初代培養マウス肝細胞のアルコール損傷に対するカンカの総配糖体の保護効果に関する研究
Mar 10, 2023
目的: 初代培養肝細胞に対するカンカの総配糖体の保護効果を研究すること。 方法: 初代肝細胞を in situ 灌流法によって収集し、アルコールによって損傷した初代培養肝細胞の生存率に対するカンカの総グリコシドの影響を MTT 法によって評価した。 アルコールによって損傷を受けた初代培養肝細胞および核の形態に対するカンカの総グリコシドの影響を蛍光顕微鏡で評価した。 アルコールによって損傷を受けた初代培養肝細胞のアポトーシスに対するカンカの総グリコシドの影響は、フローサイトメトリーによって検出されました。 免疫細胞化学染色を使用して、カンカの総グリコシドが bcl-2 および c-fos の発現に及ぼす影響を検出しました。 結果: アルコール損傷後、初代肝細胞の生存率が低下し、アポトーシスとネクローシスに明らかな変化が見られました。 アポトーシス抑制遺伝子 bcl-2 の発現が減少し、アポトーシス促進遺伝子 c-fos の発現が増加しました。 カンキクサの総グリコシドは、細胞の生存率を大幅に改善し、アポトーシスとネクローシスを改善し、bcl-2 の発現を高め、c-fos の発現を阻害します。 効果は用量依存的でした。 結論: カンカの配糖体は、アポトーシス抑制遺伝子 bcl-2 の発現を増加させ、アポトーシス促進遺伝子 c-fos の発現を減少させ、アポトーシスと壊死を減少させ、細胞生存率を増加させることにより、初代培養肝細胞を保護することができます。
キーワードの総グリコシドシスタンケ・デザティコラ; 一次文化; 肝細胞; アルコール性肝障害; アポトーシス
カンシェパウダー
近年、人々の生活水準の向上に伴い、アルコール消費量が急速に増加し、それに伴ってさまざまなアルコール関連疾患が増加しており、アルコール性肝障害は重要な問題の1つです。 研究によると、カンカには免疫機能、アンチエイジング、抗放射線、抗酸化、抗脂質過酸化、およびアルコール誘発性肝障害を強化する保護効果があることが示されています [1]。 グリコシドはカンカの主な活性物質です。以前の実験では、動物実験によって総配糖体がCistanche Deserticola maフリーラジカルの生成を減らし、フリーラジカルとその代謝産物の捕捉能力を高め、それによって脂質過酸化を阻害し、アルコール誘発性肝障害において保護的な役割を果たす可能性があります[2]。 この実験では、肝細胞の初代培養による細胞レベルでのアルコール性肝障害に対するカンカの総配糖体の保護効果を調べます。
1 材料と方法
1.1 試薬と器具総グリコシドカンザス・デスティコラ、蘭州大学薬学部が提供する暗褐色の粉末には、フェニルエタノールの総グリコシドの88.6％が含まれています。 再蒸留水に溶解し、培養液を必要な濃度に希釈します。 酵素マーカー（Beckman Coulter AD340）、蛍光顕微鏡（Olympus、BX51）、倒立位相差顕微鏡（Leica DMI3000B）、フローサイトメトリー（Beckman colter cell、CellLabQuanta SC）など
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1.2 初代肝細胞は、in situ 灌流法によって分離および培養されました [3]。
1 匹の昆明マウスは、{{0}}.5% ペントバルビタール 0.5 mL の腹腔内注射によって麻酔されました。 ルーチンの皮膚消毒の後、腹部を開き、消化管を左に動かし、門脈を露出させ、注入装置の注入針を門脈の遠端から慎重に突き刺し、結紮して固定します。 輸液セットの流量を最大（約 4mL/分）にし、37 度に予熱したカルシウムフリーのプレ灌流液を滴下します。 肝臓が腫れている場合は、下大静脈の遠位端をすばやく切断し、肝臓が収縮と拡張を交互に繰り返すように、下大静脈の近位端を断続的に圧迫します。 残留血液が洗い流され、肝臓が均一に黄色と白になったら、温かい 0.05% コラゲナーゼ (シグマ) 灌流溶液を消化灌流に使用します。 肝臓が柔らかくなり、弾力性がなくなると、消化が停止し、肝臓カプセルの下に小さな空胞が現れたり、肝臓組織にひびが入ったりします. 肝臓を慎重に解離し、適量のDMEM高糖培養液（シグマ）を含む滅菌プレートに移し、肝臓のエンベロープを剥がして軽く振り、培養液中に肝細胞をまき散らし、コニカルに集めます10分間振とう培養し（振動数100回/分）、3分間遠心（4度、1000r/分）し、上清を捨てる。 細胞を培地で懸濁し、２００メッシュのナイロンメッシュで濾過し、濾液を３回遠心分離（４℃、１０００ｒ／ｍｉｎ）を繰り返して肝実質細胞を得た。 細胞濃度を 5 × 106 cells/mL に調整し、ラットテールコラーゲンで前処理した 25mL 培養フラスコに接種し、37 度、5% CO2 インキュベーターで培養します。 24時間後、溶液を交換し、非接着細胞を廃棄し、その後の実験で使用するために培養を続けます.
1.3 初代培養マウス肝細胞の増殖曲線の決定
精製肝細胞を5×106個/mLに調整24-ウェルプレートに接種し、細胞懸濁液1mLを各ウェルに接種した。 計21ウェルに接種し、10％ウシ胎児血清（Sigma）を含むDMEM高糖培養液で7日間培養した。 毎日無作為に 3 つの穴を取り、0.25% のトリプシンを均等に消化して吹き込み、カウントボードを数えて成長曲線を描きます。
1.4 アルコール性肝細胞損傷モデルの確立。
上記の方法で得られた対数肝細胞を、ラット尾部コラーゲンで前処理した{{0}}ウェルプレートに接種し、各ウェルに100細胞をμ50で接種した。 24 時間培養後、さらに 24 時間交換した。 ブランク群を設定し、5 つのアルコール介入群 (50、75、100、125、150 mmol/L) を設定し、各群に 5 回の再穿孔を設定しました。 肝細胞を異なる濃度のアルコールで 24 時間培養した後、0.5% MTT (Sigma) 20 を各ウェル μ 50 に添加しました。4 時間培養を続け、上清を捨て、DMSO150 を各ウェル μ 50 に添加しました。振とう台に移し、15 分間攪拌後、570nm における吸光度を測定し、細胞生存率を算出します。 投与群/対照群の細胞生存率値×100%
1.5 初代培養肝細胞の生存率に対するカンカの総配糖体の影響
アルコールによる損傷 上記の方法で得られた肝細胞を、ラット尾部コラーゲンで前処理した {{0}} ウェル プレートに接種し、各ウェルに 100 μ 50 を接種します。 10％ウシ胎児血清の培養液を24時間培養した後、交換しました。 さらに２４時間後、終濃度０．２、０．４、０．８ｇ／ＬのＧＣをそれぞれ投与群に加えた。 エタノールモデル群とブランク群は薬剤を添加せずに培養を継続し、各群には5つのマルチウェルを設定した。 24 時間後、モデル グループと GCs 介入グループには、それぞれ最終濃度が 100 mmol/L になるようにアルコールを加えました。 12時間培養後、MTT法により細胞生存率を測定した。
1.6 初代培養肝細胞およびアルコール損傷核の形態に対するカンカデバタケの総配糖体の影響
6-ウェルプレートに滅菌済みのカバーガラスを入れ、接種濃度が5×106個/mLの細胞懸濁液、モデル群、カンカ群（0.2 、0.4、{{20}}.8 g/L) およびブランク グループ。 培養 24 時間後、最終濃度の 100 mmol/L アルコールを追加します。 24 時間培養後、スライド ガラスから 95% エタノールを取り出し、15 分間固定します。 PBS を 2 回洗浄した後、PBS に再分散させます。 細胞濃度を 5 × 104 cells/mL に調整し、10 μL のアクリジン オレンジ - エチリデン ブロマイド混合物 (シグマ) (0.01 μ G/mL アクリジン オレンジ溶液、0.02 μ G/mL プロメタジン溶液、混合体積比: 1/ 1) 30分間培養後、蛍光顕微鏡で観察・撮影。
1.7 アルコールによって損傷した初代培養肝細胞のアポトーシスに対するカンカの総配糖体の影響
消化された細胞懸濁液の密度を 5 × 106 細胞/mL に調整し、6 ウェル プレートに接種して 24 時間培養し、モデル群、カンカ類の群 (0.2 、0.4、0.8 g/L) およびブランク グループ。 24時間培養後、終濃度100mmol/Lになるようにアルコールを加えて24時間培養し、細胞を消化・回収し、PBSで2回洗浄し、70%の予冷エタノールで4℃で一晩固定し、PBSで洗浄します。 RNA 酵素 (Sigma)、PI (100 μ G/mL) (Sigma) を加え、37 度の水浴に 30 分間入れます。 アポトーシス率は、フローサイトメトリーによって測定されました。
1.8 カンカの総グリコシドは、アルコール、bcl-2、およびアポトーシス促進遺伝子 c-fos によって損傷を受けた初代培養肝細胞のアポトーシスを阻害することができます
fos 発現の効果は、それぞれが 3 つのウェルのグループである 3 つの 6 ウェル培養プレートから取得されました。 モデル群、カンカ群（0.2、0.4、0.8 g/L）、およびブランク群を設定した。 1枚の無菌スライドを各穴に入れた。 対数増殖期の細胞を採取し、トリプシン消化により単一細胞懸濁液を調製し、細胞密度を 5 × 106/mL に調整し、6- ウェル プレートに 2mL/ウェルで接種しました。 24時間培養後、終濃度100mmol/Lになるようにアルコールを添加し、24時間培養を続ける。 細胞でいっぱいのスライドを取り出し、PBS で 2 回洗浄し、ルーチンの免疫組織化学 ABC メソッドで染色します。 簡単な手順は次のとおりです: 40% パラホルムアルデヒドで 10 分間固定し、通常のヒツジ血清で 30 分間密封し、bcl-2 ポリクローナル抗体 (Invitrogen) (1:75) または c-fos を滴下して追加します。ポリクローナル抗体 (Invitrogen) (1:50) を室温で 1.5 時間反応させ、ABC 複合体を室温で 2 時間加え、DAB を発色させ、ゼラチンでシールします。 Bcl-2 と c-fos タンパク質の発現を光学顕微鏡と写真で比較しました。
1.9 統計処理 実験データは SPSS13.5 ソフトウェアで処理されました。 平均値 ± 標準偏差 (x ± s) として表され、グループ間の比較には t 検定が使用されます。 P<0.05 indicates that the difference is statistically significant.
2 件の結果
2.1 初代培養マウス肝細胞の増殖曲線を図 1 に示します。培養時間とともに肝細胞の数が増加し、4 日目には対数増殖期に入ったことがわかります。
図1 初代培養マウス肝細胞の増殖曲線
2.2 初代培養マウス肝細胞の生存率に対するアルコール濃度の影響
表 1 から、アルコールは初代培養肝細胞に対して強い損傷効果を持ち、その効果は用量依存的であることがわかります。 テストの必要性に応じて、100mmol/L が次のテストでの作業濃度として使用され、細胞生存率は 43.40% です。
2.3 総グリコシドの効果シスタンケ・デザティコラアルコール損傷初代培養肝細胞の生存率について
表 2 に見られます。アルコール損傷後、肝細胞の生存率が大幅に低下します。 カンカデバナの総グリコシドは、肝細胞の生存率を大幅に高めることができます (P<0.05), and the effect is dose-dependent (P<0.05).
砂漠に生きるシスタンチ
2.4 総配糖体の影響シスタンケ・デザティコラ初代培養肝細胞とアルコール損傷核の形態について.
アジジンオレンジは細胞に入った後に緑色の蛍光を示しますが、プロメタジンは細胞膜が不完全な壊死細胞しか染色できません。 観察（図2）により、ブランク群の肝細胞は一様に緑色であり、壊死細胞の臭素赤色染色は見られなかった（A）。 アルコール処理後、肝細胞は小さくなり、ブロミンレッドで染色された多数の壊死細胞と、核内にクロマチン濃度のあるアポトーシス細胞（核は明るい緑色）が現れた（B）。 したがって、アルコールは肝細胞のアポトーシスを誘導する一方で、細胞の壊死も引き起こす可能性があると考えられています。 GC はネクローシスとアポトーシスを大幅に減らすことができ、その効果は用量と正の相関があります (C、D、E)。
図2 初代培養肝核の形態に及ぼすカンカの総配糖体の影響の蛍光顕微鏡観察（アクリジンオレンジ染色、400倍）
A: 空白のグループ。 B: モデル グループ; C:{{0}}.2g/L-GC; D:0.4g/L-GC; E:0.8g/L-GC
2.5 総グリコシドの効果シスタンケ・デザティコラアルコール損傷初代培養肝細胞のアポトーシスについて
カンカエキス末
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図 3-B に見られるように、アルコール損傷後の肝細胞のアポトーシス率は大幅に増加し (34.7%)、カンキツクの総グリコシドは、用量依存的に肝細胞の生存率を大幅に増加させることができます。蛍光顕微鏡で観察した結果と一致しています。
図 3 アルコール損傷初代培養肝細胞のアポトーシスに対するカンカの総配糖体の影響
A: 空白のグループ。 B: モデル グループ; C:{{0}}.2g/L-GC; D:0.4g/L-GC; E:0.8g/L-GC
免疫細胞化学により、肝細胞が損傷を受けた後、アポトーシス抑制因子bcl-2の発現が減少し(4-B)、c-fosの発現が増加する(5-B)ことがわかったアルコールによる。 カンキクサの総グリコシドは、bcl-2 (4-C、D、E) の発現を大幅に増強し、c-fos (5-C、D、E) の発現を阻害します。 結果を図4-5に示します。
図 4 アルコールで損傷した初代培養肝細胞における bcl-2 の発現に対するカンカの総配糖体の影響 (400)
A: 空白のグループ。 B: モデル グループ; C:{{0}}.2g/L-GC; D:0.4g/L-GC; E:0.8g/L-GC
図 5 アルコールで損傷した初代培養肝細胞における c-fos の発現に対するカンカの総配糖体の影響 (400)
A: 空白のグループ。 B: モデル グループ; C:{{0}}.2g/L-GC; D:0.4g/L-GC; E:0.8g/L-GC
3 ディスカッション
漢方香草
ベリー等。 最初に、コラゲナーゼを使用して肝臓を灌流し、生理学的条件下で肝細胞を取得する in-situ 灌流法を確立し、後に Seglen らによって開発されました。 [4] このコラゲナーゼ灌流技術をより完璧にするため。 この方法は、高い細胞収量と高い生存率を持っています。 この実験では、初代肝細胞は、マウス肝細胞の in situ 灌流によって得られ、培養されました。 この方法は安定しており、細胞活性は強かった。 増殖曲線試験により、得られた初代肝細胞は4日後に対数増殖期に入ることがわかった。
MTT 比色微量分析は、細胞の増殖と生存を良好な再現性で検出する感度の高い方法です。 生細胞のミトコンドリアのコハク酸デヒドロゲナーゼは、黄色の MTT を青紫色の結晶に還元できますが、死んだ細胞にはそのような機能はありません [5]。 細胞活性は、光学密度を測定することによって反映できます。 この実験では、MTT法を使用して、アルコール損傷後の肝細胞の生存率が大幅に低下し、カンカの総配糖体が肝細胞の生存率を大幅に増加させる可能性があることを検出しました(P<0.05), and the effect was dose-dependent (P<0.05).
アポトーシスは、細胞死の特殊な形態です。 細胞がアポトーシスを起こすと、特別な形態学的および生化学的変化が起こります[6-8]。 実験では、ほとんどの肝細胞がアルコール処理後にアポトーシスを起こし、細胞が明らかな形態学的変化を示したことが確認されました。細胞は小さくなり、細胞表面の微絨毛は消失し、細胞表面は収縮し、液胞があり、核凝縮、およびアポトーシス体の形成; 壊死を伴う。 カンカの総配糖体で処理した後、アポトーシス率が大幅に低下し、壊死状態も緩和されました。
bcl-2 遺伝子はがん原遺伝子です。 現在、5 つの bcl-2 遺伝子ファミリー (bcl-2、bcl-2 x、bax、mcl-1、および A1) が見つかっており、その中で bcl{{7 }} プログラム細胞死 (PCD) を阻害できます。 bcl-2 の働き このメカニズムには、(1) Ca2 plus の放出を阻害することが含まれます。 Bcl-2 は膜貫通タンパク質であり、主に核膜に位置しています。 内核膜と外核膜は、小胞体の内腔によって接続されています。 後者は細胞内 Ca2+ の主な貯蔵部位であり、細胞アポトーシスの過程で重要な役割を果たします。 トランスジェニック法を使用して、bcl-2 の高発現が小胞体からの Ca2+ の放出を阻害できることがわかったため、アポトーシスに対する bcl-2 の阻害効果が関連している可能性があると推測されました。小胞体のCa2プラスに[9]。 (2) Bcl-2 は、プロアポトーシス遺伝子のシグナル伝達をブロックするか、これらの誘導性遺伝子産物をブロックすることにより、抗アポトーシスの役割を果たします。 研究では、bcl-2 タンパク質が P53 および c-fos によって誘導されるアポトーシスを阻害できることが示されています [10]。 (3) Bcl-2 は、フリーラジカルを阻害することにより、抗アポトーシスの役割を果たすことができます。 bcl-2 は抗酸化物質の役割を果たし、スーパーオキシドの生成と作用を阻害して、アポトーシスの発生を阻害します [11]。
初期即時遺伝子 (IEG) は、早期に出現し、さまざまな有害な刺激下で持続時間が短い遺伝子です。 c-fos は癌原遺伝子の 1 つで、染色体 14q21-q31 に位置します。 これは 9kb の DNA で、4 つのエクソンと 3 つのイントロンで構成されています [12]。 基本的な転写は低いですが、迅速かつ一過性の発現のために、さまざまなセカンドメッセンジャー分子によって引き起こされる可能性があります。 c-fos のタンパク質産物は FOS であり、がん原遺伝子 c-Jun によってコードされるタンパク質は JUN です。 FOS にはロイシン抗鎖 (LZ) が含まれています [13]。 FOS と JUN は、転写因子 AP-1 と呼ばれる LZ 構造を介して核内でヘテロ二量体を形成します。これは、標的遺伝子の AP-1 部位と結合し、核のサード メッセンジャーとして機能します。長い間効果遺伝子の発現[14]。 Morgan は、c-fos のさまざまな表現がその機能の多様性と複雑さを示していると考えています。 一過性の発現は細胞の保護、修復、リモデリング、および再生に関与している可能性がありますが、持続的な過剰発現は二次損傷に関連しています。 両者の発現メカニズムは異なります。 したがって、c-fos などの IEG が 2 つの役割を果たしていると考えられます。 修復防御システムが完全に阻害されると、それらはアポトーシスに参加します。 阻害されていない場合、病変周辺の細胞に保護効果があり、細胞の修復と再生のプロセスに関与しています [15]。 WebsterKR は、アンチセンス ヌクレオチドを使用して c-fos の転写を減少させ、アポトーシスの発生を防ぎます。これは、c-fos の過剰発現がさまざまな疾患の発生と発症に密接に関連していることを示しています [16]。
この実験では、肝臓細胞がアルコールによって損傷を受けた後、アポトーシス抑制因子 bcl-2 の発現が大幅に減少し、c-fos の発現が増加したことから、カンカの総配糖体が肝臓を保護できることが示唆されました。 bcl-2 の発現を高め、c-fos の発現を阻害し、肝細胞の損傷とアポトーシスを減少させることにより、細胞を保護します。
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