皮膚の黒ずみは、皮膚色素メラニンの蓄積の結果として生じます。 これに対抗するために、さまざまな美白剤が市販されており、そのほとんどがメラニン合成を阻害します。 メラニンの脱色は、美白の代替方法です。 この研究では、森林土壌から分離されたファネロケテ クリソスポリウム NK-1 から精製された細胞外酵素であるリグニン ペルオキシダーゼ (LiP) が、in vitro でメラニンを効果的に分解および脱色できることを示します。 反応条件を最適化するために、pH、温度、インキュベーション時間、酵素濃度、メディエーターの添加などの脱色条件を調査しました。 結果は、pH 3、40度、15 IU/ml、および10時間のインキュベーションがメラニンの脱色に最適な条件であることを示しています。 メディエーターであるベラトリルアルコールの使用も、メラニンの脱色効果を高めるのに効果的であり、最大 92 パーセントの脱色が得られることがわかりました。 走査型電子顕微鏡の結果は、未処理のサンプルと比較して、処理されたメラニン顆粒上に空隙を示し、メラニンの分解を示しました。 メラニンの指紋領域の変化が観察されました。 たとえば、波数1500〜500cm-1の間では、1513、1464、および1139cm-1のCH2、CH3の曲がり、およびC-O-C伸縮における処理されたメラニンの新しいピークの存在は、構造変化を表しました。 2144 cm-1 の新しいピーク (アルキニル C≡C ストレッチ) も脱色メラニンで検出されました。 細胞毒性研究では、処理されたメラニンと LiP の細胞毒性効果が低いことが示されました。 しかし、ベラトリルアルコールのメディエーターは高い死亡率をもたらす可能性があるため、健康製品やスキンケア製品を配合する際にはその使用を注意深くテストする必要があることが示唆されています。 研究結果は、Phanerochaete chrysosporium によって生成される LiP が医療および化粧品産業、特にバイオベースの化粧品美白剤の開発で使用される可能性があることを示唆しています。

関連する研究によると、カンサスは「寿命を延ばす奇跡のハーブ」として知られる一般的なハーブです。 主成分はシスタノシドで、抗酸化作用、抗炎症作用、免疫機能促進作用などさまざまな作用があります。 シスタンケと美白のメカニズムは、シスタンケ配糖体の抗酸化作用にあります。 人間の皮膚のメラニンはチロシナーゼによるチロシンの酸化によって生成されますが、その酸化反応には酸素の関与が必要となるため、体内の酸素フリーラジカルはメラニン生成に影響を与える重要な因子となります。 シスタンケには抗酸化物質であるシスタノシドが含まれており、体内のフリーラジカルの生成を減らし、メラニンの生成を抑制します。

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メラニンは、メラノサイト 1、2 と呼ばれる特殊な皮膚細胞によって生成される、複雑で難治性の広範な多環式生体高分子皮膚色素のグループです。 その主な機能は、皮膚細胞の DNA の周囲に核上キャップを形成することによって、太陽光の有害な紫外線から皮膚を保護することです 3。さらに、細胞質内のさまざまなフリーラジカルを吸収することによって、皮膚の色を変える役割もあります。 天然資源から得られるこれらの美白剤のほとんどは、チロシナーゼ酵素の阻害、色素生合成の抑制、およびいくつかの代替経路を通じて皮膚細胞でのメラニン生成を阻害します。 ハイドロキノン、ハイドロキノンのモノベンジルエーテル、水銀、コルチコステロイド、アルブチンなどのさまざまな化合物が美白化粧品の市販製剤に使用されていますが、それらの用途には重大な副作用が伴います。 たとえば、水銀は腎臓に損傷を引き起こすと報告されており、鉛は不安、うつ病、精神病を引き起こすと報告されています 4,5。 コルチコステロイドの使用は、クッシング症候群、糖尿病、高血圧、副腎不全、免疫抑制、皮膚菲薄化、座瘡、皮膚炎、多毛症を引き起こす可能性があります 6。 (2009) は、美白化粧品におけるアルブチンの使用は 3% までの濃度では効果的でしたが、濃度がさらに上昇すると細胞毒性効果が生じると報告しました。 これらの限界を考慮すると、これらの阻害剤を美白化粧品に使用することは、保健安全当局から広く批判されています。 美白化粧品は、年間成長率 4.9% で、2021 年までに最大 1,554 億 4,000 万米ドルに達する可能性があると提案されています。 世界中で安全で自然な美白剤に対する需要が高まっているため、酵素によるメラニンの脱コロニー化は大きな関心を集めています 7-9。

ラッカーゼ、マンガン ペルオキシダーゼ、リグニン ペルオキシダーゼ (LiP) などの微生物の細胞外酵素は、メラニンの脱色について以前にテストされており、有毒化学物質 1 に代わる環境に優しい代替品となる可能性があると考えられています。その中でも、LiP は脱色に非常に効果的であることが判明しました。他の関連酵素よりもベラトリルアルコール (VA) を酸化する酸化還元電位が高いため、メラニンの生成を抑制します。 高い酸化電位とメラニンの効率的な触媒作用にもかかわらず、生産量の増加と精製の難しさが、皮膚美白剤におけるLiPの商業的応用に対する大きな制限となっています。 さらに、LiP は過剰な過酸化水素下でメラニンの脱コロニー化に対する酵素活性を失いますが、これはメラニンの酸化にとって重要であると考えられています。 H2O2 はその重要な役割に加えて、LiP を不活性化し、酵素の触媒性能を低下させます。

結果

Phanerochaete chrysosporium NK-1 によるメラニンの脱色。真菌株のメラニン脱色についてテストしました。 真菌を、メラニンおよびLiP誘導剤としてVAを含む固体培地にスポット接種した。 図 1 に示すように、7 日間のインキュベーション後、Phanerochaete chrysosporium NK-1 はメラニンを脱色する能力を示しました。

最適なメラニン脱色のための条件。pH。 精製された酵素は、インビトロでの合成メラニンの脱色に使用されました。 メラニンの脱色に対するさまざまな条件の影響が観察されました 10。 まず、LiP によるメラニン脱色に対する pH の影響を調べました。 このため、メラニン脱色は、VAの存在下および非存在下で、温度30度、2.{4}}から6.0まで変化するさまざまなpH条件で、6時間のインキュベーション期間にわたって実行されました。 図 2 の結果は、一般に、VA の存在下でメラニンの脱色がすべての pH 条件でより高かったことを示しています。 特にpHが高い場合に顕著になります。 VA はカチオンラジカルの形成を助けることができます 11. これらのラジカルは、メラニンの C-C 結合を非特異的に攻撃し、脱色を引き起こすはるかに高い酸化還元電位を持っています 12. VA の存在下では、88 パーセントという最高のメラニン脱色が達成されましたpH 3では、次にpH 2で71パーセントが観察されましたが、pH 6では39パーセントの最低のメラニン脱色が観察されました。VAの非存在下では、最高の86パーセントのメラニン脱色がpH 3で観察されましたが、最低はpH 3で観察されました。 pH 5 および 6 では、それぞれ 35 パーセントおよび 36 パーセントのメラニン脱色が観察されました。 この研究におけるLiPによるメラニン脱色は、より低いpH条件、すなわち2および3で非常に効率的であったが(図2)、他の研究では4 1が最適なpH条件であることが示されている。

温度。 LiP によるメラニン脱色を、VA の存在下および非存在下で 20 ～ 60 度の範囲のさまざまな温度で、6 時間のインキュベーション期間で研究しました。 VA が存在しない場合、温度 20 度および 30 度で同様の割合 (19 パーセント) のメラニン脱色が観察されました (図 3)。 VAの非存在下での最高および最低のメラニン脱色は、それぞれ40度および50度で観察されました。 しかし、溶液中に VA を添加すると、メラニンの脱色は 20 度から 40 度まで増加し、60 度まで減少しました。 VA の存在下では、40 度でメラニンの脱色が最も高く、約 60 パーセントになります。 実験は穏やかな pH 条件で行われたため、脱色は一般に低くなります。

LiP濃度。 酵素濃度を変化させてメラニンの脱色も調べました。 図 4 に示すように、5 つの異なる濃度、つまり 5、10、15、20、および 25 IU/mL の LiP について、VA の存在下および非存在下でのメラニン脱色について調べました。驚くべきことに、最も効果的な酵素濃度は 15 IU/mL でした。 VAありとVAなしの両方の溶液のIU/ml。 6 時間のインキュベーション期間後、酵素濃度 15 IU/mL を使用した場合、最も高いメラニン脱色は VA の存在下で 92 パーセント、メディエーターの非存在下で 70 パーセントでしたが、最も低いメラニン脱色は 23 パーセントでした。 5 IU/mL の LiP を使用して VA が存在しないこと。 高濃度の酵素濃度、つまり 20 および 25 IU/ml では脱色効果が低下するかどうかは不明です (図 4)。

潜伏時間。 脱色実験は、2、4、6、8、および 10 時間のインキュベーションで実行されました。 これらの反応は、VAの存在下および非存在下でも実行されました。 結果は、予想どおり、脱色効果がインキュベーション時間と正の相関があることを示しました (図 5)。 非局在化の程度の増加は、最初のインキュベーションでより顕著でした。 最も高いメラニン脱色（68パーセント）は、VAの存在下で10時間のインキュベーション期間後に観察され、VAの非存在下では59パーセントでした。 メラニンの脱色は、VA なしで 2 時間インキュベートした後では 15 パーセントと低かった。 したがって、テスト結果に基づいて、最適な条件は pH 3、40 度、15 IU/ml、および 10 時間のインキュベーションであると結論付けました。

SEM (走査型電子顕微鏡) および FTIR (フーリエ変換赤外分光法) 分析。メラニンの形態学的変化と構造的変化は、それぞれ SEM と FTIR によって特徴付けられました。 脱色されたメラニンを SEM で分析し、表面の変化を形態学的に観察しました。 酵素処理を行わない合成メラニンを対照として使用した。 図6に示すように、未処理のサンプルと比較して、処理したメラニン顆粒には空隙があり、メラニン粒子が酵素によって攻撃されたことを示唆しています。

脱色メラニンも、未処理メラニンを対照としてFTIRで分析しました（図7）。 脱色メラニンと未処理メラニンの両方の分子フィンガープリントが取得され、処理メラニンの構造変化を確認するために比較されました 13。 メラニン (C18H10N2O4) の FTIR スペクトルは、3272 cm-1 での広い吸収スペクトルを示しました。これは、特性 O に起因すると考えられます。カルボン酸およびフェノール基の –H 伸縮振動または N–H 伸縮振動。 処理されたメラニンの FTIR スペクトルの変化は顕著でした。 波数 3000 ～ 3500 cm-1 の広帯域は、対照サンプルと処理サンプルの両方に -NH 基と -OH 基が存在することを示します。 ただし、処理サンプルの強度は対照サンプルよりも大幅に高く、処理により酵素攻撃によって構造にこれらの官能基が追加されたことが示唆されます。 2884.4 cm-1 および 2822 cm-1 のピークは、対照ではアルキル基が存在することを示しましたが、脱色メラニンでは波数 2884.4 cm-1 のピークは存在しませんでした。 2822 cm-1 のピークは波長 2835.92 cm-1 に逸脱し、この領域の処理されたメラニンの構造変化も表しています。 対照における波数１７１０ｃｍ−１のピークは、カルボン酸の存在によるものであった。 このピークも脱色メラニンでは存在しないか大幅に減少しており、処理されたメラニンの構造変化が再度確認されました。 指紋領域にもいくつかの変化がありました。 たとえば、波数 1500 ～ 500 cm-1 の間では、1513、1464、および 1139 cm-1 での処理されたメラニンの新しいピークの存在は、構造変化を表しています。 2144 cm-1 の新しいピークも脱色メラニンで検出されました。

細胞毒性効果。分解されたメラニンと LiP の細胞毒性は、ブラインシュリンプ細胞毒性法 14,15 を使用して調査されました。 本研究では、処理されたメラニンおよびLiPの細胞毒性効果は低く、エビの幼生生存率は90パーセント以上でした（表1）。 LiP 濃度の増加は、80 ul/mL (約 80 IU/ml) まではエビ幼生の生存率に影響を与えず、細胞毒性活性が低いことを示唆しています。 VA を含む陽性対照では死亡率は 100% であり、医療および美容分野でメディエーターとして VA の存在下で LiP を適用する際には注意が必要であることが示唆されています。

議論

温度の場合、真菌の増殖と酵素の生産が最も高くなるのは 40 度であり、これは P. クリソスポリウムの自然の生息地に相当します。 LiP のメラニン分解能力は、メラニンとリグニン 18 の構造的類似性に基づいています。LiP による in vitro でのメラニン分解の有効性は、pH、温度、酵素濃度、インキュベーション時間などのいくつかの要因とも相関しています。 VAの存在として。 図 8 に示すように、LiP は VA をそのカチオンラジカル (VA∙ plus ) に酸化し、メラニンをさらに脱色する酸化還元メディエーターとして機能します。

H2O2 は、メラニン脱色中の最終的な電子受容体として必須の基質です。 LiP は過剰濃度になると容易に不活性化され、ヘム構造の破壊や不活性化合物 III の形成が誘発されます。 この阻害効果は、VA が VA カチオン ラジカルに酸化されることによって抑制されることが報告されています 1。 LiP は VA を VA カチオンラジカルに酸化し、メラニンを脱色する酸化還元メディエーターとして機能します。 VAは白色腐朽菌から生成される天然化合物であり、副作用が少ないと期待されています。 しかし、メディエーター VA の存在により、処理されたメラニンおよび LiP の低い細胞毒性効果と比較して、試験された微生物の死亡率が高くなりました。 健康製品やスキンケア製品の配合においては、慎重にテストする必要があります。

材料および方法

真菌株の分離と同定。木材の廃棄場として長期間使用されていた汚染現場から菌類の分離を行った。 サンプルは滅菌ボトルに採取され、精製のために研究室に移されました。 精製はシーボードデキストロース寒天培地上で行った。 4 つの異なる真菌コロニーがサンプルから単離および精製されました。 最良の株のスクリーニングは、無機塩培地 (MSM) 中の唯一の炭素源としてメラニンの存在下でのメラニンの脱色とバイオマス生成に基づいて行われました。 スクリーニングに基づいて、ユニバーサルプライマーITS-1およびITS-4 10を使用して5.8S rRNAおよび18S rRNAのDNAを配列決定することによって、選択された微生物を同定した。 それらのゲノム DNA は Anderson らの方法に従って抽出されました。 19. 精製後、PCR 産物の配列決定を行いました。 NCBI の BLAST ツールを使用して配列をアラインメントし、分子進化遺伝学解析 (MEGA) を使用してホモログの系統解析を行いました。 最尤性に基づいて、分離された真菌株を同定するために隣接結合ツリーが構築されました。 配列は、アクセッション番号 KX064682.1 で NCBI GenBank に提出されました。 系統解析により、分離株 KX064682.1 が Phanerochaete chrysosporium NK-1 の株であることが明らかになりました。

メラニン脱色のためのプレートアッセイ。白色腐朽菌である Phanerochaete chrysosporium NK-1 は、メラニンの脱色に使用されました。 Phanerochaete chrysosporium は LiP を生成することが知られています。 すべてのメラニン脱色実験では、合成メラニン (B049-97-6) がモデル メラニンとして使用されました。 LiP誘導剤としてVA 2 を含む改変培地を使用して、真菌のメラニン脱色能力を試験した。 Phanerochaete chrysosporium NK-1の培養にはペトリ皿を使用しました。 培地は、10 gのグルコース、2 gの麦芽抽出物、4 gのMgSO4・7H2O、1 gのKH2PO4、0・01 gのFeSO4、 0.005 gのZnSO4、0.2 gの合成メラニン、および15 gの寒天を1-Lの蒸留水に溶かしたもの。 接種したペトリプレートを室温、暗所でインキュベートした。 真菌のコロニーの下および周囲のメラニンがどの程度脱色したかを観察した。 この真菌はメラニンを脱色することができ、さらに酵素溶液の調製にも使用されることが判明しました。

メラニン脱色酵素の調製。培養液の液体培地には、10 gのグルコース、0.2 gの酵母エキス、0.07 gのVA、3.{{13 }} gの酒石酸、1 gのトゥイーン80、0.2 gのKH2PO4、0.146 gのCaCl2・2H2O、0.157 g K2HPO4、0.05 gのMgSO4・7H2O、42.5 mgのZnSO4・7H2O、7.0 mgのCoCl2・6H2O、7.0 mgの蒸留水２０１リットル当たり、ＣｕＣｌ ２ ・２Ｈ ２ Ｏ、０．５４ｍｇのＦｅＣｌ ３ 、０．９ｍｇのＮａＣｌおよび０．２ｍｇの合成メラニン。ＮａＯＨおよびＨＣｌ溶液を用いて媒体のｐＨを４．０に調整した。 １００ｍｌの培養培地のアリコートを含む２５０ｍｌのフラスコをオートクレーブにかけ、５ｍｌの接種材料を接種した。 次いで、フラスコを回転振盪機上で３０度で１５日間インキュベートした。 LiP 活性アッセイのために 24 時間間隔で重複サンプルを収集しました。

酵素アッセイ。LiP アッセイ用の試薬には、250 mM 酒石酸ナトリウム緩衝液 pH 5.5、10 mM VA、および 4 mM H2O2 (30 パーセント) が含まれていました。 酵素アッセイはシリカキュベットで実行され、吸光度は紫外可視分光光度計（島津製作所、京都、日本）によって 310 nm で測定されました。 吸光度は周囲条件下で 0 ～ 30 秒の時点で監視されました。 酵素の活性は、ビールの法則、方程式に従って計算されました。 (1) 21．

ここで、c は減衰種の濃度です。 A は光吸収率です。 ε はモル減衰係数です。 dは光路の長さです。 酵素活性の測定には、時間の経過に伴う濃度変化の測定が含まれます (式 1)。 (2)。

in vitro での LiP の産生強化とメラニンの脱色のための最適化。基質としてメラニンを使用した Phanerochaete chrysosporium NK-1 からの LiP の生産増強のための最適化は、Placket Burman 設計を使用して実行されました。 完全長のプラケットは、直線的な傾向のみを考慮するのに対し、異なる変数間の相互作用効果を損なうという事実に基づいています。 (3) 22．

ここで、Y は応答を表し、記号は回帰係数を示し、k は調査された因子の数です。 培地中に存在するメラニンを脱色するために、Phanerochaete chrysosporium NK-1 からの LiP の最高濃度を達成するために、合計 9 つの要因が研究されました。 表 2 に示すように、Placket-Burman 計画は合計 12 回の実験実行で構築されました。実験は合計 35 日間実施され、応答が測定されました (LiP 活性 IU/mL)。 実験データは統計ソフト「Design Expert 9」を用いて解析した。 最適化された培地は、LiP の生産を強化するために使用され、アンモニウム沈殿によって精製されました。

酵素の生産と精製の最適化。浸漬培地を使用して、LiP 活性の観点から最適なインキュベーション時間を決定しました。 補足図1に示すように、培養液は8日目に最大の酵素活性を示し、140 IU/mlでした。 したがって、酵素溶液の生成には 8 日間のインキュベーション時間が使用されました。

LiP 活動に影響を与える要因 (9) を決定するために、合計 12 回の実験が実施されました。 補足図 2 に示すように、テストの中で、LiP 活性の応答値は 171 IU/ml から 576 IU/ml の範囲です。最も高い LiP 活性を示した実行は、実行 3 (576 IU/ml) に続いて実行されました。 10 (547 IU/ml)。 回帰分析によると、温度、時間、グルコース濃度、基質濃度、およびメディエーターが LiP 活性にプラスの影響を及ぼします。 酵母エキスの影響は無視できることが判明しました。 他の要因はマイナスの影響を及ぼします。 LiP 生成の最適条件は、時間: 35 日、温度: 40 度、グルコース (1 リットルあたり): 20 g、フルクトース: 10 g、酵母エキス: 2 g、ペプトン: 2 g、接種材料: 10 ml、基質メディエーター: 0.1ml。 これらの条件は、アンモニウム沈殿およびゲルクロマトグラフィー (セファデックス G-75) 法によって精製された LiP の生産を強化するために使用されました。

最適化された pH、温度、インキュベーション時間での酵素抽出が行われました。 Sephadex G75 ゲル濾過カラムを使用して、製造業者の指示に従って密度勾配に関して細胞溶解物からタンパク質含有量の画分を分離した。 粗抽出物中のタンパク質の豊富さは、ドデシル ポリアクリルアミド ナトリウム ゲル (SDS-PAGE) 分析で現れたバンドの数によっても示されました。 精製酵素の分子量は、SDS-PAGE分析から計算すると46.0 kDaでした（補足図3）。 アンモニウム沈殿およびゲルクロマトグラフィーによる精製後の酵素活性は、それぞれ 684.0 および 957.6 IU/ml でした。

精製された酵素は、pH、温度、インキュベーション時間、酵素濃度などのさまざまな物理化学的条件でメラニンの脱色に使用されました。 合成メラニン (B049-97-6) は、23 に従ってすべてのメラニン脱色実験でモデル メラニンとして使用されました。

脱色実験。メラニン脱色に対する pH の影響。 LiP によるメラニンの脱色に対する pH の影響を観察するために、メラニン脱色反応を 2.0～6.{3}} の範囲の pH で実行しました。 反応混合物には、TE 緩衝液に溶解した粗酵素 10 μl と 0.02% w/v のメラニン 1990 μl が含まれていました。 これらの反応は、VAの存在下および非存在下の両方で実行されました。 反応混合物を３０度の温度で６時間インキュベートした。 対照実験は、活性 LiP を 95 度で煮沸した変性酵素に置き換えることによって並行して実行されました。 インキュベーションの前後に、分光光度計を用いて波長540nmで反応混合物のメラニン脱色をモニタリングした。 酵素の脱色効率はパーセント (パーセント) で表されました。 メラニンの脱色は式(1)によって計算されました。 (4) 11．

メラニン脱色に対するインキュベーション時間の影響。 インキュベーション時間を最適化するために、メラニン脱色反応は 2 ～ 10 時間のインキュベーション時間で実行されました。 反応混合物は、VAの存在下および非存在下で、緩衝液に溶解した粗酵素10μlおよび0.02パーセントw/vのメラニン1990μlをpH4で含有した。 次いで、反応混合物を３０度の温度でインキュベートし、メラニン脱色率を求めた。

分解されたメラニンの SEM 分析。 メラニンの表面形態学的変化は、走査型電子顕微鏡 (JEOL JSM-5910、米国マサチューセッツ州ピーボディ) 24 によって分析されました。未処理のメラニンを対照として使用しました。 サンプルを乾燥させ、両面カーボンテープ（両面粘着）を使用して銅製のスタブ（10×10mm2）に固定しました。 スタブを洗剤で洗浄し、サンプルを固定する前にヒートガン乾燥機 (KADA 85U/SMD) で 200 度で 2 分間乾燥させました。 電子ビームの伝導を確保するために、銀ペースト伝導 (SPI-CHEM、ペンシルバニア州ウェストチェスター) を使用しました。 高電圧（25 mA電流で50秒間）および真空（10-2 ATM）条件で生成されたプラズマを使用して、金をサンプル上に堆積させました。 サンプルの表面形態を倍率 3000 で検査しました。

脱色メラニンのFTIR分析。最適化実験で最も高いメラニン脱色を示した反応またはサンプルを、FTIR (モデル No 56、ドイツ、マーリン) 分光法でさらに分析しました。 FTIR 分析 20 の準備ステップとして、サンプルを遠心分離し (10,000 rpm で 1 分間)、風乾しました。 メラニンサンプルの定性分析は、UV-Vis 近赤外​​ (NIR) 分光計を使用して実行されました。ラムダ 900/パーキン エルマー インスツルメンツ。 スペクトルは 1000 ～ 3500 cm-1 の範囲で記録されました。 サンプルは、粉末分散液を含むKBrペレットで調製されました。 この分析では、未処理の合成メラニンを対照として使用しました。

分解されたメラニンおよびLiPの細胞毒性。分解されたメラニンの細胞毒性を確認するために、ブラインシュリンプの致死試験が実施されました 14,15。 ブラインシュリンプの卵は、人工海水を入れた長方形の皿の中で孵化させた。 皿には小さな穴のあるプラスチック製の仕切りが含まれており、皿を 2 つの不等な区画に分割していました。 大きい方の区画では卵に斑点があり、光の侵入を避けるために覆われ、一方、小さい方の区画ではその上にあるランプで照明が当てられました。 孵化した幼虫は光によって小さな区画に引き寄せられました。 48 時間のインキュベーション後、低温殺菌ピペットを使用して、成熟したノープリウスを照明付きコンパートメントから収集しました。

統計分析。実験データは統計ソフト「Design Expert 9」を用いて解析した。 グラフィック画像は、計算された標準偏差を使用した 3 つの実験試行を使用して描画されました。 実験実行の統計的有意性は、ANOVA によって計算されました。

データの可用性

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