グルココルチコイド誘発ラットモデルにおけるカンクイとその酒蒸し製品の神経内分泌免疫機能に関する研究-Ⅱ

3.2.4.免疫組織化学

ニューロンのアポトーシスは、多くのアポトーシス遺伝子と抗アポトーシス遺伝子、主にアポトーシス促進遺伝子 Bax と Bcl-2 遺伝子ファミリーの抗アポトーシス遺伝子によって制御されます。 Bcl-2 は、ミトコンドリア、小胞体、核膜などの活性酸素を生成する細胞小器官に局在しています。 Bcl-2 は酸素フリーラジカルにはほとんど影響を与えませんが、細胞の酸化損傷を防ぐ。 Bax は細胞質からミトコンドリア膜に輸送し、ミトコンドリア膜の構造を変化させ、シトクロム c の放出とアポトーシスの誘導を促進します。

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副腎細胞質では、Bax および Bcl-2 タンパク質の発現が見られました。染色ではすべて黄色の粒子が示されました。 BC グループと比較して、MC グループの Bax タンパク質の平均光学密度は大幅に増加しました (P< 0.01). Compared to that of the MC group, the average optical density in the CD-LD and WCD-LD groups decreased significantly (P < 0.01) (Figure 5(a)).

図 5(b) は、BC グループと比較して、MC グループの Bcl-2 タンパク質の平均光学密度が大幅に減少したことを示しています (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density in the WCD-HD and CD-HD groups increased significantly (P < 0.01), while those of the WCD-MD and CD-MD groups increased (P < 0.05).

カスパーゼ-3タンパク質は、正常組織では元の形で主に細胞質に局在しており、発現は低いです。陽性シグナルは淡黄色または茶色がかった黄色です。 BC グループと比較して、MC グループのカスパーゼ-3の発現は有意に増加しました (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the expression of caspase-3 in the WCD-HD and WCD-MD groups increased (P < 0.05) (Figure 5(c)).

正常組織では、Fas 遺伝子の発現が減少し、in situ ハイブリダイゼーションの陽性シグナルは茶色がかった黄色でした。図 5(d) に示すように、BC グループと比較して、MC グループの Fas タンパク質の平均光学密度は増加しました (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density in the WCD-HD and WCD-LD groups improved (P < 0.05) (Figure 5(d)).

FasL タンパク質は主に細胞膜または細胞質に存在し、その陽性シグナルは茶色です。 BC グループと比較して、MC グループの FasL 遺伝子の平均光学密度は有意に増加しました (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density of the FasL gene in the WCD-HD, WCD-MD, CDHD, and CD-MD groups increased significantly (P < 0.01) (Figure 5(e)).

結果は、CD と WCD が可能であることを示しました。炎症細胞にアポトーシスを誘導するFasLタンパク質の発現を促進し、Fasタンパク質に結合し、カスパーゼ-3タンパク質を活性化してカスパーゼカスケードを引き起こすことにより、副腎損傷を軽減します。 WCD-HDグループの効果が一番良かったです。

3.3.免疫機能の決定

3.3.1.免疫器官指数

BC グループと比較して、MC グループの胸腺係数と脾臓指数は有意に減少しました (P< 0.01). Compared to the MC group, the WCD-MD group had the greatest difference (P < 0.05). The thymus coefficient was almost back to the normal level. For the spleen index, the WCDMD, WCD-LD, and CD-MD groups showed significant differences compared with that of the MC group (P < 0.01) (see Figure 6). Therefore, WCD and CD treatment could protect the immune organs, and the effects of WCD were better. 

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3.3.2.末梢血中の T リンパ球サブセットの検出

BC群および各薬物群における左上象限のCD4+細胞および右下象限のCD8+細胞の割合は、MC群よりも高かった。 BC グループと比較して、MC グループでは CD4+ThCD8+ の比率が大幅に減少しました (P< 0.01). Compared to that of the MC group, the ratio of CD4+ThCD8+ increased significantly in the PC group, the WCD group, and the CD-HD group (P < 0.01) (Figure 7).

3.3.3.血清中のIL-10、IL-6、IL-2、TNF-α、およびIFN-Cのレベルの測定

図 8 は、BC グループと比較して、IL-6、TNF-α、および IFN-c のレベルが大幅に増加したことを示しています (P< 0.01). The level of IL-10 and IL-2 decreased in the MC group. Compared to that of the MC group, the level of IL-6, TNF-α, and IFN-c decreased and IL-10 and IL-2 increased in serum in each of the drug groups. The effect of WCD was better than the effect of CD, especially in the WCD-MD group, in which the effect was close to that of the PC group.

3.3.4.ライマス組織顕微鏡観察実験の結果

図 9 は、BC グループに多数のリンパ球が存在することを示しています。リンパ球と網状赤血球が中心に緩やかに配置され、円形または楕円形の胸腺細胞が散在していました。壊死、炎症細胞浸潤、および異常な変化はありませんでした。

MC グループでは、中心にリンパ球と網赤血球が不規則に配置された、大量のリンパ系壊死組織が見られました。円形または楕円形の胸腺細胞が消失し、大量の細胞変性または壊死が明らかであり、異常な病理学的変化を伴う炎症性細胞浸潤が存在しました。

CD グループでは、リンパ球の形態的特徴は正常に戻り、中心リンパ球と網状赤血球の配置はほぼ正常でした。円形または楕円形の胸腺細胞は回復しましたが、少数の変性または壊死リンパ球および浸潤性炎症細胞が残存していました。

WCD グループと PC グループでは、リンパ球の形態学的特徴がよりよく修復されました。中心のリンパ球と網状赤血球はよく整列しており、円形または楕円形の胸腺細胞はほぼ正常でしたが、少数の浸潤性および変性リンパ球が残っていました。

3.4. CaMタンパク質遺伝子発現

CaM mRNAの発現を調べるためにRQ値(CaM mRNA -actin mRNA)を考慮した。 BC 群の RQ は 1 でした。MC 群の視床下部における CaM mRNA の発現は有意に増加しました (P< 0.01), while the value decreased in the WCD-HD, WCD-MD, WCDLD, and CD-HD groups (P < 0.05) (Figure 10). The expression of CaM mRNA in the hypophysis in the MC group was lower than that in the BC group (P < 0.01). The expression in the WCD-HD, WCD-MD, WCD-LD, CD-HD, and CD-LD groups increased (P < 0.05), and the effect in the WCD groups was better than the effect in the CD groups.

4. ディスカッション

中国薬局方 [2] には、CD と WCD が主な煎じ薬として臨床で使用できると記録されています。酒で蒸した後、老化防止と腎陽の強壮効果強化されました。 UPLC-QqQ-MS により、酒蒸し過程における化学物質ベースの定量的変化を検出しました。イリドイド配糖体は不安定であり、これらの配糖体の含有量は減少し、検出できなくなることさえありました。フェニルエタノール配糖体の含有量も変化し、薬力学や臨床効果の変化を引き起こす可能性があります。

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古典的な腎臓陽欠乏症モデルは、コルチコステロンの皮下注射によって再現されました [19]。コルチコステロンの過剰摂取は、視床下部の CRH の秘密を阻害する可能性があります。一方、ACTHの秘密も阻害されました。副腎皮質ホルモンのレベルが低下し、HPA 軸の機能が低下しました。 HPA 軸の機能低下は、腎陽欠乏症の一般的な特徴です [20]。その後、ラットは「枯渇」現象を示し、その症状は臨床での腎臓陽欠乏症の症状と一致します。

MC グループでは、ラット血清中の CRH、ACTH、T、および CORT のレベルが有意に減少しました (P< 0.01). After being treated by CD and WCD, the content of CRH, ACTH, T, CORT, and cortisol all increased to some degree, and the effect of WCD-MD was the best, almost equal to that in the PC group. These results indicated that the relative hormone balance in the HPA axis had been destroyed in the MC group, CD and WCD could improve the functional recovery of abnormal adrenal axis hormone levels, but the effect of WCD was better.

Bcl-2 ファミリーメンバーの割合の調節は、FasThFasL がデスレセプター経路を媒介する中心的な機構の 1 つであり、Bcl-2 ファミリーはミトコンドリア経路を調節します [21]。アポトーシス阻害因子Bcl-2およびBaxなどのアポトーシス誘導因子はすべてBcl-2ファミリーに属します[22]。細胞のアポトーシスは、アポトーシス阻害因子とアポトーシス誘導因子の相対比によって決定される可能性があります[23]。ミトコンドリアは、多くの形態のアポトーシスに対する中心的なチェックポイントの機能を持っています [24]。本研究は、CD-MD と WCD が Bax の発現を推定し、Bcl-2 を増加させることができることを示しました。腎臓陽欠乏症を改善する。 Fas は、Fas リガンド (FasL) とのライゲーションによってアポトーシスを誘導する主要なデスレセプターです [25]。 MC グループでは Fas および FasL の発現が増加しましたが、この発現は WCD-MD グループで有意に増加しました (P< 0.01) compared with the MC group. Both FasThFasL and BaxThBcl-2 systems transduce apoptotic signals to the caspase family [26]. Caspase-3 is one of the pivotal proteinases that initiate cell apoptosis. The activation of caspase-3 indicates that apoptosis enters an irreversible stage [27]. The expression of caspase-3 in the MC group increased and increased significantly in the WCD-HD and WCD-MD groups (P < 0.05).

免疫機能の欠乏は、腎陽欠乏の重要な症状の 1 つです [28]。この研究では、WCD-MD グループの脾臓と胸腺の指数が大幅に回復したことがわかりました (P< 0.01, P < 0.05). The immune response of the immune system is regulated mainly by the Th subgroups [29]. IL-2 is the growth factor for T cells, secreted by T cells and macrophages, participates in inflammatory regulation, regulates immunity, and increases infection resistance [30]. The level of IL-2 in the MC group decreased (P < 0.01), and after treatment with CD and WCD, the level of IL-2 recovered. IL-6 and TNF-α are proinflammatory cytokines. Increased levels of IL-6 and TNF-α cytokines cause cytokine imbalances and exacerbate inflammation. The levels of IL-6 and TNF-α increased in the MC group, while after treatment, the levels of IL-6 and TNF-α decreased. T cells are divided into CD4 cells and CD8 cells, and the CD4+ThCD8+ ratio can be used as an important index of immune regulation [31]. CD4+ThCD8+ in the MC group decreased (P < 0.01), while in the WCD and CDHD groups increased (P < 0.01).

HPA 軸は、副腎皮質の分泌機能を維持するために糖質コルチコイド分泌と内分泌系を調節するため、最も重要な調節系です [32]。視床下部組織におけるCaM mRNAの過剰発現は、腎臓の陽の欠乏と関連していた。 CDおよびWCDはカルシウムチャネルを遮断し、視床下部におけるCaM mRNA発現を阻害し、カルシウム流入を減少させ、したがってCa2+・CaM複合体の活性を低下させる可能性がある。

腎臓陽欠乏症の形成は慢性疾患の進行過程です。腎臓はもはや純粋な解剖学的概念ではなく、神経内分泌免疫および泌尿生殖器系の総称です。神経内分泌免疫 (NEI) ネットワークは重要な統合制御システムです [33]。 CD と WCD は HPAT 軸の機能を調節し、腎陽欠乏症の回復を改善します。この結果は、腎陽欠乏症の臨床予防と治療の実験的根拠を提供します。

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