グルココルチコイド誘発ラットモデルにおけるカンクイとその酒蒸し製品の神経内分泌免疫機能に関する研究-Ⅰ
Aug 16, 2024
1. はじめに
カンクイ「砂漠人参」と呼ばれるこの植物は、何世紀にもわたって健康のための陽強壮ハーブとして使用されてきた伝統的な漢方薬です。腎臓を元気にし、陽を強化します。[1]。 8種と1バリエーションシスタンケ・ヘルバ 中国でのみ録音されているカンクイYCマさんとカンクイ(Schenk) Wight は中国薬局方に記録されています [2]。薬理学的研究により、カンサス・ヘルバ神経保護作用 [3]、免疫調節作用 [4]、心臓保護作用 [5]、抗疲労作用 [6]、抗炎症作用 [7]、肝保護作用 [8]、抗酸化作用 [9]、抗菌作用 [10]、下剤 [11]、および抗腫瘍作用を示した。効果[12]。この属の広範囲にわたる生物活性が報告されているのは、その複雑で多様な植物化学組成に起因していると考えられています。カンクイフェニルエタノール配糖体、イリドイド、多糖類[13]などが含まれています。フェニルエタノイド配糖体の含有量は、元の医薬品原料の中で最も多くなっています[14]。
腎臓を活性化する天然キスタンケ チューブローサ PHGS75% ECH 30% ACT 12%
中国マテリアメディカの加工（CMM）は、伝統的な中国医学の理論に従って治療、調剤、調製のさまざまな要件を満たすための伝統的な製薬技術です。それらの加工品は煎じ片と呼ばれ、クリニックなどで使用されています。加工は生薬の毒性を軽減する効果を高めることを目的としています。 2015年の中国薬局方には、カンクの厚切り（CD）と米酒で蒸したカンク（WCD）が診療所で煎じ薬として使用できると記録されています。私たちの研究グループは、シスタンシュを米酒で蒸した後、下剤効果が緩和され、老化防止効果と腎臓陽を元気にする効果が強化されたことを示しました[15]。
腎陽欠乏症候群では、視床下部-下垂体-副腎-胸腺（HPAT）軸の機能が障害されます[16]。腎陽欠乏症の患者は、広範囲の免疫機能不全も抱えています。 HPA軸の機能不全は免疫不全と密接に関係しています。神経内分泌-免疫ネットワーク(NEI)理論は、免疫系と神経内分泌系が多くのリガンドと受容体を共有していることを示しており[17]、視床下部は神経内分泌と免疫系を結び付ける要であると考えられている。
この研究では、外因性コルチコステロイド注射によりモデルラットの腎臓陽欠乏症を再現し、内分泌免疫機能の観点からカンクサのさまざまな加工品に反応する腎臓陽欠乏症のメカニズムを調査しました。
2. 材料と方法
2.1.材料と試薬
カンクサは、2019年5月に阿拉山内蒙谷から収集され、Yanjun Zhai教授（中国、遼寧中医薬大学薬学部）によってカンクンケ・デスティコーラYC Maの乾燥した多肉質の茎であると特定されました。バウチャーの標本は、遼寧省加工工程技術センターに保管されていた。
アジュゴールの標準化合物は成都純化化学標準有限公司（中国成都）から購入しました。シスタノシドF、エキナコシド、シスタノシド A、イソアクテオシドMust Company (中国四川省) から購入しました。アクテオシドは、Dalian Meilun Bio から購入しました。株式会社（中国、大連）。 MS グレードのアセトニトリルとメタノールは Merck KGaA (ダルムシュタット、ドイツ) から購入しました。 HPLC グレードのギ酸は Merck KGaA (ドイツ、ダルムシュタット) から購入しました。米酒は浙江ブランドタワー紹興酒有限公司（中国浙江省）から購入しました。
コルチコステロン (CAS: 50-22-6、純度 > 98%、TCI Shanghai Development Ltd. Co.)、チンクエイシンチューワン丸薬 (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.)、ラット ACTH、CRH、T、IL{{ 2}}、IFN-c、TNF-α、IL-2、および IL-10 ELISA 検出キットは Nanjing Jiancheng Co., Ltd. から購入しました。ラット コルチゾール ELISA キットは BOSK Co., Ltd. から提供されました。ラット CD4 抗体、CD8a 抗体 (番号 561833 および 559976)、RBC ライセート (Solarbio、R1010)、PBS 緩衝液 (Solarbio、P1020-500)、TRIzol (MAN0001271)、CaM、および -actin 上流および下流プライマー逆転写キット (番号 RR037A) および cDNA 合成キット (番号 10000068167) は、Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. から提供されました。 クロロホルム、イソプロパノール、75% エタノール、およびウレタン溶液はすべて分析的に純粋で、Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.によって製造されました。超純水は Milli-Q システム (18.2 MΩ、Millipore、MA、USA) によって製造されました。
2.2.実験器具
酵素マーカー (Thermo、モデル 3530911931)、自動プレート洗浄機 (モデル HBS- 4009)、デジタル表示プッシュプル力計 (モデル VICTOR- 50N)、高速凍結遠心機 (モデル Sigma 3k15) ）、極微分光光度計（モデル B-50Q）、遺伝子アンプ（モデル L96G）、リアルタイム蛍光定量 PCR（モデル StepOne）、フローサイトメーター（モデル AC66051710132）、パラフィンミクロトーム（モデル Laika）、顕微鏡（オリンパス） 、モデルBS-53）および純水装置（モデルF7JA36507）を使用しました。
2.3. UPLC-Q-TOF-MS および薬理学的実験用のサンプルの調製
WCD は同じバッチから処理されました。カンクイ私たちの研究室では。 WCD の調製では、乾燥した CD 片 (厚さ 5 mm) (100 g) に米酒 (30 mL) を注入し、高圧 (1.25 kPa) で 4 時間蒸し、その後 55 度で乾燥しました。
CDとWCDの粗粉末を10倍の95%エタノールに0.5時間浸漬し、1時間ずつ3回還流抽出し、濾過し、3回の濾液を合わせた。エタノールを減圧下で回収し、抽出液を得て投与した。抽出物 (1 mL) を 50% メタノールに加えて全量を 20 mL にし、含有量分析のために 4 度で保存しました。
性機能を改善するための天然シスタンケ チューブローサ PHGS75% ECH 30% ACT 12%
2.4. CD および WCD 抽出物の分析のための UPLC-QqQ-MS 条件
2.4.1. LCThMS 分析条件
MassLynx 4.1 Analyst ソフトウェアを備えた UPLC-MSThMS システムを使用して、データの取得と処理を実行しました。分析カラムは、温度 40 ℃の Acquity UPLC BEH C18 (1{{10}}0 mm × 2.1 mm、1.7 μm) でした。移動相｛｛５９｝．１％ギ酸水溶液（Ａ）と０．１％ギ酸を含むアセトニトリル（Ｂ）であった。溶出勾配は、3% B の場合は 0.00-1.00 分、3%-11.5% B の場合は 1.01-2.00 分、2.01-3.{{29 12% B で }} 分、15% B で 3.01–4.00 分、20% B で 4.01–5.00 分、22% で 5.01–6.00 分% B、6.01–8.00 分（25% B の場合）、8.01–9.00 分（10% B の場合）。流量は 0.3 mLTh 分、注入量は 1.0 μL でした。
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源を備えたＷａｔｅｒｓ三連四重極質量分析計（Ｘｅｖｏ ＴＱＤ、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．、米国マサチューセッツ州ミルフォード）を陰イオンモードで使用した。脱溶媒和ガスは、温度 250 度、流量 500 LThh の窒素でした。検出されたすべての化合物は多重反応モニタリング (MRM) モードで測定されました。表 1 はエネルギーパラメータを示し、表 2 は分析された成分の検量線を示します。
2.4.2.標準物質の調製
チューブロシド A (3.02 mg)、エキナコシド (3.00 mg)、2'-アセチルラクテオシド (2.34 mg)、アクテオシド (2.45 mg)、イソアクテオシド (0.61 mg)、シスタノシド F ( ２．１４ｍｇ）、サリドロシド（３．３９ｍｇ）、ゲニポシド酸（２．８４ｍｇ）、アジュゴール（１．５８ｍｇ）、およびカタルポール（２．３９ｍｇ）をメタノールに溶解してストック溶液を調製した。保存溶液をメタノールで希釈して、作業標準溶液に適切な濃度を得ました。調製した溶液はすべて、使用前に 4 度で保管しました。
2.5.動物モデルの準備とグループ化
SD 雄ラット (180 ～ 220 g) は、Liaoning Changsheng Biotechnological Co.、動物許可番号: SCXK (Liao) 2015-0001 から購入しました。すべてのラットは、25 度、相対湿度 30 ～ 50% で、餌と水を自由に摂取できる状態で維持されました。動物は実験前に７日間飼育された。
100匹のラットをランダムに10グループに分けた:ブランクコントロール(BC)グループ、モデルコントロール(MC)グループ、ポジティブコントロール(PC)グループ、ライスワインコントロール(WC)グループ、CD高用量(CD) -HD）群、CD中用量（CD-MD）群、CD低用量（CD-LD）群、WCD高用量（WCD-HD）群、WCD中用量（WCD-MD）群、およびWCD 低用量 (WCD-LD) グループ。 CD-HDThWCD-HD、CD-MDTh WCD-MD、CD-LDThWCD-LDの用量は、それぞれ5.48 gTh(kg・d)、2.74 gTh(kg・d)、1.37 gTh(kg・d)でした。 PC グループの用量は 1.646 gTh(kg・日)、WC グループの場合は 1 mLTh100 g (40 日間) でした。投与後6日目に、ラットにコルチコステロン水懸濁液（コルチコステロン+ 0.1%ジメチルスルホキシド+ 0.1% Tween-80 + 0.9%塩化ナトリウム）を皮下注射した。 BC グループの場合 [18]。コルチコステロンの濃度は5gThL、用量は0.1mLTh100gであった。 BC群のラットには生理食塩水+ 0.1%ジメチルスルホキシド+ 0.1%トゥイーン- 80 + 0.9%塩化ナトリウムを同じ用量で注射した。
2.6. HPA 軸機能の決定
2.6.1.重量、温度、保持力のテスト
体重検査は 3 日ごとに、体温は 6 日ごとに測定されました。実験中。 ３９日目に、後肢の最大筋力をグリップメーターで測定した。ラットを滑らかな台の上に置き、後肢でポールを掴ませた。ラットは、引っ張る力がグリップを超えるまで尻尾を引っ張ると、本能的にあらゆる物体を掴んで後退を防ぎます。ラットが握力を失ったとき、プリアンプは最大握力を自動的に記録できます。
2.6.2.血清中の T、CRH、ACTH、CORT、およびコルチゾールのレベルの測定
最後の投与の１時間後、ウレタン溶液（２０ｇＴｈ１００ｍＬ）の腹腔内注射によりラットを麻酔した。次に、血液サンプルを収集し、3500 r で 15 分間遠心分離して血清を得、-20 度で保存しました。 T、CRH、ACTH、CORT、およびコルチゾールの濃度は、製造業者の指示に従ってラットELISAキットを使用して測定されました。
2.6.3.顕微鏡観察
副腎組織の形態構造をHE染色により観察した。副腎組織を10％パラホルムアルデヒドで固定し、エタノールで脱水し、キシレン溶液で透明にし、従来の方法で包埋し、厚さ4μmのスライスに切断し、キシレン溶液で脱蝋し、エタノール勾配で水和し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。染色液。キシレンで透明にした後、中性ガムでシールし、顕微鏡で観察した。
2.6.4.副腎における Bax、Bcl-2、Caspase-3、Fas、および FasL タンパク質発現の免疫組織化学的染色
ホルマリン固定し、パラフィン包埋したラット副腎切片を、厚さ 4 μm に切断した後、脱パラフィンおよび再水和した。内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックするために、切片を過酸化水素ブロック中で 10 分間プレインキュベートしました。切片を0.01 M クエン酸塩 (pH 6.0) に浸し、沸騰するまで加熱しました。このプロセスを 5 ～ 10 分後に繰り返しました。冷却後、切片を PBS (pH 7.2 ～ 7.6) で 1 ～ 2 回洗浄し、室温で約 5 分間放置し、PBS (pH 7.2 ～ 7.6) で 2 ～ 3 回洗浄しました。 5% BSA ブロッキング溶液を室温で加え、20 分後に切片上の余分な液体を振り落としました。 FasTh FasL、Bcl-2ThBax、およびカスパーゼ-3に特異的な希釈一次抗体（PBSで1:100に希釈）を加え、37度で1時間または4度で一晩インキュベートしました。切片を PBS (pH 7.2 ～ 7.6) で 2 ～ 3 回洗浄しました。次に、ビオチン化ヤギ抗マウス IgG を添加し、切片を 20 ～ 37 度で 20 分間乾燥させ、PBS (pH 7.2 ～ 7.6) で 5 分間 4 回洗浄しました。 PBS で十分に洗浄した後、切片を試薬 A と B の混合物で 30 分間インキュベートし、PBS で 45 分間インキュベートし、最後に DAB 基質 (DAKO) で 30 分間発色させた後、ヘマトキシリンでわずかに対比染色し、脱水し、そして取り付けられました。
性的感覚を高める天然シスタンケ チューブローサ PHGS75% ECH 30% ACT 12%
2.7.免疫機能の決定
2.7.1.免疫臓器指数の計算
最後の投与の１時間後、ラットをウレタン溶液（２０ｇＴｈ１００ｍＬ）の腹腔内注射により麻酔し、次いで脾臓および胸腺を摘出し、滅菌フード内で直ちに重量を測定した。脾臓または胸腺の重量係数 (%) ± 脾臓または胸腺の重量 (mg) 体重 (g)。
2.7.2.末梢血中の T リンパ球サブセットの検出
脾細胞および血球をモノクローナル抗体抗CD4 (PE) および抗CD8 (FITC) とともに暗所で30分間インキュベートしました。 2 mLの赤血球溶解物を加え、溶液をボルテックスすることにより混合した。溶液を暗所に10分間放置し、5分間遠心分離した。上清を捨て、次いで溶液を氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ透過化溶液に再懸濁した。各Mab染色から1時間以内に、少なくとも10個の000細胞をフローサイトメトリーで分析しました。
2.7.3.血清中のIL-10、IL-6、IL-2、TNF-c、およびIFN-cレベルの測定
最後の投与の１時間後、ウレタン溶液（２０ｇＴｈ１００ｍＬ）の腹腔内注射によりラットを麻酔し、腹部大動脈から採血した。血液を3500rで15分間遠心分離して血清を得て、-20度で保存した。 IL-10、IL-6、IL-2、TNF-β、およびIFN-cの濃度は、製造業者の指示に従ってラットELISAキットを使用して検出した。
2.8.視床下部および下垂体組織における CaM の発現
全RNAを視床下部および下垂体組織からTRIzolによって抽出した。メーカーの指示に従って、10μLのトータルRNAに対して逆転写を実施した。等量の cDNA を、dsDNA 結合色素 (Promega、米国) および CFX 96 リアルタイム PCR システム (Bio-Rad、米国) の存在下で qPCR によって分析し、初期活性化の条件下でさまざまな遺伝子を調べました。 95度で10分間、95度で15秒間の変性、60度で1分間のアニーリング伸長を40サイクル。
CaM および -actin のプライマーを表 1 に示し、-actin を内部対照として使用しました。各サンプルは、標的遺伝子とアクチン間の臨界閾値 (Ct) の差を使用して正規化されました。次の方程式を使用して結果を説明しました: ΔΔCt �� (Ct 標的遺伝子 - Ct - アクチン遺伝子) 実験グループ - (Ct 標的遺伝子 - Ct - アクチン遺伝子) 対照グループ。次に、式 2- ΔΔCt 標的遺伝子を使用して、各サンプルの mRNA レベルを比較しました。各グループの結果を平均した(表3)。
2.9.統計分析
すべてのデータは、SPSS ソフトウェア (バージョン 19.0、SPSS Institute Inc.、シカゴ、イリノイ州) を使用して分析されました。グループ間の差異は、一元配置反復測定分散分析 (ANOVA) で分析されました。結果は、GraphPad Prism ソフトウェア (バージョン 6.0、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) を使用して、平均 ± 標準偏差 (SD) として表されました。 0.05 未満の P 値の差は統計的に有意であるとみなされます。
3. 実験結果
3.1. UPLC-QqQ-MS 分析
最良の分離、ピーク形状、短い分析時間を実現するために、カラム、移動相、グラジエント プログラムなどのクロマトグラフィー条件が予備実験で検討されました。 MRM モードでの典型的なクロマトグラムを図 1 に示します。
表 4 から、WCD のフェニルエタノイド配糖体の含有量は、CD の含有量と比較して、特にエキナコシドとアクテオシドについて増加していますが、WCD ではイリドイドの含有量が減少していることがわかります。
3.2. HPA軸機能の規定
3.2.1.重量、温度、保持力のテスト
MC群と実験群のラットは、コルチコステロンを投与された後、徐々に腎陽欠乏症の症状を示した。体重減少、低体温、髪のつやの喪失、元気のなさ、反応の遅れ、水分摂取量と活動性の大幅な低下などの症状は、CD群とWCD群で大幅に改善した。図 2(a) は重量の変化を示しています。各薬物グループの比重は、特に CDHD グループと WCD-HD グループで増加しました。 MC グループの体重増加は最も低かった。図 2(b) の温度変化は MC 群が最も低く、WCD-HD、WCD-MD、WCD-LD 群で温度が上昇しました。
図2(c)は、BC群および各実験群で保持力が増加し、WCD-MD群が最も高かったことを示しており、腎陽欠乏によって誘発される衰弱の兆候が投与後に改善されたことを示しています。
3.2.2. T、CRH、ACTH、CORT、コルチゾールのレベル
図3は、BCグループと比較して、ラット血清中のT、CRH、ACTH、およびCORTのレベルが減少し（P < 0.01）、コルチゾールレベルが減少したことを示しています（P < 0.05) MC グループ内。 MC グループと比較して、WCD-HD および WCD-MD グループの T レベルは増加し (P < 0.01)、WCD-LD の CRH レベルは増加しました。 WCD-MDおよびWCグループは改善し（P < 0.01）、CD-HD、WCD-MD、およびWCD-HDグループではACTH含有量が増加し（P < 0.01）、CORTレベルはCD-HDグループで増加しました。 CD-MD、WCD-MD、およびWCD-HDグループ（P < 0.01）、CDHDおよびWCD-LDグループで増加（P < 0.05）、コルチゾールレベルは各薬物グループで増加しました。
3.2.3.顕微鏡観察結果
副腎組織は皮質層と髄質層に分けられます。皮質層には、球状層、束状層、および網状層が含まれます。細胞にはより多くの脂質が含まれており、髄質層は大部分が褐色細胞腫細胞と少量の線維組織で構成されています。図 4 に示すように、BC グループではすべてが正常であったのに対し、MC グループでは副腎皮質に明らかな過形成、細胞萎縮、および密度の増加が見られたことがわかりました。球根状の細片は肥厚し、半透明の束状帯、狭い網状帯、およびより小さな細胞は不均一な色と毛細血管の鬱血を示しました。 PC グループでは、皮質と髄質の境界が見えました。球状帯と束状帯の細胞は均一に配置され、形態構造が復元されていました。 WCD グループでも同様の良好な回復が観察され、WCD-MD グループの効果は WCD-HD および WCD-LD グループよりも優れていました。 CD グループの副腎の形態は WCD グループほど良好ではありませんでした。
性機能を改善するための天然シスタンケ チューブローサ PHGS75% ECH 30% ACT 12%
