポトーシスを劇的に増強し、これは用量依存的にオウゴニンによって減少したことを示しました。 さらに、Bcl -2発現の明らかなダウンレギュレーションと、Bax、Cyto-C、および切断型カスパーゼ3発現のアップレギュレーションが、オウゴニン処理によって回復した対照群と比較した場合、LPS曝露群で観察されました（図。 2B）。 一貫して、図3に示したAO / EB二重蛍光アッセイの結果は、LPSが対照群と比較して細胞アポトーシス率の上昇をもたらしたのに対し、EB陽性細胞はLPSと比較した場合にオウゴニン添加後に著しく減少したことを示唆しましたグループ。 したがって、オウゴニンは生存率を回復し、LPSによって誘導されるA549細胞のアポトーシスを減少させます。
LPS誘導A549細胞の炎症と酸化ストレスに対するオウゴニンの効果
ALIにおけるオウゴニンの抗炎症および抗酸化能力を調査するために、炎症と酸化ストレスオウゴニンで処理されたLPS誘導A549細胞の数がそれぞれ検出されました。 図4A-Cに見られるように、RT-qPCRによって測定された炎症性サイトカイン（TNF-、IL -6、およびIL -1）のmRNAレベルは、LPS刺激時に著しく高いレベルに上昇しましたが、オウゴニンは治療はそれらの発現の減少につながりました。 一貫して、ELISAの結果は、LPS誘導が未治療群と比較してTNF-、IL -6、およびIL -1含有量の有意な増加をもたらし、これらはオウゴニン治療後に用量依存的に減少したことを示しました（図。4D-F）。 重要なことに、炎症関連マーカーであるシクロオキシゲナーゼ-2（Cox -2）およびリン酸化核因子（NF）-KB p65（p-NF-KB p65）は、LPSによってダウンレギュレーションされました。さらに、LPSはSODとGSH-Pxの活性を低下させ、MDAとROSの含有量を増加させましたが、これはオウゴニンによって逆転しました（図4H-K）。 まとめると、オウゴニンは、LPSによって誘発されたA549細胞の炎症と酸化ストレスを軽減します。
SIRT1-を介したHMGB1脱アセチル化におけるオウゴニンの調節
オウゴニンがSIRT1-を介したHMGB1脱アセチル化によってLPS誘発性A549細胞損傷に保護効果を発揮したという推測を確認するために、関与する因子のタンパク質レベルを検出するためにウエスタンブロットを実施しました。 明らかに、LPSはSIRT1の発現を抑制し、HMGB1のアセチル化とともに、HMGB1の核から細胞質への移行を促進しました。 しかし、この傾向は、LPS誘導A549細胞へのオウゴニン曝露によって逆転しました（図5）。 したがって、オウゴニン処理は、LPS誘導A549細胞におけるSIRT1-を介したHMGB1脱アセチル化を調節します。
オウゴニンで処理されたLPS誘導A549細胞の細胞挙動に対するSIRT1阻害剤EX527の調節
オウゴニンがLPS誘導A549細胞の炎症とアポトーシスに影響を与える根本的なメカニズムにおけるSIRT1の役割を検証するために、SIRT1阻害剤であるEX527を使用してLPS誘導A549細胞を24時間処理しました。 図6Aに示すように、EX527を追加すると、LPSとオウゴニンのグループと比較して、SIRT1の発現が減少し、HMGB1の核細胞質輸送が妨げられ、HMGB1の脱アセチル化が促進されました。 さらなるCCK-8およびLDHアッセイは、EX527がLPS誘導A549細胞の生存率に対するオウゴニンの回復効果を損傷したことを示しました（図6B）。 さらに、Bcl -2、Bax、Cyto-C、および切断されたカスパーゼ3の発現に対するオウゴニンの影響は、LPS誘導A549細胞のEX527によって部分的に軽減されました（図6C）。 最後に、炎症性因子（TNF-、IL -6、およびIL -1）、炎症関連タンパク質（Cox-2およびp-NF-kBp65）、およびウォゴニンとEX527で同時処理されたLPS誘導A549細胞の酸化ストレスマーカー（SOD、GSH-Px、MDA）は、EX527がLPS誘導A549細胞の炎症と酸化ストレスに対するウォゴニンの抑制効果を損なうことを示しました（図。 7A-K）。 したがって、SIRT1阻害剤EX527は、LPS誘導A549細胞の悪性表現型に対するオウゴニンの保護効果を逆転させます。
討論
現在、多くの専門家がオウゴニンを炎症性疾患の治療のための強力な薬剤として認識しています。 炎症反応の緩和におけるその有効性は、NF-kBの抑制と核因子赤血球2-関連因子2（Nrf2）シグナル伝達経路の活性化に起因すると報告されています[16]。 興味深いことに、以前の報告では、抗炎症効果がiNOSおよびCox -2の発現の媒介または活性酸素種（ROS）/ ERK/Nrf2シグナル伝達経路の活性化と関連していました[5,17]。 軟骨細胞の生存率に対するオウゴニンの影響を示さない以前の発見と一致して、正常なA549細胞に対するオウゴニンの有意な細胞毒性効果は事実上見られず、オウゴニンがinvitroALI細胞モデルに影響を与える根本的なメカニズムのさらなる調査をサポートします[17]。 酸化ストレスと炎症はALの病因における2つの主要な特徴であり、したがって、ウォゴニン治療時の酸化ストレス指標と炎症性サイトカインの変化を検出しました[18]。 興味深いことに、炎症誘発性因子の放出の遮断とSODおよびGSH-Pxの産生の増強、およびその後のMDAの産生の減少によって証明されるように、炎症と酸化ストレスは両方ともLPS処理A549細胞モデルにおけるウォゴニン曝露によって軽減されました。ウォゴニン治療HMGB1は、マウスモデルで敗血症を調節することが最初に同定された高度に保存されたタンパク質として出現します[19]。 長期の炎症反応として現れた患者が頻繁に高いHMGB1レベルを示したという事実のために、HMGB1を標的とすることは敗血症の治療のための潜在的な治療オプションと考えられました[10]。 最近の報告とレビューは、敗血症に限らず、炎症性疾患に対するHMGB1の治療効果に多くの注意を払っています。 たとえば、ウリナスタチンによるHMGB1の阻害は、マウスのLPS誘発性ALI損傷を改善することが以前に実証されました[10,20]。 活性化された単球/マクロファージから放出された後、HMGB1はさまざまな刺激物を介して炎症誘発性因子として機能しました[20]。 LPSのような炎症性シグナルは、HMGB1の核から細胞質へのアセチル化関連の転座を促す可能性があります[21]。 ここで、LPS刺激による核から細胞質へのHMGB1の移行がオウゴニン治療によって打ち消されたという発見は、LPSによって引き起こされたA549細胞の炎症がオウゴニンによって強力に妨げられたことを間接的に解明した。
SIRT1は、さまざまな生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たすことが示唆されています[22]。 その脱アセチル化標的に応じて、SIRT1の活性の変化は酸化ストレスと炎症に関係していると予想されました[23]。 HMGB1は最近SIRT1の脱アセチル化標的として認識されました[20]。 実質的な証拠は、HMGB1のSIRT 1-変調脱アセチル化が炎症を軽減し、腎機能を回復し、敗血症関連の急性腎障害のあるマウスの生存期間を延長したことを示しました[15]。 実験的な外傷性脳損傷の研究では、オメガ-3多価不飽和脂肪酸は、HMGB1/NF-KB経路のSIRT1-調節脱アセチル化を介してミクログリア分極を調節することにより炎症を軽減しました[24]。 さらに、オレアノール酸は、SIRT1-調節されたHMGB1脱アセチル化によってラットモデルがくも膜下出血を防ぐ[25]。 SIRT1の活性化を介したアロインによるNLRP3/NF-kBの阻害は、マウスのLPSチャレンジALIを弱めました[26]。 SIRT1 / HMGB1 / NF-KBシグナル伝達を調節することにより、ケンフェロールは、抗炎症および抗酸化ストレスを介した虚血再灌流によって誘発される肺損傷を改善しました27I。 HMGB1の下流の重要な分子として、NF-kBは、炎症誘発性因子遺伝子を活性化し、TNF-、IL -6、およびTNFを含む多数の炎症性因子を放出することによって炎症性メディエーターの調節に関与する主要なシグナル伝達経路です。 -a [28,29]。さらに、NF-KBは、ROSの産生を調節し、SOD、MDA、およびGSH-Pxのレベルに影響を与えることによって酸化ストレスプロセスにも関与します[30]。ウォゴニン添加後にp-NF-kBp65発現の低下が観察され、SIRT1阻害剤であるEX527によって回復しました。 さらに、オウゴニンによる脱アセチル化HMGB1には活性化SIRT1発現が伴うことを発見しました。これにより、オウゴニンがSIRT1-を介したHMGB1脱アセチル化によるA549細胞のLPS誘発性炎症に対して保護効果を発揮する可能性があると推測されました。 以下の実験でのEX527の使用は、SIRT1の阻害がLPS誘導A549細胞の炎症に対するオウゴニンの保護効果を逆転させることをさらに実証しました。
結論
結論として、オウゴニンがLPS誘発ALI細胞モデルの炎症、酸化ストレス、およびアポトーシスを軽減することを実証しました。 この作用機序は、オウゴニンによって引き起こされるSIRT1-を介したHMGB1の脱アセチル化の調節によるものと思われました。 これらの発見は、オウゴニンがALIに保護効果を及ぼす新しいメカニズムを特定し、ALIの臨床治療へのオウゴニンの適用の実験的基礎を提供する可能性があります。
材料および方法
細胞培養と薬物
Human lung epithelial cells(A549) were purchased from the Cell Bank of Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology at the Chinese Academy of Sciences (Shanghai, China) and cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Gibco, Paisley, UK) containing 10% heat-inactivated fetal bovine serum(Gibco, Paisley, UK), 100 U/ml penicillin, and 100 g/ml streptomycin at 37 ℃ with 5% CO. The cells were collected after 10 μg/mL LPS（Sigma Chemical Co., St Louis, MO）stimulation for 24 h. Wogonin (purity>Scutellaria baicalensis Georgiから分離された99％）は、Biotic Chemical（Taipei、Taiwan）から購入しました。 それをジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、-20℃で保存し、DMEMで希釈しました。 SIRT1阻害剤EX527（10μM; 以前の研究[31]によると、MedChemExpress（中国、上海）を使用して、投与前に24時間細胞を処理しました。
細胞計数キット-8（CCK -8）アッセイ
LPSを24時間刺激し、さまざまな濃度のウォゴニンにさらに4時間曝露した後、細胞を96-ウェルプレートに播種し、10μLのCCK -8試薬（Dojindo 、熊本、日本）各ウェルに37度で4時間。 マイクロプレートリーダー（Bio-Rad Laboratories、Inc.）を使用して、450nmでの吸光度をモニターしました。
乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）放出アッセイ
オウゴニンで処理した細胞上清を96-ウェル培養プレートに播種し、5％COで37度で24時間インキュベートした後、100μLの細胞毒性検出キットLDH溶液（Roche Diagnostics、フランス）をそれぞれに添加しました。よく.15分後、細胞上清を希釈し、光学密度値を450nmでモニターしました。
末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを介したニックエンドラベリング（TUNEL）染色TUNELアッセイを実施し、手術に基づいて比色TUNELアポトーシスアッセイキット（Beyotime、上海、中国）によるウォゴニン処理の有無にかかわらずLPS誘導A549細胞のアポトーシスを評価しましたガイドライン。 リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄し、4％パラホルムアルデヒドで0。5時間固定した後、0。3％過酸化水素を含むPBSを使用して、細胞を室温でさらに20分間インキュベートしました。 次に、細胞をジアミノベンゼン（DAB）で10分間処理し、ヘマトキシリン（Solarbio、北京、中国）で30秒間対比染色しました。 アポトーシス陽性細胞を蛍光顕微鏡（オリンパスコーポレーション）で観察し、アポトーシス率をImage-Jソフトウェア（NIH、ベセスダ、メリーランド州、米国）で認定しました。
アクリジンオレンジ/エチジウムブロマイド二重染色
細胞アポトーシスの変化を評価するために、アクリジンオレンジ/臭化エチジウム（AO / EB）二重蛍光アッセイを実施しました。 簡単に説明すると、A549細胞は24-ウェルプレートのガラスカバースリップ上で増殖させました。 細胞を無血清培地で24時間プレインキュベートし、次にLPSおよびさまざまな濃度のオウゴニンと37℃でインキュベートしました。 細胞をPBSで洗浄し、5μLのAO / EB混合溶液（100 ug/mlのAOと100ug/ mlのEBをPBSに混合、アラジン、中国）で3分以内に供給しました。 細胞を観察し、蛍光顕微鏡（オリンパス株式会社）の下で励起波長510nmで写真を撮った。
ウエスタンブロット分析
RIPA溶解バッファー（Beyotime、上海、中国）を使用してA549細胞からタンパク質を抽出し、タンパク質の濃度をビシンコニン酸（BCA）タンパク質アッセイキット（Thermo Fisher Scientific、米国）で測定しました。 その後、10％ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）電気泳動を行って40 ugのタンパク質を分離し、タンパク質をポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜に転写しました。 次に、これらのメンブレンを脱脂乳でブロックし、一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートしました。 その後、HRP標識二次抗体を使用して、メンブレンを室温で1.5時間インキュベートしました。 最後に、バンドは、強化された化学発光（ECL）キット（Amersham Biosciences、バッキンガムシャー、英国）によって視覚化され、バンド強度はImage-Jソフトウェア（NIH、ベセスダ、メリーランド、米国）を使用して監視されました。 GAPDHは内部参照と見なされました。
逆転写定量PCR（RT-gPCR）
全RNAを抽出するために、A549細胞を1mlのTRIzol試薬（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）で溶解しました。 全RNAを回収した後、PrimeScript RT試薬キット（タカラバイオ株式会社）により、相補DNA（cDNA）合成の逆転写を行いました。条件は、50℃で15分、85℃で5秒、 SYBR Premix Ex Taq TM（TaKaRa、Japan）を使用して、メーカーの提案に基づいてPCR反応条件と反応システムを設定しました。 ABI 7500機器（AB -4351107; Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific、Inc.）をqPCRに使用しました。 以下のサーモサイクリング条件を使用しました。95度で10分間の初期変性。 その後、95℃で15秒間の変性と60度で1分間のアニーリングを40サイクル行います。 そして、72℃で10分の最終延長。GAPDHは、相対的な遺伝子発現の正規化コントロールとして受け入れられました。 相対的な遺伝子発現の計算は、2-AAct法によって行われました。
酵素免疫測定法（ELISA）
細胞上清中のインターロイキン-6（IL -6）、IL -1、および腫瘍壊死因子-（TNF-）の細胞レベルは、IL-6ELISAキットを使用して測定されました。 、IL -1 ELISAキット、および製造元（Shanghai Xi Tang Biotechnology、上海、中国）の提案に基づくTNF-ELISAキット。
酸化ストレスの検出
酸化ストレスの検出では、マロンジアルデヒド（MDA）、活性酸素種（ROS）、グルタチオンペルオキシダーゼ（GSH-Px）、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）などの酸化ストレスマーカーの活性を製造元の指示に従って検出しました（Nanjing Jiancheng Biotechnology研究所、中国）。
統計分析
すべてのデータは、少なくとも3回の独立した実験の平均±標準偏差（SD）として示されました。 複数のグループ間の比較のために、Tukeyの事後検定による一元配置分散分析（ANOVA）が実行され、2つのグループ間の比較はStudentのt検定によって実行されました。 P<0.05 was="" deemed="" as="" statistically="">
略語
AL：急性肺損傷; LPS：リポ多糖; HMGB1：高移動度グループボックス1タンパク質; PPARy。 ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体-ガンマ; MAPK：マイトジェン活性化プロテインキナーゼ; JNK：C-Jun NH（2）末端キナーゼ; CLP：盲腸結紮および穿刺; DMEM：ダルベッコの改良イーグル培地。 DMSO：ジメチルスルホキシド; CCK -8：細胞カウントキット-8; LDH：乳酸デヒドロゲナーゼ; TUNEL：末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを介したニックエンドラベリング。 PBS：リン酸緩衝生理食塩水; DAB：ジアミノベンゼン; AO / EB：アクリジンオレンジ/エチジウムブロマイド; BCA：ビシンコニン酸; SDS-PAGE：ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動; PVDF：ポリフッ化ビニリデン; ECL：強化された化学発光; cDNA：相補的DNA; ELSA：酵素免疫測定法; IL：インターロイキン; TNF-a：腫瘍壊死因子-a; MDA：マロンジアルデヒド; GSH-Pxグルタチオンペルオキシダーゼ; SOD：スーパーオキシドジスムターゼ; SD：標準偏差; ANOVA：分散分析; Cox -2：シクロオキシゲナーゼ-2; Nrf2：核因子赤血球2-関連因子2; ROS：活性酸素種。
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