スペクトル効果相関解析とネットワーク薬理学に基づくカンカの有効成分スクリーニングの新たな戦略Ⅱ
Feb 13, 2023
3。結果と考察
3.1. HPLCフィンガープリント
3.1.1. メソッドの検証
HPLC メソッドの検証では、メソッドの精度、再現性、および安定性の相対標準偏差 (RSD) が、相対ピーク面積 (n = 11) および 0.77 パーセントで 2.85% 未満であることが示されました。相対保持時間 (n = 11)。 同じサンプル ソリューションの精度は、0.05–{{10}}.77 パーセントの相対時間と 0.28– の範囲内に現れました。共通ピークの相対面積の 2.70 パーセント。 実験の再現性は、相対時間で 0.03–0.20%、共通ピークの相対面積で 0.23–2.59% の範囲内でした。 サンプルの安定性は、相対保持時間で 0.09 ～ 0.24%、共通ピークの相対面積で 0.75 ～ 2.85% でした。 これらの結果は、確立されたフィンガープリントが満たされていることを示しています。 ゲニポシド酸の線形関係、エキナコシド, アクテオシド, ツブロシドA、 とイソアクテオシド表S4に示します。 R 二乗の値は 1.0000 で、良好な直線性を示しています。 サンプル回収の結果、ゲニポシジン酸、エキナコシド、アクテオシド, ツブロシドA、 とイソアクテオシド100.37%、103.59%、98.46%、100.81%、101.19% であり、サンプル回収率の RSD は 2.68% 未満でした。
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3.1.2. ピーク面積 (PA) と相対保持時間 (RRT)
C. tubeulosa の 11 バッチからの HM、WE、および HR のリファレンス フィンガープリントとフィンガープリントを図 2 に示します。良好な分離と分解能を示した 11 個のピークが、HM、WE、および HR の間で共通のピークとして識別されました。 5 つの標準化合物は、ゲニポシジン酸 (A2) として同定されました。エキナコシド(A8),アクテオシド (A9), ツブロシドA (A10)、およびイソアクテオシド（A11）。 標準コンパウンド、エキナコシドすべてのクロマトグラム (平均保持時間 12.86 分) に存在し、適切なピーク面積と良好な安定性を備えた を参照ピークとして選択し、他の 10 個の相対保持時間 (RRT) を計算するために使用しました。共通ピーク。 これらの異なる形態の RRT は、0.16 ～ 1.51 の範囲にあります。 これらの一般的なピークの PA と変動係数 (CV パーセント ) を表 S5 ～ S7 に示します。 データから、さまざまな形態の PA の CV パーセント値は、HM、WE、HR でそれぞれ 25.78% –142.02%、23.36% –150.38%、28.91% –112.78% です。 これらの結果は、それぞれの濃度に大きな違いがあることを明らかにしていますカンカ・ツブロサさまざまな形の複合体。 HM、WE、および HR のフィンガープリントを図 3 に示します。
図 2 標準サンプルの HPLC フィンガープリント
3.1.3. HM、WE、および HR の内容
の5つの標準成分C.ツブロサ測定されました。 主な成分の内容を表 1 に示します。HM、WE、および HR の比較を表 2 および図 4に示します。C. チューブロサの PhG は生物学的に活性ですが、熱感受性です。 水に溶ける熱に弱い成分を合理的な方法で効率よく抽出できます。 一般に、カンカ草は水で抽出され、その後、次の化学分析のために濃縮溶液に蒸発されます [26, 27, 30]. 抽出と濃縮の後、噴霧乾燥技術が使用され、手順は以前の記事から変更されました。 液体蒸気から素早く水分を除去し、植物からの原料の乾燥抽出物を得た。 このステップでは、マルトデキストリンの添加は、分散を強化し、保存時間を延長するための一般的な担体と見なされます。 一連の製造プロセスを経て、ハーブ植物は添加剤を含む処方顆粒に圧縮されました。 賦形剤を添加するこのステップは、実験には含まれていませんでした。 一般的に言えば、当社の製造プロセスには、セクション 2.2 で説明したように、処方顆粒の製造プロセスと並行して、抽出、濃縮、および噴霧乾燥が含まれます。 これらの半製品を製造するには、上記の 3 つの手順に従う必要があります。 WEを形成する手順には、濃縮と噴霧乾燥が含まれます。これにより、温度に敏感な成分が失われやすくなりますが、HMの抽出と乾燥後にHRが得られます。 活性成分が HR に残っている可能性があるのだろうか。 私たちの結果によると、ベルバスコシドの含有量は、HMからWEおよびHR（それぞれ および ）に大幅に減少しました。 ベルバスコシドの熱安定性は、加熱プロセス中の HPLC によるピーク面積の変化を監視することによって調査されます。 4 時間加熱すると、41.6% のベルバスコシドが残ります。 これは、ベルバスコシドが熱感受性であることを示しています [31]。 WE 中のイソアクテオシド、チューブロシド A、およびエキナコシドは、複雑な処理手順の後も安定したままでした。 長期の乾燥プロセス中に、PhG の蓄積が大幅に減少しました。これは、これらの感熱性成分の熱分解に起因する可能性があります [32]。 他のターゲット コンポーネントに関しては、ベルバスコシドを除いて、HR と WE に大きな違いはありませんでした。 この違いを理解することで、将来的にハーブかすのより良い品質基準を開発し、それらを製品に進めることができます。
表 1 C. tubeulosa の 11 バッチの内容
表 2 主なコンポーネントの内容の比較 (n = 11)。
,
図 4 異なる形態の 5 つの成分の含有量測定 (n = 11)。 、ns: 重要ではありません。
3.1.4. 指紋類似性分析
3 つの C. tubeulosa グループ間の類似性を評価しました。 生薬-水抽出物、生薬-生薬残渣、水抽出物-生薬残渣の類似値は、0.943–0.994、0.847–{の範囲でした。 {9}}.995、0.938–1.000、それぞれ (表 3)。
表 3 C. チューブロサの 11 バッチの HM-WE、HM-HR、および WE-HR の類似性。
3.2. 抗酸化活性試験結果
C. tubeulosa のさまざまな形態の抗酸化活性は、DPPH、および除去能力アッセイを使用して決定され、関連する結果を図 5 に示します。表 S8 では、DPPH および除去能力アッセイの結果の範囲は { {2}}.04–37.80、0.98–843.90、および 0.32–27.65 mg/mL で、C. tubeulosa の 11 バッチ中の 3 つの異なるフォーム。 3 つの抗酸化活性テストでは、HM と WE は密接な阻害活性を示しましたが、HR は最も弱い阻害を示しました。
噴霧乾燥されたWEは、低濃度でも有意な活性を示すことがわかりました。 以前の報告では、噴霧乾燥した Vernonia amygdalina WE が 0.17 mg/mL で 50 パーセントのスカベンジング阻害を達成したことが示されました [33]。 長い抽出時間と高温の適用は諸刃の剣です。 一方では、抽出時間と噴霧乾燥入口温度を上げると、収量と効率が向上します。 さらに、抽出物は、これらの植物よりも強力な抗酸化活性と高濃度の生物学的成分を達成します [34]。 一方、過度に高温の吸気は生物活性化合物を劣化させます。 このような上昇した吸気口温度は、抗酸化物質の Bidens pilosa 抽出物の活性の損失につながり、フェノール化合物の減少に起因していました [35]。 現在の結果は、前述のレポートと一致しています。 たとえば、S6 の WE は、HM と HR の両方よりも弱いラジカル阻害能力を示しました。 さらに、S5 の HR は、HM および WE よりも強力な DPPH およびスーパーオキシド アニオン消去能力を示しました。 PhG の構造は、グリコシド結合とアセチル基から構成されており、酵素作用によって容易に加水分解されたり、高温で分解されたりします。 これらの反応は、大規模生産中の一部の主要成分の減少を説明する可能性があります。 ただし、特定のコンポーネントの加水分解または異性化は、他のコンポーネントの合成を加速する可能性があります。 このような変換は、Cistanches ハーブを処理するときに一般的です [36–38]。 PhG が水溶性であることは、ほとんどの生物学的成分が水抽出によって利用できることを意味します。 活性成分の大部分が WE に残っているという主張は何十年もの間続いているため、抽出後に湿った残留物を廃棄できると仮定するのが妥当と思われます。 ただし、C. tubeulosa の HR を廃棄物と見なすのは正しくありません。 研究者は、PhG は不安定であり、酵素的または加水分解を受けやすいと指摘しています [39]。 処理中にフィトメディシン内の生物学的成分の減少に寄与する加水分解または異性化反応は、同時に HR を利用する新しい機会を提供する可能性があります。 従来の抽出方法を転換することで、薬用残留物を開発し、より効果的に利用することができます。 高麗人参残渣を単糖に変換するために、酵素加水分解が行われました。 砂糖、コハク酸、高麗人参多糖類、ジンセノサイドなどの多糖類とジンセノサイドの収量が増加した [40]。 Sophora flavescens の残留物は、酢酸エチルを用いた超音波によって再抽出されます [41]。 ハーブの残留物を利用するための最新の技術は、Huang らによって要約されています。 [42]。
PLSR および BCA の結果に基づいて、DPPH、スーパーオキシド アニオン、およびヒドロキシル ラジカル スカベンジング アッセイを使用して、さまざまな形態の上位 5 つのピークをスクリーニングし、最も重要なピークを特定しました。 結果をベン図に示します (図 7)。 HM、WE、およびHR は DPPH アッセイのピークを共有しません。 一方、BCAモデルは、A1、A2、A3、およびA6がHM、WE、およびHRによって共有される共通のピークであることを示しています（図7（d）〜7（f））。 特に、ベン図の重複は、BCA モデルが PLSR モデルよりも適しているように見えることを示しており、前者はより多くの繰り返しを示しています。 BCA モデル係数と抗酸化能 IC50 値は、RDA を介して分析されました。 図 8 に示す RDA のように、HM および HR の A1、A3、および A6 は抗酸化指数に正の相関がありますが、A3 はヒドロキシル ラジカル消去能力に負の相関があります。 WE の A1 および A6 は、DPPH およびスーパーオキシド アニオンと強い相関があります。 さまざまな形態から見られる A6 ピークは、DPPH、スーパーオキシド アニオン、およびヒドロキシル ラジカルとの最も強い関連性を示します。 A1 と A3 も同様の接続を示します。
図 7
PLSR および BCA モデルのベン図: (a) DPPH アッセイ。 (b) 清掃アッセイ。 (c) 捕捉アッセイは、PLSR モデルによって分析されました。 (d) DPPH アッセイ。 (e) 清掃アッセイ。 (f) スカベンジング アッセイは、BCA モデルによって分析されました。 重複するセクションは、HM、WE、および HR による共通のピーク シャードでした。
3.4。 ネットワーク薬理学に基づく分析
3.4.1. CTネットワークの構築
GeneCards データベースと OMIM データベースから、抗酸化活性に関連する合計 4359 のターゲットが取得されました。 同時に、TCMSP データベースと SwissTargetPrediction データベースから活性成分をスクリーニングしました。 次に、198 のターゲットが収集され、UniPort データベースを通じて標準化されました。 有効成分と抗酸化物質関連疾患で共有される159の標的遺伝子がありました（図S1を参照）。 CT ネットワークは、化合物と主要な遺伝子ターゲットの間の相関関係を示すために構築されました (図 9)。
図 9 CT ネットワーク。 ネットワークは、活性成分と主要な遺伝子標的との間の相関関係を示しました。
3.4.2. PPIネットワークの構築とキーターゲットのスクリーニング
PPI は、STRING データベースを使用して視覚化されました (図 10)。 ネットワークには、159 のノードと 2528 のエッジが含まれていました。 相互作用ネットワーク全体では、接続コンポーネントまたはより多くのターゲット ポイントを持つノードが、C. tubeulosa で抗酸化の役割を果たす重要なコンポーネントまたはターゲット遺伝子である可能性があります。 結果はダウンロードされ、視覚化のために Cytoscape に導入されました。 DC 値が高いほど色が濃くなり、合計スコア値が大きいほどエッジが太くなります。 RAC-α セリン/スレオニンプロテインキナーゼ (AKT1)、インタールキン-6 (IL6)、腫瘍壊死因子 (TNF)、および血管内皮増殖因子 A (VEGFA) が中心に位置することがわかりました (図 11)。活性成分が抗酸化効果を発揮したとき、それらが重要な標的であることを示しています。 エキナコシドは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ (MAPK) と AKT、およびそれらのリン酸化型の調節を介して、ミトコンドリア機能障害を軽減することが報告されています [43]。 研究者らは、C. tubeulosa のグリコシドの抗糖尿病効果は、IL-6 や TNF- などの炎症誘発性サイトカインをダウンレギュレートすることによる PhG の抗酸化活性による可能性があると推測しました [44]。 さらに、エキナコシドは、血管新生を阻害するために VEGFA の発現をダウンレギュレートすることによって卵巣癌細胞の増殖を損なう可能性があり [45]、これは ROS が VEGF シグナル伝達の発現を誘導するための ROS システムと密接に相関している [46]。
図 10 PPI ネットワーク。
3.4.3. 濃縮分析と CTP ネットワークの確立
潜在的な抗酸化化合物は、BP、CC、および MF を含む多数の生物学的機能に作用しました。 図 12(a) では、上位 10 の経路が示されています。 PPI ネットワークから予測されたターゲットは、主に、有機環状化合物、生体異物刺激、無機物質、酸素レベル、細胞成分の動きの正の調節など、多くの生物学的プロセスに応答しました。 細胞成分分析は、遺伝子が主に膜ラフト、細胞外マトリックス、分泌顆粒内腔、転写調節因子複合体、および細胞の先端部分に関連していることを示しました。 これらの標的は、DNA結合転写因子結合、タンパク質ホモ二量体化活性、タンパク質ドメイン特異的結合、サイトカイン受容体結合など、多くの分子機能にも関与しています。
図 12 濃縮分析: (a) GO 濃縮分析。 (b) KEGG 濃縮分析。
これらの主要なハブの生物学的機能を調査するために、経路濃縮分析が実施されました。 KEGG の濃縮結果から、上位 20 の経路を示すバブル ダイアグラムが作成されました。 スポットが大きいほど、より多くの遺伝子が経路に含まれていました。 図 12(b) に示すように、C. tubeulosa の重要な経路は、癌、脂質およびアテローム性動脈硬化の経路、糖尿病合併症における AGE-RAGE シグナル伝達経路、化学的発癌 - 受容体活性化、および MAPK シグナル伝達経路に関連していました。 アポトーシスと細胞のレドックス恒常性に対する C. tubeulosa の影響を調査しました。 このデータは、C. tubeulosa が抗結腸がん治療の有望な候補となり得ることを示唆しています [47]。 C. Deserticola 抽出物は、高齢者に見られます [48]。
図１３は、経路とそれらに関連する標的との間の相関関係、および重複する標的遺伝子とＣ．ｔｕｂｕｌｏｓａの生物活性成分との間の関係を示す。 12 の成分、159 のターゲット、および 20 の経路で構成される CTP ネットワークの全体像が生成されました。 ターゲットのほとんどは、候補活性化合物によって共有されました。 高い相互接続度を持つこれらの候補有効成分は、CTP ネットワーク、特にケルセチン (度 = 131) の高い相互接続性の原因でした。 AKT1、IL6、TNF、VEGFA などの標的の大部分は、がんの経路に関連する KEGG 経路にマッピングされました。
図 13 CTP ネットワーク。
4. 結論
この研究では、HM、WE、および HR 間のスペクトル効果関係を考慮する際に、主に複雑な状況を調査しました。C.ツブロサ. HPLCフィンガープリントと抗酸化アッセイの H、WE、および HR の違いを特定するために使用されました。C.ツブロサ. HPLC フィンガープリントによると、H、WE、および HR の 11 バッチ間で 11 のピークが共通していました。 ゲニポシド酸、エキナコシド, ベルバスコシド, ツブロシドA、 とイソアクテオシドこれらのピークの中で識別されました。 これら5つの成分の含有量が決定されました。 さらに、その抗酸化作用により、C.ツブロサHs、WEs、および HRs は、複雑な製造条件によって引き起こされる化学組成の変化により変化しました。 多様な統計モデルに基づいて、スペクトル効果関係研究は、ピーク A6 が 3 つの形態の中で最も決定的な成分である可能性があることを示しました。C.ツブロサ. この研究は、ネットワーク薬理学に基づいて、潜在的なメカニズムを調査しました。C.ツブロサの上抗酸化化合物のスクリーニング、キーターゲットの予測、ネットワークの構築、濃縮分析の実施を通じて、 私たちの結果は、ハーブの残留物をリサイクルするための理論的基礎と、C.ツブロサの治療において抗酸化関連疾患.
