トロンビンの持続的な局所阻害は、急性腎障害の発症後、腎のマイクロアーキテクチャと機能を維持します
Mar 14, 2022
連絡先：オードリー・フーaudrey.hu@wecistanche.com
Ian Vargas et al
概要
急性腎障害（AKI）単一のシグナル伝達経路に向けられた特定の治療薬が臨床試験で成功していないため、管理は主に支持的であり続けます。 ここでは、局所的に作用するトロンビン標的パーフルオロカーボンナノ粒子（PFC NP）の使用によるトロンビン駆動凝固および炎症性シグナル伝達の阻害が腎血管系を保護し、腎虚血再灌流傷害を引き起こす多様な炎症過程を広く調節することを報告します。 各PFCNPは、直接トロンビン阻害剤であるPPACK（プロリン-フェニルアラニン-アルギニン-クロロメチル-ケトン）の約13,650コピーと複合体を形成しました。 AKIの発症後にPPACKPFCNPで治療されたマウスは、ダウンレギュレーションされたVCAM -1、ICAM -1、PGD2プロスタノイド、M-CSF、IL -6、および肥満細胞浸潤を示しました。 微小血管構造、管状基底膜、および刷子縁成分はよりよく保存されていました。 非再灌流は、赤血球トラップと非ヘム鉄の減少によって示されるように減少しました。肝臓機能と尿細管壊死は、未治療の対照群と比較して24時間で改善し、PPACKPFCNPによる血栓症と炎症の二重阻害の利点を示唆しています。
キーワード： 急性腎障害; 血栓症; 炎症; パーフルオロカーボンナノ粒子; 船舶の損傷
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急性腎障害（AKI）は、老若男女を問わず頻繁に発生する臨床的問題であり、発生率が高く、死亡率が許容できないほど高く、数十年で大幅に改善することはありません。 the肝臓低血圧、敗血症、毒素などを含む多くの侮辱の結果として3。AKIは、病態生理学的分子プレーヤーの複雑なパノラマと、段階的に進化する疾患プロセスのシグナル伝達イベントを引き起こします。3–6選択的かつ特定の分子標的医療差し迫った医学的必要性にもかかわらず、AKIの治療法はまだ存在していません。7実際、何年にもわたる前臨床および臨床研究の努力の後、現在の治療法は本質的に支持的であり続けています。
ここでは、微小血管の完全性とバリア機能を維持し、同時に炎症性シグナル伝達を低下させることができるトロンビンを標的とするナノ粒子ベースの治療的介入がAKIの結果に利益をもたらすと仮定します。 トロンビンは、NF-κB、8 NADPHオキシダーゼなどの損傷後の内皮活性化に関与する他の多くの炎症性分子を駆動する、主要なアテローム発生性および創傷治癒分子です。9
内皮細胞とマクロファージの両方のプロテアーゼ活性化受容体（PAR -1）を介したその他の細胞。肝臓片側性虚血再灌流に関する経時的シングルセルシーケンシング研究でRudman-Melnickらによって示された損傷マーカーおよび発生遺伝子の発現増加を含む、経験豊富な遺伝子発現パターンの変化肝臓さらに、両側虚血再灌流腎損傷における単一核RNAシーケンスのげっ歯類研究13により、温虚血再灌流損傷後の炎症誘発性および線維化促進性の遺伝子を過剰発現する特定の近位尿細管細胞集団が特定されました。 これらの結果は、炎症が有用な治療標的となるはずであることを示しています。 固形の血管内血餅の形成はAKIではまれに見えるが、局所的に作用する強力なアンチトロンビンナノ粒子アンタゴニスト14–17を介した微小血管凝固促進活性の緩和は、血流を改善し、「リフローなし」を減らし、炎症シグナルを弱めて維持する可能性があるとさらに仮定した。腎機能。
腎虚血再灌流傷害（IRI）を予防するために直接トロンビン阻害剤を適用することを妨げる重大な問題には、潜在的な毒性副作用と全身性出血のリスクが含まれます。 血栓症に関しては、従来の抗凝固療法は特に成功していませんが、可溶性トロンボモジュリンは、過度の出血の潜在的な合併症を伴うものの、プロテインC、20、21およびアンチトロンビンIII、22を活性化する可能性があるため、腎保護作用を発揮する可能性があります21。ダビガトランは腎毒性と関連しています。23,24しかし、これらの抗凝固剤のアプローチがまだ臨床的に成功していないという事実は、凝固と炎症の両方におけるその二重の機能のために、標的としてのトロンビンの潜在的な価値を減少させません。 AKIのVEGF治療に関する臨床研究はありませんが、前臨床研究により、VEGFがAKI中の腎保護における重要なメディエーターであることが示され25、AKI中の腎機能の保護における腎血管温存の提案された仮想治療メカニズムがさらに支持されます。
出血素因を引き起こすことなくトロンビンのプロテアーゼ活性を阻害する、安定した生体適合性の非腎毒性パーフルオロカーボンナノ粒子（PFC NP）プラットフォームを開発しました14,15。ネイティブPFC NPは、血液代替物としてFDA承認済み26であり、液体パーフルオロカーボンを含みます。コアと外側のリン脂質-界面活性剤シェルで、直径は〜160-250nmです。 最近の予備的なAKI研究では、前処理として抗血栓PFC NPを投与し、虚血再灌流前に投与した場合に、微小血管の完全性を維持し、IRIの非再灌流を減らすことにより、血栓が腎機能の回復を促進するための貴重な標的であることを確認しました。損傷16。抗血栓PFCNPSはまた、腎同種移植片をIRIから保護し、移植後の腎寿命の延長に関連する実質尿細管壊死の割合の著しい減少を示します27。しかし、この抗血栓ナノ粒子が依然として有効であるかどうかは明らかではありません。完全に異なる患者集団のセットを表すAKIの発症後。
したがって、本研究では、臨床翻訳の可能性を解明するために、IRI後に確立されたAKIにこのアプローチの使用を拡張しようとしました。 概念の証明として、PFC NPへの結合のためのアンチトロンビン部分としてPPACK（Phe [D] -Pro-Arg-chloromethylketone）を採用しています。これはアテローム性動脈硬化症と急性腎障害のモデルでトロンビンシグナル伝達と微小血管血栓症を未然に防ぐことを示しています（ AKI）.14–17 PPACK自体は、よく知られている直接的かつ不可逆的なトロンビン阻害剤であり、遊離型は腎臓によって急速に除去され、治療薬としての価値がありません。 PPACK PFC NP療法は、腎臓と全身の両方で炎症性シグナル伝達イベントを制限し、腎臓の微細構造を維持し、血管の損傷を軽減します。 これらのデータは、進行中のAKIに対するこのナノ粒子ベースの治療アプローチが、局所的に制約された多面効果を発揮し、AKIの初期段階で安全に投与できるアンチトロンビン剤の臨床開発の段階を設定できることを意味します。
メソッド
ナノ粒子製剤
パーフルオロカーボンナノ粒子は、前述のように処方されました。14簡単に説明すると、98.5molパーセントの卵L- -ホスファチジルコリンと1.5molパーセントの1,2-ジステアロイルスグリセロ- 3-ホスホエタノールアミン-N-[カルボキシ（ポリエチレングリコール）-2000]（ナトリウム塩）（Avanti Polar Lipids、Alabaster、AL）は、真空下で乾燥して脂質膜を形成する前に、クロロホルム：メタノール（3：1）で調製しました。 次に、脂質フィルム（2パーセント（wt / vol））をPFOB（20パーセント（vol / vol））（Exfluor Research Corp。）（グリセリン1.7パーセント（wt / vol））（Sigma、ミズーリ州セントルイス）と組み合わせました。 ）、およびMilliQ水、氷上で20、000 psiで4分間乳化（Microfluidics Inc）する前。 PPACK共役でナノ粒子を機能化するために、アミン-カルボキシルカップリング法を利用しました。 ナノ粒子（1 ml）を最初に2mgのEDCI1- [3-（ジメチルアミノ）プロピル] -3-エチルカルボジイミドメチオダイド（Sigma、ミズーリ州セントルイス）と1時間混合しました。 、オービタルシェーカーの室温で一晩12.5mgのPPACK（BACHEM、カリフォルニア州トーランス）を加える前。 分子量カットオフ3000-5000g/ mol（Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用した透析を実行して、過剰なEDCIとPPACKを除去しました。 詳細な配合方法は補足資料に含まれています。
急性腎障害モデル
成体のC57BL/6マウス（n=22）は、急性腎障害を誘発するために両側腎温虚血再灌流を受けました。 動物をケタミン（85mg / kg）およびキシラジン（13mg / kg）カクテルで麻酔した後、開腹術を行って17分間の温虚血を生じさせた。 正中線腹部切開を導入して、腎動脈と腎静脈の両方を露出させた。 腎虚血は、腎臓への血流を制限するために、動脈と静脈の両方の閉塞クランプによって誘発されました。 腎臓の血流が正常に停止したことは、腎臓の色がピンクから濃い紫色に変化することで視覚的に確認されました。 小動物加熱システムを用いてマウスの体温を37度に維持した。 クランプは17分後に解放され、腎臓の血流を回復できるようになりました。これは、腎臓の色がピンク色に変化することで確認されました。 次に、外科的創傷を層状に閉じ、動物をモニターし、自由に動かした後、ケージに戻した。 2時間の再灌流後、PPACKの単回投与
PFC NP（{{0}}。5 ml / kg PFC NP; 0.05 mg / kg PPACK）またはプレーン（コントロール）PFC NPは、尾静脈注射により静脈内投与されました。 以前の研究では、PPACK PFC NPの単回予防投与が腎保護効果を示すことが示されたため16、ここでは、AKIの発症後に単回投与治療を適用して腎保護効果を評価しました。 手順とプロトコルは、サウスフロリダ大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。
ナノ粒子投与の24時間後の組織の収集と保存、マウスを安楽死させ、分析のために腎臓を摘出しました。 組織学的および分子的評価のために腎臓を摘出する前に、下流の血清分析のために心臓穿刺により血液を採取し、その後、各マウスに通常の生理食塩水（カタログ番号：23-535435、フィッシャーサイエンティフィック、マサチューセッツ州ウォルサム）を残留するまで全身灌流した。腎臓から血液が流された。 血清を採取するために、全血を室温で30分間凝固させた後、2000×gで4度で10分間遠心分離しました。 採取した血清は、血中尿素窒素とサイトカインの評価前に-80度で保存しました。 組織学的分析のために、切除された腎臓は、組織処理、パラフィンへの包埋、および切片化の前に、10パーセントのホルマリンで固定されました。 エイコサノイドの評価では、切除した腎臓をさらに解剖して皮質と髄質を分離した後、液体窒素で急速凍結し、分析のために-80度で保存しました。
組織学
詳細な組織学的染色およびデータ分析方法は、補足資料に含まれていました。 スライドを脱パラフィンし、再水和してから、ヘマトキシリンおよびエオシン染色、Periodic Acid Schiff（PAS）染色（カタログ番号：ab150680、Abcam、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）、プルシアンブルーアイアン染色、免疫組織化学的染色によるCD31、VCAM -1、およびICAM-1発現、およびマスト細胞-好酸球染色（カタログ番号：150665、アブカム、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）。 免疫組織化学的染色結果の特異性を示すために、ウサギIgGアイソタイプコントロール染色データを補足図2および3に示します。 すべての顕微鏡画像は、同じ電力設定とデジタル化パラメータで取得されました。 顕微鏡評価は、DP27デジタルカメラを装備したオリンパス明視野顕微鏡を使用して実施し、病理切片の画像を20倍または40倍の倍率で記録しました。 二重盲検データ分析は、すべての画像で実行されました。
血中尿素窒素（BUN）
BUN測定は、尿素窒素（BUN）比色検出キット（カタログ番号：K 024- H5、Arbor Assays、ミシガン州アナーバー）を使用して、製造元の指示に従って実行されました。
エイコサノイドの調製と分析
エイコサノイドは、変更された抽出プロセスを使用して抽出され、前述のようにUPLC ESI-MS / MSによって分析されました28。この研究に使用された詳細なメソッドは、補足資料に含まれています。
血清サイトカイン評価
カスタマイズされたサイトカインアレイは、R＆D Systems（ミネソタ州ミネアポリス）から購入し、ユーザーマニュアルの指示に従ってLuminex 200（イリノイ州ノースブルック）で評価しました。
統計学
結果は、平均±平均の標準誤差（SEM）として表されます。 各実験の統計分析は、補足表1にまとめられています。両側t検定、またはScheffe検定を使用した一元配置分散分析を使用しました。 選択したメトリックのペアの相関分析を実行して、ピアソンのr値を計算しました。 差異の統計的有意性は、P<>
結果
PPACK PFC NP治療は、発症後の腎機能を改善します急性腎障害.
再灌流後アンチトロンビン（PPACK）PFC NP治療の24時間後の腎臓の一般的な外観の顕微鏡検査は、確立されたAKIの損傷の改善を示しました（図1、AB）。 24時間での損傷は主に腎臓の皮質髄質接合部に位置し、近位尿細管が優先的に損傷した。 損傷のパターンは、凝固型壊死のパターンでした。 24-時間の時点で軽度の炎症性浸潤がありました。 H＆E染色切片の尿細管損傷の定量化（図1、C）により、PPACK PFC NP治療マウスは急性尿細管壊死（ATN）と対照NP治療マウスの全体的な減少が33.95％であることが明らかになりました（24.44±1.76％vs37。{{ 16}}±4.96パーセントそれぞれ;P= 0。035）。 図1、Dは、治療を受けたマウスが24時間までにBUNの44.03パーセントの減少を示したことを示しています（110.96±6.21 mg/dL対対照NP対PPACKPFCNPの62.10±8.71mg/ dL; P=0。0002） 。 これらの初期の有益な結果は、24時間の治療前のアンチトロンビンレジメンで以前に観察された保護を反映しており16、トロンビンが最初の虚血性発作を超えてAKIの進化において重要な役割を果たし続けていることを示唆しています。
図2は、PAS染色の半定量化に基づく、アンチトロンビン処理に対する基底膜と刷子縁構造の局所応答を示しています。 図2、ACは、治療により、基底膜が無傷の糸球体の割合が51.43パーセント±2.61パーセントから70。00パーセント±3.09パーセントに向上したことを示しています（P=0 .00033）。 図2、DFは、24時間で完全に無傷の刷子縁を保持したのはごく少数である、管状刷子縁が被ったより深刻な損傷を示しています。 それにもかかわらず、この処理により刷子縁の完全性が50.79パーセント改善されました（P=0。015）。 治療により、タンパク質凝集体の全体的な範囲が54.09パーセント減少しました（P=0。032）（図2、GI）。これにより、尿細管のうっ血を防ぎ、腎機能を維持することが期待されます。
PPACK PFC NP治療は、IRIの発症後も血管の完全性を維持しました
PPACK PFC NPが血管要素を保護する可能性を定量化するために、腎臓切片をCD31で染色しました。
図3は、PPACK NPとコントロールNPで処理したマウスの皮質と髄質における24時間でのCD31染色の有病率が高いことを示しています（図3、AとD、BとE）。 皮質領域では、CD31染色は治療の4.28パーセント±0。62パーセントであったのに対し、対照動物では1.75パーセント±0。34パーセントでした（P= 0。0 {{ 25}} 18）、または相対的な144.57パーセントの増加（図3、C）。 髄質領域では、CD31染色はPPACK NP処理動物で3.24パーセント±0.38パーセントであるのに対し、対照NP処理動物では1.91パーセント±0.29パーセント（P=0。0073）、または相対的な88.81パーセントの増加でした（図3、F） 。 血管の完全性の顕微鏡評価は、24-時間の時点で感知できる細動脈壊死を明らかにしませんでした。
顕微鏡画像での赤血球（RBC）の出現は、24時間でPPACK NPとコントロールNPで処理されたマウスの間で異なりました（図4）。 マウスは灌流可能な腎領域で血液を洗い流すために全身的に灌流されたため、RBCの存在は、灌流が不十分な微小血管導管内の凝集または間質性血管外漏出、あるいはその両方を示した。 糸球体（図4、AB）では、RBCは血管房内で観察されましたが、24時間でボーマン嚢ではめったに観察されませんでした。 治療により、糸球体RBCの有病率は40.78パーセント減少しました（P=0。007）（図3、C）。 延髄（図4、DE）では、H＆E染色に基づいてRBCの明確な位置を割り当てることはできませんでしたが、治療により全体的なRBC有病率が34.92％減少しました（P=0。049）（図4、F） 。
RBCの沈着とトラッピングの結果をさらに詳しく説明するために、プルシアンブルーを使用して非ヘム鉄染色を行いました。 鉄の染みは、糸球体と管状の細胞構造の両方で陽性でした。 治療により、皮質（44.23パーセントの減少; P=0 .022）（図5、AC）と延髄（50.50パーセントの減少; P=0。006）（図5、DF）の両方で鉄の有病率が減少しました）24時間で、RBCトラッピングに対するアンチトロンビン治療の効果と一致します。
PPACK PFC NP治療は、AKI発症後の局所および全身性炎症を軽減しました
腎臓の内皮活性化と局所炎症の維持におけるトロンビンの役割を解明するために、ICAM-1とVCAM-1の両方を定量化しました。 皮質におけるVCAM-1の発現は、PPACK処理によって変化しませんでした（図6、AC）。 しかし、髄質におけるVCAM - 1の発現は、治療後に65.25パーセント（P=0。011）大幅にダウンレギュレーションされました（図6、DF）。 内皮ICAM-1の発現増強は、対照NP処理マウスの皮質と髄質の両方で観察されました（図7、B、およびE）。 ICAM -1は、治療によって皮質で36.89パーセント（P=0。0083）（図7、AC）、延髄で31.17パーセント（P=0。030）ダウンレギュレーションされました（図7 、DF）。
AKIの初期進化における炎症性生物活性脂質の調節におけるトロンビンの役割を説明するために、24時間で皮質と髄質から別々に抽出された組織に対してリピドミックアッセイを実施しました。 補足表2および3は、特定の分子アッセイ、腎臓領域、および対象のタイプ（治療済みAKI、未治療AKI、またはAKIなしの正常）を示しています。 補足表4は、皮質および髄質の各脂質の健康な正常ベースラインからの平均変化率を示しています。 一般に、皮質領域と髄質領域の両方が、正常な腎臓と比較して評価されたほぼすべての生物活性脂質の発現の逸脱を示し（補足表2および3）、ほぼすべてのシグナル伝達脂質は、アンチトロンビン療法後に正常レベルにシフトする傾向がありました。 局所炎症の簡略化された測定基準として（補足表4）、すべての脂質の平均変化率は、対照NPグループとPPACK NPグループの皮質でそれぞれ65.13パーセントと38.60パーセント、髄質で136.42パーセントと90.76パーセントであり、リピドミックアッセイによると、髄質は皮質のそれを上回っていた。
ほぼすべての脂質種の処理後に解決傾向が明らかになりましたが、ほとんどは統計的有意性を満たしていませんでした。 ただし、これらのアッセイで注目に値するのは、PDG2の有意な応答であり、皮質で47.62％（図8、A）（P=0。012）、髄質で50.21％（図8、B）減少しました（図8、B）（それぞれ、P=0。0249）。 この観察に基づいて、炎症性PGD2の既知の顕著な発生源である浸潤性肥満細胞の有病率を定量化しました。 図8、CEは、アンチトロンビン治療により、24時間で腎臓セクション全体の肥満細胞含有量が54.27パーセント（P=0。002）減少したことを示しています。 これは、LFA -1（リンパ球機能関連抗原1）およびVLA（非常に遅い）を発現する活性化肥満細胞としてのVCAM-1およびICAM-1（図6および7）の観察された減少と一致します抗原）炎症組織への移行のために組織特異的接着分子を結紮します。29,30さらに、M-CSFやIL-6などの肥満細胞関連ケモカイン/サイトカインは抗トロンビンナノ粒子によって同時にダウンレギュレートされました。 PPACK NP治療後、血清M-CSFおよびIL -6は、比較して、それぞれ36.60パーセント（P=0。0448）および27.44パーセント（P=0。0454）減少しました。未処理の対照群（図8、F）。
いくつかの興味深い相関関係が、肥満細胞浸潤、血管損傷、および皮質領域と髄質領域の両方における治療動物と未治療動物の合計グループの腎機能に関連するデータセットから明らかになりました。 BUNとCD31の間に関係する間接的な関係（r=0 .75、P=0 .000009）は、腎不全の悪化がより大きな血管障害と関連していることを示しています（補足図1、A）。 マスト細胞数とBUNの間に直接的な関係が存在し（r=0。71、P=0。004）、進行性の減少を示しています
肥満細胞浸潤に関連する腎機能の低下（補足図1、B）。 肥満細胞数とCD31の間に間接的な関係が観察され（r=0 .59、P=0。002）、肥満細胞の浸潤が増加すると血管損傷が悪化したことを示しています（補足図1、C）。 最後に、肥満細胞数とグローバルICAM -1発現（r=0。54、P=0。008）の間に直接的な関係が観察され、アップレギュレーションされた血管接着分子が損傷した組織への肥満細胞のホーミングを促進します（補足図1、D）。 髄質VCAMの発現と肥満細胞の数に関連するさらに密接な直接的な関係（r=0 .69、P=0。009;データは表示されていません）。
討論
の効果的な管理を求めるための数十年の努力にもかかわらず急性腎障害, current treatments remain essentially supportive. Failure of single agents tested in numerous AKI clinical trials now prompts a renewed search for agents that might exert more pleiotropic or broad-spectrum therapeutic actions for preserving renal function.3–7 The present data indicate that targeting thrombin with locally acting nanoparticle agents represents one such approach to accelerating functional recovery, preserving vascular and tubular integrity, and modulating inflammation. The exceptional local potency of PPACK PFC NP against thrombin with normal bleeding times and clotting parameters by 30-60 min after injection14,15 is due to the fact that each nanoparticle situates >微小血管血栓症およびPAR-1活性化（補足資料の追加説明）の部位での104のアンチトロンビン部分、PPACKを含むトロンビンを阻害する従来の遊離薬剤の1：1化学量論では達成できない増幅戦略。
現在のデータセットは、急性腎虚血再灌流傷害が再灌流後2時間までに完了せず、トロンビンが再灌流後の損傷組織で高価値の標的のままであることを示しています。 Molitorisの仲間や他の人々によるこれまでの努力は、AKIでトロンビンを直接阻害するための安全な方法を設計するための継続的な努力を支持しています。18,31–33AKIをPPACKPFCNPで前処理した以前の研究から、アンチトロンビンナノ粒子は、血管の完全性を維持し、リフローなしの現象を約50％まで著しく減衰させ、腎機能障害を24まで急速に逆転させる、局所的に活性化されたトロンビンに対する持続的な監視を提供することがわかっています。 hrs.16現在のデータと合わせて考えると、アンチトロンビンナノ粒子は、追加の血管および尿細管の損傷を未然に防ぐために再灌流した後も、損傷しているが生存可能な腎組織にアクセスし続けることは明らかです。 PAR -1ノックアウトマウスが腎虚血再灌流傷害の減少に苦しむという以前の報告は、トロンビン阻害を介したAKIにおけるPAR-1活性化の強力かつ持続的な薬理学的阻害の戦略とも一致しています。34
アンチトロンビン療法がAKI、16は、腎細小血管障害を改善することの新たな利点を確認しています。 再灌流後のこれらの初期の時点では、尿細管周囲の毛細血管および小静脈への損傷の正確な性質は完全には解明されていませんが、血管透過性の増強および内皮アポトーシス促進性カスパーゼの活性化-3、ならびにシグナルの減少が記載されています。内皮接合部の完全性を調節するCD31（PECAM）35の場合。36CD31の合成と細胞接合部での発現は、血管透過性を高める活性化肥満細胞（TNF-およびIFN-）によって発現される炎症性サイトカインによってダウンレギュレートされます。37,38さらに、PAR -1の活性化を介したトロンビンによる組織因子の誘導はCD31によって調節され、CD31ノックアウトマウスは尿細管上皮および内皮のアポトーシスの増加、フィブリン沈着の増加、および組織因子の発現を示します。39したがって、CD31発現を維持するPPACK PFC NPの能力は、凝固カスケードの進行中の活性化を制限し、内皮の完全性を維持するために不可欠である可能性があります。
AKIの伸長期における炎症と凝固の間に局所的なつながりが存在し、外側の髄質毛細血管灌流を制限して、局所的な虚血/低酸素症を長引かせ、尿細管細胞の修復と再生を損ないます4。内側の縞の微小血管の数の持続的な減少AKIの外側髄質の変化は、血管の損傷が継続し、VEGFシグナル伝達が抑制されていることを示しています。40–42さらに、血管の希薄化が慢性低酸素症を誘発し、進行性尿細管間質性線維症を引き起こすという豊富な証拠があります。43急性ラット虚血/損傷モデルでは、近位尿細管は、尿細管細胞の脱落、さらには完全な崩壊によって現れる低酸素症に特に敏感であり、過剰な死亡率を生み出します44,45。慢性腎臓病。46
私たちのデータはまた、血管の損傷が慢性腎臓病を悪化させる可能性のあるRBCトラッピングと非ヘム沈着を促進することを確認しています（図4および5）。47しかし、これはアンチトロンビン療法に適しています。 糸球体細胞と尿細管細胞の両方の組織鉄源（図5）は、間違いなく、出血および/または微小血管血栓症の結果としてのこれらの領域でのRBC分解に起因し、アンチトロンビン療法によって軽減される血管障害の画像と一致します。 したがって、血管の完全性を維持するアプローチは、損傷した管状構造のより迅速な治癒を促進する栄養基質の供給ラインを維持するための重要な最初のステップを表す可能性があります。
興味深いことに、PPACK PFC NPは、血管構造の早期保護を提供し、皮質と延髄の両方で炎症のさまざまなマーカー（図6および7;補足表2-4）を減衰させるようです。 AKIの従来の実験的研究では、代謝要求が低いため、皮質は髄質よりも損傷に対して耐性があると想定されていますが、脂質学的および組織化学的アッセイによって証明されるように、内皮の活性化と病態生理学的炎症が広範囲に見られます。 さらに、皮質と延髄の両方でトラップされたRBCの分解の副産物としての非ヘム鉄の広範な沈着、およびアンチトロンビンナノ粒子によるその緩和は、皮質がより多くのことを証明したとしても、炎症と損傷の一般化されたパターンと一致します病気の経過中、髄質よりも一時的かつ軽度の影響を受けます。
24時間以内の肥満細胞浸潤の驚くべき初期反応（図8）は、好中球やマクロファージなどの従来のプレーヤー以外の炎症細胞の重要な役割を示唆しています。 肥満細胞は通常、アレルギー反応のメディエーターと見なされていますが、急性および慢性腎障害におけるそれらの病態生理学的影響に関する一連の文献があります。48–52 好中球は組織損傷の初期応答者ですが、マクロファージは炎症過程の後半まで画像に現れません。これは、肥満細胞がAKIの初期段階で重要な役割を果たしていることを示唆しています。 実際、Danelli et alは、肥満細胞の脱顆粒がAKIの初期に起こり、48時間後ではなく、AKI誘導時の肥満細胞の枯渇が、腎機能、萎縮、および線維症に長期的な有益な効果をもたらすことを示しました。53Tong et alは、再灌流前に実施されたクロモリン安定化肥満細胞手順で同様の結論に達しました54。Summersは、肥満細胞欠損マウス（KitW-sh / W-sh）は、野生型よりも虚血性損傷が少ないことを示しています。彼らは、白血球化学誘引物質のレベルの低下を詳しく説明しています。55
マスト細胞はプロテアーゼ活性化受容体を発現マスト細胞はプロテアーゼ活性化受容体（PAR）を発現し、トロンビンによって活性化されて、あらかじめ形成されたケモカイン、サイトカイン、および生物活性脂質のホストを脱顆粒および放出します。 PAR - 1相互作用を介したタンパク質（例、フィブロネクチン）およびインターロイキン発現（例、IL -6）。59トロンビン阻害後、PGD2はアレルギー型反応でマスト細胞から分泌される主要な生物活性エイコサノイドであるため、マスト細胞の相対的な枯渇と一致するPGD2のレベルの低下が観察されました60。さらに、ICAMのダウンレギュレーション-1および抗トロンビンナノ粒子処理後のVCAM-1は、LFA -1とVLAを発現し、接着分子を利用して組織に侵入するため、肥満細胞浸潤の減少と一致しています。29,30
これまで、腎IRIの進化におけるPGD2自体の特定の病原性の役割は、私たちの知る限りでは説明されていませんが、肥満細胞活性化の明確なバイオマーカーとして機能します。52肺の炎症では、PDG2はその受容体（DP1およびDP2）を介してマクロファージ炎症性サイトカインの発現を増強し、好中球の流入を活性化することが示されています61。マスト細胞抑制を介してPPACKPFCNPによってダウンレギュレートされるものは、そのような推定メカニズムと一致します。 しかし、肥満細胞は腎機能に有害な可能性のある多くの因子を放出することが知られているため51,52、トロンビン阻害剤または他の分子標的薬による制御のために、いくつもの責任ある決定因子が将来の研究の対象となる可能性があります。 したがって、初期の肥満細胞の誘引と脱顆粒を遅らせる介入は、現在のデータの局所トロンビン阻害によって明らかにされるように、血管の完全性と腎機能を高度に保護する可能性があります。
制限事項
AKIモデルはIRIおよび関連するメカニズムに対する早期の保護に焦点を合わせているため、これらの研究はトロンビン阻害の持続的な利点を解明するようには設計されていません。 アンチトロンビンナノ粒子の単回投与の長期的な利益が慢性腎臓病への進行を制限するかどうかは、現在の報告の範囲を超えており、異なる実験モデルと仮説が必要になります。 さらに、AKIの伸長期にトロンビンを阻害することによって機能回復を達成する機会の時間的ウィンドウは、ここでは扱われていませんが、将来の研究の対象となります。 AKIにおける局所トロンビン阻害の主な有益な効果がマスト細胞活性化の抑制にどの程度起因するかは推測のままですが、その後の詳細な機構研究で検証可能です。 ただし、肥満細胞数、CD31、およびBUN間の有意な線形相関は、必ずしも原因と結果を確立するわけではありませんが、それらの一致は、腎臓IRIの初期段階における肥満細胞と血管損傷の間の強い関係をサポートします。 最後に、アンチトロンビン部分としてのPPACKの使用は、トロンビンシグナル伝達を抑制するためにナノ構造上で安全かつ局所的に送達できる共役可能な治療成分の一例にすぎません。
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